堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

このフォールイング実験の全体的な目的は、機械的な破砕を用いて、ベクターフリーの高分子を標的細胞に導入することである。まず、標的となる細胞種を目的の導入物質とともに懸濁させ、特別に設計されたマイクロ流体デバイスのリザーバーに充填する。次に、マイクロ流体デバイスを加圧し、細胞をマイクロ流体チャネルの配列に通過させることで細胞を圧搾し、一過性の膜破砕を促進させる。

次に、物質が細胞質内へ拡散輸送されるように、標的配送物質存在下で細胞をインキュベートします。これにより細胞膜が修復されます。フローサイトメトリーを用いて、高分子物質が効果的に配送された結果が得られます。

この手法の既存の手法（エレクトロポレーションやリポフェクションなど）に対する主な利点は、他の手法では効果的に導入できない困難な細胞型や物質に対処できる点にあります。本手法は、細胞リプログラミングをどのように改善するかといった、生物学分野における重要な問いに答えることができます。また、本システムは免疫細胞を操作して抗腫瘍効果を高めることができるため、この技術の意義はがんの治療や診断にまで及びます。

まず、本ビデオに示し、付属のテキストプロトコルに詳細を記載しているマイクロ流体デバイス、デバイスホルダー、プラスチック製液体リザーバー、およびOリングを作製または購入し、3つの密閉容器に70% ethanolを半分まで満たします。1つ目の容器にデバイスを、2つ目の容器にリザーバーとOリングを、3つ目の容器にホルダーを入れます。その後、容器の残りの部分を70% ethanolで満たします。

次に、リザーバーとOリングが入った容器と、ホルダーが入った容器を、使用前に超音波洗浄機で5〜10分間洗浄します。これにより、前回の実験による汚染粒子を除去できます。コンポーネントをソニケーションしている間に、バイオセーフティキャビネット内の作業スペースを70%エタノールで拭き上げてください。その後、3つの容器とピンセット1組を含む必要なすべての資材を70%エタノールで拭いて滅菌し、組み立てを開始するためにバイオセーフティキャビネット内に配置します。

まず、作業領域に低リンターワイプを2～3枚敷きます。次に、ピンセットでエタノール容器からプラスチックリザーバーを取り出し、内表面からエタノールが毛細管現象で吸収され、蒸発しやすくなるようにワイプの上に置きます。リザーバーを軽く叩き、エタノール溶液の除去を促進させます。

必要に応じて、加圧ガスを用いてリザーバー内を完全にパージします。リザーバーが乾燥したら、リザーバーの適切なスロットにOリングを挿入します。次に、ピンセットを使用して、チップをデバイスホルダーに上面を上にして配置します。

チップがホルダーに平らに置かれていることを確認し、必要に応じてピンセットで調整してください。デバイスがホルダーに適切に収まっていない場合、以降の工程で破損するリスクがあります。次に、リザーバーをホルダー上にゆっくりと配置し、クリップに合わせて調整します。

Oリングがスロットから脱落しないように注意してください。この工程では、リザーバーがカチッと音がして固定されるまで、ゆっくりと押し下げます。リザーバーの両側がしっかりと固定され、チップが正しい位置にあることを確認してください。

リザーバーを過剰な力で押し下げないでください。圧力がかかると、初代細胞用または接着性細胞株用のチップが破損する恐あります。細胞は、コンフルエント率が80%以下になるよう、実験の1～2日前に播種してください。

実験当日。実験の直前に細胞を回収し、培地または任意のバッファーを用いて、10⁶～10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁します。その後、細胞の凝集塊やマトリックスによってデバイスが詰まるのを防ぐため、細胞懸濁液を40 µmのセルストレーナーメッシュに注意深く通します。

ろ過後、別のチューブ内で、細胞懸濁液300 µLと目的の濃度のデリバリー材料を混合した。本デモンストレーションでは、細胞懸濁液50 µLあたり、5 mg/mLのデキストリン2 µLおよびAlexa 488アイソタイプコントロール抗体2 µLを添加した。

次に、ピペッティングにより100 µLの細胞を穏やかに混合します。その後、ゲルロードチップを使用して、細胞とデリバリー材料をいずれか一方のリザーバーにピペッティングします。充填したリザーバーに圧力チューブを取り付け、適切に密閉されるように結び目を指で締め付けます。次に、レギュレーターで空気圧を70 PSIに調整し、デバイス内を細胞が移動する速度を制御します。

圧力は、各実験で使用する特定の細胞とマイクロ流体チップの組み合わせに合わせて最適化してください。すべての準備が整ったら、デバイスを目線の高さまで上げ、リザーバー内の液体が容易に見えるように向きを調整します。次に、プッシュボタンバルブを押してリザーバーを加圧し、細胞の流れを開始させます。

リザーバーから流出する液体の速度を確認してください。流速が初期の状態に比べて大幅に低下している場合、装着したデバイスが詰まっている可能性が高いため、交換が必要です。閉塞によって剪断力が増大すると、通常よりも多くの細胞死が引き起こされます。

液面がリザーバーの底から約2mmまで下がったら、速やかにレギュレーターを0 PSIに回して流量を停止させます。リザーバーが空になる前に空気の流れを止めることが重要であり、そうしないとサンプルが回収リザーバーから排出される恐れがあります。その後、流出リザーバーから処理済みの細胞を回収し、マイクロ遠心チューブに入れます。

室温において、処理済みの細胞は最大10分間物質の取り込みを続けます。10分後、細胞をさらに培地と共にプレートに播種するか、実験の必要に応じて細胞の使用を継続してください。これらの手順を繰り返し、必要な数だけ処理済み細胞を回収します。チップが詰まった場合は適宜交換し、以降のサンプルごとに詰まったデバイスを廃棄してください。

目詰まりの影響を最小限に抑えるため、流れの方向を変更します。細胞の回収が完了したら、クリップアームを押し下げて、リザーバーをメインホルダーからゆっくりと取り外します。その後、再利用する各パーツを適切な保管容器に入れ、新鮮な70%ethanolを満たしてください。

最後に、使用したチップをすべて別の容器に入れ、適切に廃棄します。HeLa細胞の導入効率と細胞生存率を測定しました。一連の実験の結果、3種類のマイクロ流体チップを用い、最大600 millimeters per secondまでの範囲の速度で試験を行いました。

これらの試験により、テストしたすべてのチップにおいて、流速を上げることで、3 kDaの蛍光標識デキストリンの細胞内への導入効率が向上することが示されました。さらに、流速を上げたことで、テストしたデバイスにおける細胞生存率が約20%低下しました。この程度の細胞死は比較的低く、不適切に設計されたデバイスでは、しばしばこれよりもはるかに高い数値となります。

左側に示されているコントロール細胞群へのPacific blue共役デキストリンの取り込みは、限定的な表面結合とエンドサイトーシス効果によるものです。これらの細胞は、処理細胞と同じ時間、デリバリー材料に曝露されています。右側は、コントロール細胞と同じ濃度のデキストリンに曝露されながら、マイクロ流体デバイスを通過した生存細胞群です。

網掛け部分の細胞は未送達と見なし、線の右側の細胞は送達済みと定義します。この手法に習熟し、適切に実施すれば、1時間以内に完了させることができます。本手順に続き、送達効率や開発後の材料機能などの追加的な疑問を解消するために、他の解析手法や術後評価を行うことが可能です。

この手法は、再生医療分野の研究者が、直接的なタンパク質導入を用いて成人一次細胞における細胞プログラミングを探索するための道を開きました。このビデオを視聴することで、目的のアプリケーションに合わせてセルフスクイージングシステムをセットアップし、操作する方法を十分に理解できるはずです。