における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用ショウジョウバエ幼虫

次の実験の全体的な目標は、改良されたマイクロ流体チャンバーを使用して、ショウジョウバエの幼虫を非侵襲的に固定化してライブイメージングを行うことです。スターの幼虫の3番目は、幼虫を密封するのに役立つオイルと一緒にチップに配置されます。次に、チップを幼虫の体がチャンバー内に収まるように幼虫の上に置きます。

チップはシリンジに接続され、真空を適用することができます。幼虫の運動性が制限され、動物の腹側部分の構造がカバースリップに近づきます。共焦点顕微鏡を使用すると、感覚ニューロンの軸索終末の詳細や、誘発された神経損傷後の分節神経の再生などの構造を簡単にイメージングできます。

ライブイメージングのためにジョセファを固定する他の方法、巨大なクロロホルムエーテル、またはISO麻酔薬。この技術の主な利点は、動物の生理機能を妨げるような毒素を大量に回避することです。また、毒素がないことによる利点は、幼虫GBが安全で、堅牢な固定化により、より速い軸索輸送や細胞内カルシウムの変化などの急速なイベントのイメージングが可能

1匹の幼虫を固定化し、チップ内で複数回画像化することができます。これにより、時間の寿命が保たれます。最大72時間にわたって行われるプロセスのイメージング まず、このプロトコルを試すためにサンプルPDMSチップを入手します。

SU 8 モールドから A-P-D-M-S チップを作成する方法は、21 ゲージのディスペンス ニードルを使用してテキスト プロトコルで読み取ることができます。倒立顕微鏡用のPDMSチップの真空ポートに穴を開けます。23ゲージの針をベースから取り外し、ロックハブを数回ひねります。

次に、針先をポリエチレンチューブの小片に挿入して、チューブが針の少なくとも1ミリメートルを覆うようにします。かみそりの刃を使用して、余分なチューブを切り取ります。これにより、シールを作ることができるプラスチックリングが残ります。

23ゲージの針先を真空ポートの穴に挿入します。正立顕微鏡の場合は、PDMSチップの側面に21ゲージのディスペンシングニードルで2つ目の穴を開けます。この穴は、側面から最初の穴へのアクセスを提供します。

次に、23ゲージの針先とチューブリングを側面の穴に挿入します。PDMSチップの上部に両面テープを貼って、上部の穴を塞ぎます。チップの真空ポートに挿入された針先と三方弁のポートの1つとの間に、長さ20センチメートルのポリエチレンチューブを取り付けます。

次に、20ミリリットルのシリンジをバルブの残りの2つのポートの1つに取り付け、最後のポートを開いたままにします。PDMSチップを透明粘着テープで清掃します。チップの底にテープを貼り付けます。

テープがPDMSの表面全体に接触していることを確認してから、テープをはがします。このクリーニング方法を3回繰り返します。PDMSチップは再利用可能であるため、PDMのガラスへの付着に影響を与える可能性があるため、油の残留物を除去することが非常に重要です。

餌から水を含むシャーレまでの3番目の幼虫。チップを正しく装着するには、長さが3.5〜4ミリメートルである必要があります。幼虫を入浴させて培地を取り除きます。

次に、鉗子を使用してガラスカバースリップの中央にハローカーボン700オイルの小さな滴を再生し、洗浄された幼虫を優しく拾います。軽くワイプに軽く置いてタオルで拭き取り、10秒間オイルに移します。液滴は、幼虫の気管がコーティングされていないほど十分に小さくする必要があります。

次に、幼虫をきれいなガラスのカバースリップに少し置き、別のカバースリップに移動します。したがって、もう少しオイルを取り除きます。幼虫の向きに注意を払い、神経索と分節神経を画像化します。

腹側は下向きにする必要があります。容易に識別できる気管チューブは上向きである必要があります。次に、PDMSチップを幼虫の上にそっと置きます。

幼虫をマイクロチャンバーの中心に合わせます。後部が真空ポートに向けられているため、幼虫はチャンバーの端に触れないようにする必要があります。位置合わせが完了したら、PDMSチップをガラスカバースリップに押し付けて、良好なシールを実現します。

次に、幼虫がマイクロチャンバーに完全に囲まれていることを再確認してください。次に、三方弁をシリンジに切り替えます。PDMSアセンブリをしっかりと保持し、シリンジプランジャーを引いて、抵抗が感じられるまで2〜2.5ミリメートルの空気を引き出します。

したがって、真空を作り出します。次に、バルブをオフにします。掃除機を慎重に維持するために、幼虫を再確認してください。

その体はマイクロチャンバー内で固定され、気管が見える必要があります。PDMSチップの残りの部分はカバースリップに接触している必要があります このような向きが正しくありません。次に、幼虫をイメージします。

正立顕微鏡を使用する場合は、チップの上面を両面テープでステージに固定します。イメージングが完了したら、真空を解除します。次に、PDMSチップをカバースリップから取り外します。

幼虫は鉗子を使用してすぐに運動するはずです。幼虫をブドウジュース寒天プレートに戻して回復させます。麻酔をかけた幼虫を1匹、ブドウジュース寒天プレートに置きます。

実体顕微鏡で、動物の腹側を上に向けます。腹側神経索と分節神経を視覚化するには、幼虫が完全に動かないことを確認してください。神経索と唾液腺の位置を特定します。

これらの構造を傷つけないことが重要です。3 番目の腹部セグメントの端を見つけます。ここでの怪我は最も神経を損傷し、動物を殺さずに再現するのが最も簡単です。

この損傷は、デュオスター番号5である鉗子を使用して、より後部セグメントで行うこともできます。5〜10秒間、キューティクルを通して分節神経をしっかりとつまみます。正しく行われると、キューティクルは無傷のままで、体壁に穴が開けられません。

マスタリーは、怪我が動物の腹側を下にして大きなプレートに置いた後、練習をします。頭を動かして食べることができるはずです。怪我が成功した場合、幼虫の後半分は麻痺します。

幼虫チップは、個々の末梢軸索内のシナプス小胞のキネシン媒介輸送を画像化するために使用されました。これらの小胞の腸内グレードの動きは、毎秒約1.0ミクロンで測定されました。逆行運動は毎秒0.8ミクロンで記録されました。

固定化技術は、パルスUV色素レーザーを用いたレーザー顕微手術に用いられた。カルシウムレベルは、遺伝的にコード化された指標のおかげで、特定のニューロンで観察されました。G camp 3.0 感覚ニューロンの後にカルシウムスパイクが検出されます。

樹状突起は横断されています。イメージングセッションの合間に動物を休ませることで、細胞のイベントを経時的に観察することができます。エメリック運動ニューロンの軸索を粉砕した後、近位の軸索断端は新たな発芽を遂げました。

一方、遠位軸索は静脈瘤を形成し、ウォーラー変性の過程を通じて断片化しました。幼虫チップを使用して、生体内で蛍光タンパク質を写真変換することも可能です。クラス4の感覚ニューロンで発現するDRA two alpha tubulin融合タンパク質を細胞体内で光変換した。

2日以内に、かなりの量の光変換タンパク質が、細胞体の元の位置から約1ミリメートル離れた感覚ニューロンの軸索終末に再配置されました。このビデオを見た後、ショウジョウバエの幼虫のライブイメージングに幼虫チップを利用する方法と、神経挫傷害を行う方法をよく理解しているはずです。これらの技術を習得すると、わずか数分で幼虫を顕微鏡上に配置できます。

神経の挫傷も同様に速いです。したがって、これらの手順は、遺伝的学位などの大規模な実験に利用できます。このチップは、ショウジョウバエの幼虫の腹側の構造を画像化するために利用できます。

これらには、筋肉、神経筋接合部シナプス、感覚ニューロン、末梢神経、および腹側神経索が含まれますが、これらに限定されません。この手順は、幼虫の心臓、唾液腺、および気管のライブイメージングにも使用できます。このビデオで使用されている幼虫チップは、長さが3.5〜4ミリメートルの動物のサイズです。

イメージングが小さいか大きいか、小さいか大きいかの動物チップは容易に作ることができる。PDMSチップの作成に関する補足設計ファイルと説明書を参照してください。PDMSチップの作成手順は、書かれたプロトコルに含まれています。

ご連絡いただければサンプルチップをお送りいたします。