Name: における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用ショウジョウバエ幼虫 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学ぶマイクロ流体チップを用いたショウジョウバエ幼虫の非侵襲的固定法とライブイメージング技術。神経軸索輸送や神経再生の動的観察が可能で、有害な麻酔薬を使用せずに72時間の長時間撮影が行えます。

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この作品は、（CACへによってR00MH080599、ノースカロライナ州にR 21 NS062313、およびNS069844）国立科学財団、（認可番号CACへのIOS-0842701）、および国立衛生研究所によってサポートされていました。私たちは、技術サポート、フライラインのブルーミントンストックセンターのジェームズ·シャッツ、エミリーハン、とレニチュオンを承認したいと思います。すべてのチップは、ミシガン大学でルーリーナノファブリケーション施設で製造された。

1。 PDMSチップを作る SU-8鋳型からPDMSチップを作るために、手順1.1から1.7に従ってください。チップが手元ですが、使用のために組み立てする必要がある場合は、1.8に進みます。 <ol><li> PDMSベースの45グラムと小型使い捨てのプラスチック容器に、PDMSキットからエージェント（10:1比率）を硬化の4.5グラムを混合し、徹底的にプラスチック製攪拌棒を使用してそれらをミックス。 </li><li>任意の気泡を除去するために10分間の真空容器（ 例えば 、デシケーター）内の容器を置きます。 </li><li>直径のプラスチック皿の中の150ミリメートルの下部にあるSU-8型を置き、ゆっくりと鋳型にPDMSの混合物を注ぐ。 PDMSを注いでいる間に気泡を発生しないように注意してください。 </li><li> 4時間650℃のオーブン中でPDMS（またはインキュベーター）を硬化させる。 </li><li>オーブンから硬化したPDMS/SU-8モールドを取り外して、数分間冷ます。 </li><li>カミソリの刃を使用して、SU-8鋳型の縁に沿って硬化したPDMSをカットして、SU-8鋳型から取り外し。 </li><li> PDMSスラブを分割カミソリの刃を使用して、個々のPDMSチップに。 </li><li> 21 Gの分注針を用いて、PDMSチップの（ 図1Aに示されている）真空ポートの穴を突く。 </li><li> 23のGペンシングニードルを取り、針がロックハブから切断先端破るために、そのベースから何度か針の先端をねじる。 </li><li>チューブは、針の少なくともミリメートルを覆うようにポリエチレンチューブの小片に23Gの針の先端を挿入します。その後、離れて針から余分なチューブをカットするカミソリの刃を使用しています。これは、真空吸入口に挿入されたときにシールを作成する針の一方の端部の周りにプラスチックリングを作成する。 </li><li>真空ポートの穴に23 G針先端を挿入し、 倒立顕微鏡（ 図1Bおよび図2A-B）で使用する。 正立顕微鏡（ 図1Cおよび2C-D）で使用するために：21のGの塗料で、PDMSチップ側の第2の穴を突く針をnsing、この穴は、側面から最初の穴へのアクセスを提供します。そして、サイ​​ドの穴にチューブリング23のG針の先端を挿入します。上の穴（ 図1C）をシールするために、PDMSチップの上に両面テープの一部を配置します。 </li><li>長さ約20cmでポリエチレンチューブの部分を取る。真空ポートに挿入された針の先端にチューブの一方の側を接続する。 </li><li> （材料のリストに「3方コックを参照）3方弁のポートにチューブの反対側を接続する</li><li>残りの2つのポートのいずれかに20ミリリットルの注射器を取り付けます。最後のポートは、環境に開放されています。 </li></ol> 2。ライブイメージングのための幼虫チップを使用して<ol><li>透明粘着テープでPDMSチップを清掃してください。チップの底にテープ片を取り付けます。テープが全体のPDMS表面に接触されていることを確認した後、テープを剥がし。 </li><li>そこを確認するために、上記のステップ2〜3倍を繰り返しPDMSチップの表面には粒子または（以前の実験から保持）のオイルはありません。 PDMSチップは再利用可能であるので、それはガラスにPDMSの接着に影響を及ぼし、不十分なシールをもたらすことができるように、オイル残留物を除去することが非常に重要である。 </li><li>水を入れたペトリ皿に初期（IE採餌） 第3齢幼虫を転送します。 （採餌第3齢幼虫ではなく培養バイアルの側面よりも、食品にあります）。培養液を除去するために水に幼虫を浸し。 </li><li>清浄なガラスカバースリップを取ると、その中心にハロカーボン700油の小滴を配置します。 </li><li>鉗子を使用して、優しくクリーンを拾う、（幼虫は長さ〜3.5〜4ミリメートルであるべき）水からの第3齢幼虫を早期上演した。余分な水を除去した後、油滴の上に置き、軽量拭きや紙タオルの上に簡単に動物を配置します。降下が十分に小さい幼虫の気管が被覆されていないようなものであるべきである。幼虫のSTAを聞かせて10秒間、油滴上のY。 </li><li>油滴から幼虫を外し、きれいなガラスカバースリップの上に置きます。 </li><li>別のきれいなカバーガラスに幼虫を移します。このステップは、余分な油を除去します。 </li><li>幼虫の向きに注意してください。神経コードと分節神経を画像化するための、幼虫の腹側はカバースリップの上に座る必要があります。 2縦気管チューブが特徴の背側には、上方を向くようにします。注：これは、幼虫が自然好む向きです。 </li><li>そっと幼虫の上にPDMSチップを配置します。幼虫は真空ポートを志向尻尾と、マイクロチャンバーの中央を中央に配置する必要があります。幼虫は、チャンバの縁に接触しないように注意してください。これは前部と後部気管端末では特に重要です。注記：この手順は、最高の実体顕微鏡下で行われている。 </li><li>良好なシールを達成するためのカバーガラスに対して、PDMSチップを押し込みます。幼虫が完全であることを確認してくださいPDMSチップはカバーガラスに触れているマイクロチャンバーで囲まれた。 </li><li>注射器は、真空を作成する（チューブを通して）PDMSマイクロチャンバーから空気を引き出すことができるように三方弁を切り替える。 </li><li>片手でしっかりとPDMSチップ/カバーガラスを保持します。シリンジプランジャを引くもう一方の手を使用してください。抵抗は、真空を作成するために、注射器のハンドルに感じられるまで、空気の2〜2.5ミリリットルを引き出す。真空は、PDMSチップ、油、およびカバーガラスのインターフェース間の緊密なシールを生成し、幼虫の移動性を制限しています。 </li><li> PDMSチップは注射器から、環境から隔離されるように、バルブのスイッチを切る。その結果、比較的安定した真空レベルは、シリンジプランジャを保持する必要なしにマイクロチャンバーに保持される。 </li><li>全体動物の体はマイクロチャンバの内部に配置されていることを確認するためにステレオスコープの下で幼虫を確認し、動物が不動であること。気管を表示する必要がある。残りのPDMSチップは、カバーガラスで接触していなければならない。注：正しくチップに固定化された動物の例については、図2Eと2Fを参照してください。いくつかの誤った向きは、 図2G及び2Hに示されている。 </li><li>顕微鏡で幼虫チップ（PDMSチップ+カバーガラス）を配置します。幼虫チップ、チューブと注射器はカバーガラスからのPDMSチップの剥離を避けるために、慎重に処理する必要があります。正立顕微鏡のために、両面テープ（ 図1C）を顕微鏡ステージにチップの「上部」側に固定してください。 </li><li>興味のある動物の構造（複数可）を検索し、撮影を行うために、高倍率の対物レンズ（油浸、40-63Xを推奨）を使用します。いくつかの場合において、より低い倍率を高倍率に切り替える前に、撮像のための所望の領域を同定するために必要とされてもよい。 </li><li>撮像が完了すると、位置にバルブを切り替えることにより、真空を解放するそれは、環境に開放されています。 </li><li>カバーガラスからのPDMSチップを取り外します。幼虫は、すぐに運動性である必要があります。 </li><li>マイクロチャンバーから幼虫を削除して、ゆっくりと回復のためのブドウジュース寒天プレートに幼虫を配置する鉗子を使用してください。 </li></ol> 3。幼虫分節の神経に神経挫滅傷害を誘発する<ol><li>隔離するために、上記のステップ2.3に従って早期希望の遺伝子型の第3齢幼虫を上演した。ステップ2.3で説明したように食物を除去するために水に幼虫を浸し。 </li><li> CO 2パッドで、標準的なフライのCO 2麻酔ステーションを使用して幼虫を征服するために、解剖実体顕微鏡下に保持。幼虫は1〜2分間のCO 2パッドの上に配置した後に不動になる必 ​​要があります。 </li><li>今実体顕微鏡下でブドウジュース寒天プレート上に単一の麻酔をかけた幼虫を置く。腹側神経索を視覚化し、（キューティクルを通して神経を分節するように動物腹側を回し<strオング&gt;図3）。幼虫が完全に不動であることを確認してください。 </li><li> Dumostar番号 - 5鉗子を使用して、しっかりと5月10日秒クチクラを通して分節神経をつまむ。これが正しく行われると、キューティクルが無傷のままであり、体壁を貫通されていない。注：傷害は、前後体軸に沿って異なる位置で行うことができるのであれば、腹側神経索、唾液腺、および腸のような損傷を受けない。 図3Dに示すように、最も効果的な傷害の場所は、第3 の腹部セグメントの終点に向かっている。この場所の損害賠償最も神経の傷害とは、動物を殺すことなく再現することが最も簡単です。 </li><li>損傷後、ブドウの板の上に動物のように、その腹側を下に向ける。それは、そのヘッドを移動して食べることができるはずです。怪我が成功した場合には、幼虫の後半分が麻痺します。 </li><li> 25でグレープジュース寒天プレート上で負傷した動物を飼う＆＃176;、Cの実験目的に応じて所望の時間。運動ニューロンのために、近位断端が負傷14の8から10時間以内に発芽し始め、遠位断端が6-8時間15以内に退化し始めます。クラスIV DA感覚ニューロンでは、近位断端は4-6時間以内に発芽し始め、遠位断端は損傷後3〜4時間以内に退化し始める。注：適切なGal4のドライバと蛍光リポーターで、発芽および変性（例えば、 図6を参照）幼虫チップに観察することができる。 </li></ol>

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著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

作ったり、幼虫チップを得た。 幼虫チップは、カバーガラスに付着したPDMSブロック（ &#39;PDMSチップ」と呼ばれる）で構成されています。ステップ1のプロトコルは、SU-8鋳型が使用可能であると仮定すると、幼虫チップの製造および使用のための手順を説明します。 SU-8鋳型は、フォトリソグラフィ（詳細はGhannad-Rezaie ら 12を参照）、シリコンウエハ上に140μmの厚さのSU-8フォトレジスト層をパターニングすることによって微細加工される。 SU-8鋳型の微細加工が特殊な装置へのアクセスを必要とするように、我々は微細加工施設から、それを注文するお勧めします（ 例 。ミシガン州14大学のLNF施設）、またはそれらに提供されているチップ設計を送信することにより、鋳物工場から補足ファイルとして。一つはPDMSチップ（異なるサイズの幼虫で使用するための、例えば ）の設計を変更したい場合は、DXFファイル（ 例えば AutoCADの）を扱うCADソフトウェアを使用することができる。 SU-8金型もMondalの説明に従って、社内で行うことができら。27多くの読者はそれが便利なだけで、自分のチップを製造する前に、テクニックを試すために、サンプルのPDMSチップを得かもしれません。これは、要求に応じて、自由に利用可能になります。 ライブイメージングのためのマイクロ流体 &#39;幼虫チップ」を使用する： 幼虫チップ内の固定化方法は、動物の動きを制限するために、真空の適用を介して、麻酔薬の使用を避け、その代わりに圧力を伴う。動物は、複数の時間12用チップに固定化を生き残ることができますが、短い固定期間（5月15日分）をお勧めします。これは、細胞内カルシウムの変化、または高速軸索輸送など、関心のある多くの細胞事象を、画像化するための十分な時間である。これはまた、このようなレーザベースマイクロサージェリー、光退色、およびphotoconverなどの生きた動物で目的の操作のための十分な時間であるシオン。 単一の動物においてより長い期間にわたって長手方向にイベントを研究するために、動物は、チップ内に配置し、複数回撮像され、休止期間によって分離することができる。彼らは簡単な食料源と湿度を提供するようにグレープジュース寒天プレートは、イメージングセッション間で休憩に最適です。各セッションは（下記、トラブルでパート2を参照）が、動物にダメージを与えるためのいくつかのリスクがあるため、複数のイメージングセッションは、程度に幼虫の生存率に影響します。動物は、日常的に50％を超える生存率で二日間にわたって&gt; 5回撮像することができる。動物を麻酔していないので、彼らはすぐに、チップ内の真空度のリリース後に健康で、運動性である。そこ撮像セッション間の回復時間のための必要性が存在しないため、セッションの間の時間間隔はフレキシブルであり、実験の目的に合わせることができる。 トラブルシューティング： 最も一般的な技術である幼虫チップおよび推奨する解決方法は以下の通りと訴える。 （1） 動物があまり移動している。あまりにも多くの移動度は、撮像シーンを妨害する可能性がある。幼虫チップで、このための最も一般的な理由はa）の動物は、チップには小さすぎる、またはb）固定化工程の間に適用される真空圧が危険にさらされている。このプロトコルで説明幼虫チップは早期第3齢幼虫を上演するために設計されています。動物のための最適なサイズは、（前後軸に沿って）、長さ3.5〜4ミリメートルである。抵抗がハンドルに感じられるまで真空圧が十分であることを確実にするために、注射器2〜2.5ミリリットルを引っ張ったり、。真空が作動していることOne指示が周囲チャネル内の小さな気泡が真空源に向かってゆっくりと移動して見ることができることである。別の指標は、チップが（上から持ち上げたときカバーガラスは常にチップと一緒に旅行べきことであり、これは、チャンバを輸送するための方法をお勧めします幼虫は配置され、真空）にしたら。チューブに亀裂がある場合には真空が損なわれる可能性がある、または油は、チューブ内に存在する場合。これにより、容易に針の先端と（ステップ1.6から1.14まで）、ポリエチレン-50チューブを分配G 23置換することによって対処することができる。 （2）動物は、チップ内の画像形成後に死亡した。 手順は、動物の際に最小限のストレスを引き起こすためのものであり、野生型の遺伝子型の動物であっても、チップ12上の固定化の時間の後、&gt; 90％の生存率を有している。いくつかの遺伝子型は、チップのストレスが少なく弾力される可能性があるので、最初に野生型動物（たとえば、 カントンS）の固定化技術を生き残ることを確認してください。 A）致死のための最も一般的な原因は、幼虫の不正確な位置決め（ 図2G-H参照 ）である。クチクラ、頭部または気管の部分が完全にチャンバ内にない場合、それらは固定化の際に損傷を受けることがあり、そしてaチップ（&gt; 4mm）を大きすぎる幼虫が生存する可能性は低い。 B）致死はあまり一般的な原因は、過剰な圧力や真空チップのロードを使用することである。適切チップに配置されると、真空によって発生した圧力は十分に許容される。しかし真空から、または動物を配置する初期のいずれかの過剰な圧力は、問題となることがあります。それは、正しいサイズの野生型幼虫を試験によって経験的に必要とされる圧力の程度を学習することをお勧めします。あまりにも多くのハロカーボンオイルは、動物の気管をカバーしていた場合はC）動物は、潜在的に長期生存の問題を持つことができる。油は、チップのいくつかの重要な役割を果たしている：それは、結像光学系の間に真空を作成するために重要であり、チップ内の乾燥を妨げる。しかし、過剰な油は避けるべきである。 （これはまた、真空を損なう、チューブ、シリンジ内の油につながることができます）。そして提案されたプロトコルのコートオイルと幼虫のちょうど腹側、Rイメージングのための最終的なカバーガラスに転送する前に、きれいなカバースリップ上の幼虫の配置によって余分な油をemoves。 D）光毒性は、撮像セッションから体験することができます。任意のライブイメージング·アプリケーションと同様に、最高の高感度カメラまたは検出器を用いて達成される低強度のレーザ光で短い露光時間を使用することが理想的である。水銀光源によって作成された広域スペクトル光を含む、UV光での照射を最小化しようとする。 他の問題と今後の方向性： この方法は麻酔薬を使用しないので、動物の心が打ち続けています。これは、より多くの他よりもいくつかの場所で画像化に影響を与えるいくつかの避けられない機動性を作成します。ここでの例は、腹側神経索分節の神経及び体壁を容易に心拍からの干渉なしに撮像することができることを実証している。ハートビートは、撮像に影響を与える場合において、定期的な運動は、時々で補正することができる解析ソフトウェア（たとえば、ImageJのための手ブレ補正プラグイン）。個々のオブジェクトは、高速時間スケールで（高速軸索輸送については、例えば約1ミクロン/秒）または非常に遅い時間スケールで（数分から数時間）を移動している場合に適しています。しかし、ときにオブジェクト（S）の速度と方向の範囲に関心が移動するのではなく、ハートビート誘起動きを補正するために困難になることができます。 もう一つの問題は、動物から動物へ、あるいはチップ内の同じ動物の複数の撮像セッション間の光学系のわずかな変動である。深い関心のある物体が動物内で、より大きなこの変化はなります。分節性神経および腹側神経索は、次いで、通常は定期的な顕微鏡内に結像される動物深すぎる。しかし幼虫チップで経験穏やかな圧力は非常に近く、キューティクルやカバーガラスにこれらの構造をプッシュします。カバーガラスからのこれらの構造の正確な距離は、TRから小さな変化を持つことになります裁判にIAL。オブジェクトのための変化が、このような感覚ニューロンの細胞体として、キューティクルを閉じて、小さい。これは、光学系の変動を考慮するため、動物および独立した試験の大多数を利用すること、特に強度の測定を行うため、重要である。 ここに示す例は、神経細胞内のプロセスに焦点を当てているが、アプローチは、顕微鏡対物レンズの焦点深度内にもたらすことができる動物で任意の構造を画像化するために従順でなければならない。これは、キューティクル、体壁の筋肉、およびそれらのNMJを含む。動物の腹側に気管、潜在的に消化管のどの部分にも画像化されることがあります。動物はまた、背側表面近傍の構造の短期イメージングのためのカバーガラスに向かってその背側に配置することができる。動物内の深い画像構造化する能力を用いる顕微鏡対物レンズの作動距離によって制限される。このようなIMなどの構造aginalディスクは、高倍率（ 例えば 40倍）の目標にはアクセスできません。 このプロトコルで説明幼虫チップは（3.5〜4ミリメートルの大きさの範囲の）早期の第3齢段階で幼虫のために設計されています。しかし、多くの興味深い質問が異なる幼虫の段階で画像化を必要とする。後期第3齢に対応するために2 回目の幼虫、以上のチップを収容するための小さなチップを容易に同じ原理を用いて設計することができる。 （補足図1は、変更された室のサイズのシリコン金型を作るための容易に変更可能なDXFファイルが含まれています）。可逆的シールの単純な原理であっても、Cなどの他の生物に適用することができる主な変種はチャンバサイズであることと虫やゼブラフィッシュ、。有用な将来の方向は、スクリーニング目的に使用する、一度に多くの動物を固定化することができ、チップを設計することである。しかし、このために、設計が大幅に異なる必要があるであろうチップ内に動物を配置する問題は独立して各動物のために対処する必要がある現在のデバイスから。 幼虫末梢神経傷害応答を研究するための神経挫滅アッセイ： 幼虫分節神経のため、ここで説明した神経挫滅アッセイは、 ショウジョウバエの末梢軸索の損傷を導入するための簡単な方法です。この方法の利点は、a）それは、ショウジョウバエの研究室（実体顕微鏡用のCO 2源と鉗子）に見られる標準のツールで行うことが簡単であること、b）には、多くの動物のために迅速に行うことができ、損傷後の神経コードの生化学的解析を行っ14実現可能なこと、c）この傷害に対する分子や細胞応答は、14,15,28高い再現性であり、脊椎動物の神経細胞29,30にも重要なプロセスを発見するために使用することができます。 神経細胞を損傷するための代替方法がfocuことですSA高出力レーザー、例えばレーザー顕微17,31-33を経由して軸索を切断するため、パルスUVまたはフェムト秒レーザー、。幼虫のチップは、マイクロサージェリーのために動物を配置するための理想的な方法です。しかし、前述の試験で、間の光学における小さな差異に、レーザーベースの方法は、特に幼虫分節神経において、幼虫に再現することがより困難になることができます。また、レーザベースの軸索損傷は、（多数の動物を有する）を大規模に行うことはより困難であるため、各動物を位置決めするために多くの時間を必要とする。 トラブルシューティング： 神経挫滅から最も一般的に発生する技術的な問題は、内臓の損傷による死亡である。クラッシュを実施するときには、腹側神経索、唾液腺、または腸を挟まないようにすることが重要である。これは、キューティクルを穿刺しないことも重要です。これらの問題は、最高のキューティクルsurfacに45°の角度でピンセットを持って来ることによって回避される電子（ 図3参照）。 鉗子の品質は、その後クラッシュと生存の有効性に大きな影響を与えます。我々はDumostar数5鉗子をお勧めします。その切れ味を保持するには、鉗子は、注意して取り扱う他の目的に使用されていない、と彼らは鈍いか、曲がっになったら交換する必要があります。 動物の大きさはまた、クラッシュの有効性に影響を与えることができる。 （長さ3ミリメートル未満）の小さな動物ははるかに少ない傷害を生き残る可能性が高い。大型動物では、（ 第3齢を徘徊）、それは神経を見つけ、大きな唾液腺および腸への損傷を回避することがより困難であり、蛹化前に損傷応答を研究するための短い時間がある。神経挫滅を最 ​​も効果的に（前後軸に沿った長さが〜3〜4.5ミリメートルである）初期の第3齢幼虫で行われる。 動物が上に上昇する食料源が影響する可能性クラッシュ後のキューティクルと生存の強さ。これは、標準的な酵母 - グルコースのレシピから作られた食品中の動物を調達することをお勧めします。 効果的にクラッシュを行う方法を学習するための最良の方法は、最初にプライマリ生存を達成するという目標（とは蛹化）クラッシュ後の24時間で、多くの動物をで練習することです。初心者は、通常、低い生存率（ 例えば 、10％）を有するが、技術が学習されると、生存率は約90％に達することができる。 他の問題と今後の方向性： クラッシュアッセイは、損傷部位と軸索と損傷部位より遠位シナプスの変性に軸索の近位の発芽を研究するための強力な方法を提供する。変性の速度が異なるニューロンタイプ間で異なりますが、それらは傷害アッセイの再現性を証明するものを提供し、特定の神経細胞タイプの中で、高度に再現可能である。 対照的に、「回生」は出芽近位の軸索で観察された応答は、研究により困難である。分節神経のすべての軸索は（例えば、 図6と図3を参照）損傷部位に近い発芽広範な開始。しかし発芽の程度はニューロンからニューロンへの変化し、定量化することは困難であることができます。出芽における類似度変動性はUVパルス化色素レーザーを用いて導入分節神経の単一運動ニューロンのより局所性病変後に観察することができる。私たちは、発芽のnondiscriminate方向性が分節神経の指導の手がかりがないことによるものであることを解釈する。これとは対照的に、近くに自分の細胞体へのレーザにより負傷した感覚ニューロンの軸索は、失われた軸索34と同じ方向に新たな軸索 ​​成長を受ける。動物のこの領域における軸索は、おそらく再生軸索の指導のためのより具体的な位置情報にさらされている。分節神経内の環境はずっとresemblanを持っていることはほとんどありませんもともと胚におけるそれらの誘導中にナビゲ​​ートする軸索は、従って再生軸索を案内する情報を有することが期待されていないことを環境にCE。 分節神経挫滅アッセイを使用して再生を研究するための他の制限は、動物が受ける前に負傷した感覚と運動神経軸索はまだ彼らの目標を達成するために（0.25〜1ミリメートル）を覆うようにかなりの距離があり、限られた時間枠（&lt;3日間）ということです蛹化。最近の研究では、 第3齢幼虫35の長さをトリプルprothoraciotropicホルモン受容体の遺伝子操作を同定した。この操作は9ではなく3日間に、大幅に損傷後の神経細胞の回復と変性を研究するための時間枠を拡張します。これは損傷がシナプスエンディングに近い誘導される場合は特に、そのシナプス後の目標とそのような傷ついた軸索の再接続などの新しいイベントを、観察するのに十分な長さがあります。

ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエは 、100年以上のモデル生物として利用されており、基本的なシグナリングおよび無脊椎動物からヒトに保存されている発生経路を定義することに尽力証明されている。特定の細胞型で、蛍光タグ付けされたタンパク質を発現させるために利用できる多くの遺伝的なツールがあり、特に以来、ライブイメージングは、細胞のメカニズムを研究する重要なアプローチであり、シンプルなボディープランとショウジョウバエの幼虫の半透明のキューティクルは、ライブイメージングのための魅力的なシステムになります。 ライブイメージング技術のための重要な課題は、非侵襲的に固定化し、顕微鏡検査のために動物を配置することである。従来の固定化アプローチは、動物を殺すどちらの切開1,2またはクロロホルムの使用を含む。麻酔エーテル4およびイソフルラン5-8も使用されている。麻酔薬は、多くの利点を提供するが、彼らはまた、それゆえに研究プロセスに影響を与えると動物へのストレスを作成することができ、神経活動と（ハートビートを含む）の重要な生理学9月11日を阻害する。エーテルおよびイソフルランを操作するための人間の安全上の懸念もあります。 私たちは「幼虫チップ」12を呼び出して、単層のPDMSマイクロ流体デバイス、 ショウジョウバエの幼虫を固定化する薬物のない方法を開発した。このプロトコルは、取得したり、幼虫チップを作る方法を説明し、早期段階第3齢幼虫にライブイメージングのためにそれを利用する方法。チップがシリンジを介して真空を印加すると、その、ジャストフィットマイクロチャンバーから構成され、穏やかな機械的な力を介して動物に固定する。固定化方法は、ガラスカバースリップに近接内の神経索分節の神経及び体壁の筋肉のような腹側構造をもたらす。これは、高い開口アパーチャを有するような構造体の高分解能イメージングを可能にするTURE（高倍率）目的。 （I）幼虫チップの使用は、無麻酔動物のin vivoイメージングを可能にする、化学物質の使用を置き換えます。他の従来技術に比べて幼虫チップの利点は、次のものがあります。 （II）幼虫は、すぐに（イソフルラン8,13のための2時間の回復期とは対照的に）チップから放出された後に回復。これはミリ秒から数分に、時間や日に至るまで、幅広い時間スケールにわたって画像化を可能にします。 （ⅲ）ガス透過性材料であるPDMSの使用は、幼虫の体内への環境からの酸素/空気を連続的に拡散を可能にします。 （iv）のチップを使用するのは簡単かつ安全である、及び（v）それは再利用可能であり、最小限のコストで製造することができる。 幼虫チップを使用するための指示に加えて、このプロトコルは、 第3齢幼虫におけるニューロンのイベントを研究するためのその使用のいくつかの例を提供する。これらはaxonaのライブイメージングを含むL輸送、傷害に対するカルシウム応答、および長い距離と時間スケールでの光転換タンパク質の人身売買の経時的研究。 チップの別のアプリケーションは、軸索損傷に対するニューロンの応答を研究することである。このために、追加の手順は分節神経挫滅による末梢神経内で軸索が負傷のために（第3部）に記載されている。この単純なアッセイは、同時に処理されるべき多くの動物を可能にする標準的な解剖実体顕微鏡下の両方の迅速かつ再現可能に行うことができる。傷害に対する細胞応答は、幼虫チップでのライブイメージングによって研究することができる。

<table><tbody><tr><td>0.5 mm ポリエチレンチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-170-11B</td><td>ポリエチレンチューブ、内径 = 0.023 インチ O.D. = 0.038 インチ</td></tr><tr><td>1 mm ポリウレタンチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BB521-63</td><td>ポリウレタンチューブ、内径 = 0.063 インチ&nbsp; 外径 = 0.125 インチ</td></tr><tr><td>バーブ - バーブコネクタ</td><td>バイオラッド</td><td>732-8300</td><td>0.8 mm バーブ ツー バーブコネクタ</td></tr><tr><td>3 ウェイ ストップコック バルブ</td><td>バイオ ラッド</td><td>732-8104</td><td>シリンジ用スクリューオンバルブ</td></tr><tr><td>(20 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-33</td> スクリュー<td>オン 20 ml シリンジ 用&nbsp; 真空</td></tr><tr><td>ディスペンシング針の生成、23 G (0.4 mm I.D.、0.6 mm O.D.)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>アウトレット接続用針</td></tr><tr><td>ディスペンシング針、21 G、(0.6 mm I.D.,&nbsp; 0.8 mm O.D.)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A679</td><td>コンセント接続用針</td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td>ハロカーボンオイル 700</td></tr><tr><td>Dumostar Number 5 鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-498</td><td>神経クラッシュ</td></tr><tr><td>用 PDMS キット (ベースと硬化剤)</td> <td>エルスワース</td><td>184 SIL エラスト キット 0.5KG</td><td>ダウ コーニング シルガード 184 シリコーン封止剤 0.5 kg キット クリア</td></tr><tr><td>ガラス カバースリップ</td><td>フィッシャー科学</td>的な<td>12-544-C</td><td>24 mm x 40 mm(あなたの顕微鏡の目的のための推薦に従う厚さ)</td></tr><tr><td>使い捨て可能なプラスチック コップ(9オンス)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック コーヒーのスターラー棒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>のブドウジュースの寒天皿</td><td></td><td></td><td>レシピについては<a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925</a>を参照してください</td></tr></tbody></table>。

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

ライブイメージングは​​、しかし、これは生きている動物に挑戦することができ、細胞生物学的プロセスを研究するための重要な技術である。 ショウジョウバエの幼虫の半透明のキューティクルは、ライブイメージング研究のための魅力的なモデル生物になります。しかし、ライブイメージング技術のための重要な課題は、非侵襲的に固定化し、顕微鏡で動物を配置することである。このプロトコルは、我々は&#39;幼虫チップ」と呼ぶポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体デバイス上でショウジョウバエの幼虫を固定化し、画像化するためのメソッドを使用するシンプルで簡単に説明します。幼虫チップは注射器を介して真空を印加すると、動物を固定化し、このような神経索、分節神経、ボディなどの腹側の構造をもたらし、薄いカバーガラスに取り付けられぴったりフィットのPDMSマイクロチャンバーで構成されているカバーガラスのすぐ近く内の壁の筋肉、。これは、高分解能イメージングを可能にし、重要なことには、オクタンの使用を回避する生理学的プロセスの広い範囲の研究を促進するstheticsや化学物質、。幼虫が固定化から容易に回復するので、それらは容易に複数の撮像セッションを行うことができる。これは時間から日の範囲の時間経過にわたる長期的な研究が可能になります。このプロトコルは、ステップバイステップのチップとどのように第3齢幼虫における神経イベントのライブイメージングのためのチップを利用するに準備する方法について説明します。これらのイベントは、軸索、傷害に対するカルシウム応答、および長い距離と時間スケールでの光転換タンパク質の人身売買の経時的研究における細胞小器官の迅速な輸送が含まれています。チップの別のアプリケーションは、再生および軸索損傷の変性反応を研究することであるので、このプロトコルの第2の部分は、分節神経挫滅による末梢神経内で軸索が負傷のための新しい、簡単な手順を説明します。

ショウジョウバエの幼虫は、その半透明のキューティクルと強力な遺伝学へのライブイメージングのための魅力的なモデル系である。このプロトコルは、単層のPDMSデバイスを活用する方法について説明し、 第3齢ショウジョウバエの幼虫の神経細胞内で細胞過程のライブイメージングのための「幼虫チップ」と呼ばれる。

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

本実験の総合的な目的は、改良したマイクロ流体チャンバーを用いて、ライブイメージングのためにショウジョウバエ幼虫を非侵襲的に固定することである。3齢幼虫をチップ上に配置し、幼虫の密閉を助けるために少量のオイルを加える。次に、チップを幼虫の上に載せ、幼虫の体がチャンバー内に収まるように配置する。チップをシリンジに接続し、真空を印加できるようにします。これにより幼虫の運動性が制限され、動物の腹側の構造がカバーガラスに押し付けられます。共焦点顕微鏡を用いることで、感覚ニューロンの軸索末端の詳細や、誘発的な神経損傷後の分節神経の再生などの構造を容易にイメージングできます。ライブイメージングのためにゼブラフィッシュを固定する他の方法として、クロロフォーム、エーテル、またはイソフルランなどの麻酔薬が挙げられます。本手法の主な利点は、動物の生理機能に干渉するこのような毒剤の使用を回避できることです。また、毒剤を使用しないことによるさらなるメリットとして、幼魚が安全に扱いやすくなることが挙げられます。この強固な固定法により、高速な軸索輸送や細胞内カルシウム濃度の変化といった、急速な現象のイメージングが可能になります。1匹の幼虫をチップ内で固定し、繰り返しイメージングすることが可能です。これにより、最大72時間にわたって進行するプロセスのタイムラプスイメージングが行えます。まずは、本プロトコルを試すためのサンプルPDMSチップを入手してください。21ゲージのディスペンシングニードルを用いてSU-8モールドからA-P-D-M-Sチップを作製する方法については、テキストプロトコルをご参照ください。倒立顕微鏡で観察するため、PDMSチップの真空ポートに穴を開けます。23ゲージのニードルを、ロックハブから数回ひねって取り外します。次に、針先をポリエチレンチューブの小さな断片に挿入し、チューブが針の少なくとも1mmを覆うようにします。カッターナイフを使用して、余分なチューブを切り落とします。これにより、シール（密閉）可能なプラスチック製のリングが形成されます。23ゲージの針先を真空ポートの穴に挿入します。正立顕微鏡を使用する場合は、21ゲージのディスペンシング針を用いて、PDMSチップの側面に2つ目の穴を開けます。この穴により、側面から1つ目の穴へのアクセスが可能になります。次に、23ゲージの針先とチュービングリングをサイドホールに挿入します。PDMSチップの上部に両面テープを貼り、上部のホールを密封します。チップの真空ポートに挿入した針先と、3方バルブのポートの1つとの間に、長さ20 centimeterのポリエチレンチューブを取り付けます。次に、バルブの残りの2つのポートのうち1つに20 milliliterのシリンジを取り付け、最後のポートは開けたままにします。透明な粘着テープでPDMSチップを洗浄します。チップの底にテープを貼り付けます。テープがPDMS表面全体に密着していることを確認し、その後テープを剥がします。この洗浄手順を3回繰り返します。PDMSチップは再利用可能であるため、油分などの残留物はPDMSのガラスへの接着性に影響を及ぼす可能性があり、これを除去することが非常に重要です。初期探索行動を転移させます。3齢幼虫を餌から水を入れたシャーレに移します。チップに正しく適合させるため、幼虫の長さは3.5～4mmである必要があります。幼虫を洗浄し、培養基を除去します。次に、ガラスカバースリップの中央にhalocarbon 700オイルを少量滴下します。ピンセットを用いて、洗浄済みの幼虫をそっと拾い上げます。軽量ワイプの上に短時間置いて水分を拭き取り、その後、オイルの中に10秒間浸します。このとき、幼虫の気管がオイルで覆われないよう、滴下量は十分に少量にする必要があります。次に、幼虫を清潔なガラスカバースリップの上に短時間置き、それを別のカバースリップへと移動させます。これにより、油分をさらに取り除きます。神経索と分節神経を撮影するため、幼虫の向きに注意してください。腹側を下に向けてください。容易に識別できる気管は上向きにします。次に、PDMSチップを幼虫の上にそっと置きます。幼虫をマイクロチャンバーの中央に合わせます。後端を真空ポートに向け、幼虫がチャンバーの端に触れないように配置してください。位置が決まったら、PDMSチップをガラスカバースリップに押し付け、しっかりと密閉します。次に、幼虫がマイクロチャンバー内に完全に収まっていることを再確認します。ここで、3方バルブをシリンジ側に切り替えます。PDMSアセンブリをしっかりと固定し、抵抗が感じられるまでシリンジプランジャーを引いて、空気を2〜2.5 mm分吸引します。これにより真空状態になります。その後、バルブを閉じます。真空状態を慎重に維持するため、幼虫の状態を再確認してください。個体はマイクロチャンバー内で固定され、気管が見えている必要があります。PDMSチップの残りの部分はカバーガラスに接触させてください。このような向きは正しくありません。これで幼虫を撮影します。正立顕微鏡を使用する場合は、チップの上側を両面テープでステージに固定してください。イメージングが完了したら、真空を解除します。その後、カバーガラスからPDMSチップを取り外します。ピンセットで触れると、幼虫がすぐに活発に動くことを確認してください。回復させるため、幼虫をブドウジュース寒天培地に戻します。麻酔をかけた幼虫1匹をブドウジュース寒天培地に置きます。実体顕微鏡下で、動物の腹側を上に向けます。腹側神経索と分節神経を可視化するため、幼虫が完全に静止していることを確認してください。神経索と唾液腺の位置を確認します。これらの構造を損傷させないことが重要です。第3腹節の末端を確認してください。ここを損傷させると、動物を死なせることなく、最も多くの神経を損傷させることができ、再現性も最も高くなります。また、duo star number fiveピンセットを用いて、より後方の節で損傷を与えることも可能です。節神経をクチクラ越しに5〜10秒間強く挟みます。正しく行われれば、クチクラは無傷のままで、体壁は貫通しません。動物を腹側を下にして大プレート上に配置し、損傷を加えた後、習熟するには練習が必要です。動物は頭を動かし、餌を食べることができるはずです。損傷が成功していれば、幼虫の後半身は麻痺します。個々の末梢軸索内におけるキネシン介在性のシナプス小胞輸送をイメージングするために、ラーバチップを使用しました。これらの小胞の順行性輸送は秒速約1.0 micronsで測定されました。また、逆行性輸送は秒速0.8 micronsであることが記録されました。パルスUVダイレーザーを用いたレーザー微小手術のために、固定化技術が使用されました。遺伝子コード型インジケーターを用いることで、特定のニューロンにおけるカルシウムレベルの観察が可能となりました。G camp 3.0により、感覚ニューロンの後にカルシウムスパイクが検出されます。樹状突起を切断します。イメージングセッションの間に動物を休ませることで、細胞レベルのイベントを時間経過とともに観察することが可能になります。運動ニューロンの軸索を圧挫させた後、近位側の軸索断端において新たな発芽が認められました。その間、遠位軸索は静脈瘤状の膨らみ（varicosities）を形成し、ワラー回路変性（wallerian degeneration）の過程を経て断片化しました。larva chipのトラッキング写真を用いることで、生体内での蛍光タンパク質の光変換も可能です。クラス4感覚ニューロンに発現させたDRA2-α tubulin融合タンパク質を、細胞体において光変換させました。2日以内に、光変換されたタンパク質の相当量が、細胞体にある元の位置から約1 mm離れた感覚ニューロンの軸索末端へと輸送されました。このビデオを視聴することで、drosophila 幼虫のライブイメージングに幼虫チップを利用する方法と、神経挫滅損傷を行う方法について十分に理解できるはずです。これらの技術を習得すれば、わずか数分で幼虫を顕微鏡上に配置させることが可能です。神経挫滅の手技も同様に迅速です。したがって、これらの手順は遺伝学的スクリーニングなどの大規模な実験に活用できます。このチップを用いることで、ショウジョウバエ幼虫の腹側の構造をイメージングすることが可能です。これらには、筋肉、神経筋接合部シナプス、感覚ニューロン、末梢神経、および腹側神経索が含まれますが、これらに限定されません。本手順は、幼虫の心臓、唾液腺、および気管のライブイメージングを行うためにも使用できます。本ビデオで使用している幼虫用チップは、体長 3.5 から 4 mm の個体に適したサイズです。より小さな、あるいはより大きなイメージングを行う場合は、より小さな、またはより大きなチャンバーを持つアニマルチップを容易に作製できます。PDMSチップの作製に関する設計ファイルと手順については、補足資料をご参照ください。PDMSチップの作製手順は、テキストプロトコルに含まれています。お問い合わせいただければ、サンプルチップをお送りいたします。

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このビデオでは、生きたショウジョウバエの胚に試薬を送達するマイクロインジェクションの方法を説明しています。研究者は、この方法を使用して、胚発生の初期段階で核酸やタンパク質などの外因性化合物を導入できます。この注目のプロトコールは、任意の可溶性試薬(ここではライブイメージング実験用の蛍光タンパク質)の注入手順の設定方法と実行方法を示しています。...

ショウジョウバエの生胚へのマイクロインジェクション:発生中の胚への試薬の早期送達

非常に後期ショウジョウバエの胚の胚性表皮は、急速な刺し傷応答解析のためのin vivoのシステムを提供し、哺乳動物モデルへの変換のための創傷治癒の研究を進めるために遺伝子操作や化学マイクロインジェクションの治療と組み合わせることができます。...

マイクロインジェクションアッセイをキズや<em&gt;インビボ</em&gt;表皮の局在は、応答記者傷<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚。

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

このプロトコルは、ドロショウジョウバエ幼虫を取り付け、無傷の生きている動物における10時間以上の中断のないタイムラプス画像を達成する方法を記載している。この方法は、幼虫の身体壁に近い多くの生物学的プロセスを画像化するために使用することができる。...

長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

このプロトコルは、軸索損傷後のニューロン代謝ダイナミクスをモデル化するマイクロ流体システムを記述し、内因性代謝リモデリングのイメージング、マルチオミクス分析、およびメカニズム研究を可能にします。...

軸索損傷モデル用マイクロ流体チップの構築とマルチオミクス解析の実現

学ぶマイクロ流体チップを用いたショウジョウバエ幼虫の非侵襲的固定法とライブイメージング技術。神経軸索輸送や神経再生の動的観察が可能で、有害な麻酔薬を使用せずに72時間の長時間撮影が行えます。

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用

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