ビタミンE-TPGSとのシングルエマルジョンまたはダブルエマルジョンにより形成されるPLGAナノ粒子

この手順の全体的な目標は、調整可能なサイズのポリマーナノ粒子を形成することです。これは、最初にポリマーを有機溶媒に溶解し、薬物または蛍光封止剤を添加することによって達成されます。第2のステップは、乳化剤を含む水相でポリマーを乳化し、溶媒が蒸発するにつれて粒子がより大きな水性体積で硬化するのを許すことです。

次に、粒子を洗浄し、遠心分離機で収集し、凍結乾燥して長期保存します。最後のステップは、走査型電子顕微鏡またはSEMイメージングを使用して、ナノ粒子のサイズと表面形態を特徴付けることです。最終的に、SEMは、乳化剤の濃度を変えることでナノ粒子のサイズを制御できることを示すために使用されます。

この技術の意味するところは、粒子をカスタマイズして、持続的な作用のための幅広い治療薬をカプセル化して送達することができるため、さまざまなヒト疾患の治療にまで及びます。標的組織内。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

乳化ステップは、エマルジョンがどのように形成されるかの微妙な側面がin粒子の特性に大きな影響を与える可能性があるため、習得するのが困難です。ナノ粒子の調製を開始するには、約100ミリグラムのポリ乳酸coグリコール酸(PLGAとも呼ばれる)を13 x 100ミリメートルの試験管に入れます。次に、ガラス血清ピペットを使用して、1ミリリットルの酢酸エチルをサンプルに移し、チューブの上部をアルミホイルで覆い、ホイルをしっかりとパラフィルムします。

溶媒の蒸発を防ぐために、バイアルの上端とホイルの下端にパラムをしっかりと包んでください。試験管上の溶媒のレベルをマークし、ポリマーが一晩溶解するのを待ちます。翌日、蒸発が発生した場合は、追加の溶媒を追加します。

以下の機器と材料は、超音波に近いヒュームフードに準備します。ボルテックス、ゴム球と磁気攪拌板を備えた2つの小さなガラス製牧草地ピペット。さらに、氷水でいっぱいの大きなビーカーを超音波の下のスタンドに置きます。

次に、200ミリリットルのガラススピーカーに45ミリリットルの体積あたり0.3%の重量、ビタミンET-P-G-Sを追加し、攪拌速度を360RPMに設定します。次に、13 x 100 mmのガラス試験管に、1体積あたり0.3%の重量であるビタミンE-T-P-G-Sを2ミリリットル加えます。疎水性剤を混合するには、封止剤をポリマー溶液に直接添加し、試験管の壁を避け、封止剤が均一に分散するまでチューブを渦巻かせるように注意します。

親水性剤の場合は、封止剤をポリマー溶液で乳化します。ポリマー溶液の表面に最大50マイクロリットルの薬物を緩衝液に加えます。混合物を氷上で約10秒間、または溶液が不透明で均質になるまで超音波で観察します。

次に、ビタミンE-T-P-G-Sが入った試験管を垂直に保持しながら、上部に渦巻きします。ガラス姿勢ピペットをボルテックスチューブの上部から1〜2センチメートル上に置き、ポリマー溶液をボルテックスULの表面にゆっくりと滴下します。ポリマー溶液全体を追加した後、ピペットがチューブの側面に触れないように注意してください。

溶液のボルテックスを続けます。次に、15秒間のエマルジョンです。すぐに乳化ポリマーを超音波発生器に移します。

試験管を氷水に浸し、エマルジョンを3回10秒のバーストで超音波処理します。エマルジョンをプローブの上下に動かして、超音波処理を均一にし、プローブを試験管の側面または底部に触れないようにします。10秒ごとに超音波処理の間に5〜10秒間一時停止して、溶液を冷ましてから続行します。

次に、攪拌溶液からエマルジョンに0.3%ビタミンE-T-P-G-Sを1〜2ミリリットル加えます。これにより、乳化ポリマーが薄くなり、エマルジョンを攪拌溶液に注ぎ込み、空にすることが容易になります。試験管に残った溶液を攪拌液に洗い流します。

ナノ粒子を3時間攪拌して硬化させます。封止材が光に敏感な場合は、ビーカーをアルミホイルで包み、ナノ粒子を収集するための溶媒蒸発を促進するために上部を開いたままにしますナノ粒子をナノ粒子に心臓を分割することから始めます30ミリリットルの公称容量の2つのオークリッジ遠心分離管に心臓を分割し、互いに0.1グラム以内でバランスを取ります。次に、ナノ粒子を固定角ローターで17, 000で15分間遠心分離します。

遠心分離時間が長いほど、より小さなナノ粒子のより高い画分が収集されます。ナノ粒子ペレットを乱さないように注意して上清を捨ててください。

5ミリリットルの蒸留水を加え、ウォーターバス、エーター、ボルテックスを使用してナノ粒子を完全に懸濁します。2本の遠心分離管の内容物を1つにまとめ、20ミリリットルの蒸留水を加えて合計30ミリリットルにします。次に、遠心分離と洗浄のステップをさらに2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。

最後のペレットResus懸濁液の液量は4〜5ミリリットルでなければなりません。SEMイメージング用のテロスフリーナノ粒子の小さなアリコートを凍結し、残りの部分に凍結します。PLGAナノ粒子の均一かつ完全なresus懸濁液のための凍結保護剤としてポリマーに1対2のTLOの重量比を追加します。

これにより、粒子表面を損傷して凝集を誘発する可能性のある氷の結晶が形成されるのを防ぎます。ナノ粒子をあらかじめ秤量した5ミリリットルの遠心分離管に移し、マイナス80°Cで少なくとも30分間凍結します。次に、チューブのキャップを外し、上部をゴムバンドで上部に固定して上部を覆います。

溶けても内容物が溶けないように素早く動きます。凍結乾燥機に入れる前に再凍結し、5ミリリットルのサンプルを凍結乾燥して72時間置きます。次に、キャップを元に戻し、マイナス80°Cで保管用の凍結乾燥粒子でチューブを包みます。

イメージングの日に、SEMスタブに両面カーボンテープのストリップを置きます。スタブの金属部分に油性マーカーでラベルを付け、後で参照できるようにします。金属ヘラを使用して、少量の凍結乾燥ナノ粒子を収集し、テープの表面全体に静かに広げます。

スタブの表面をラボティッシュで磨くか、圧縮空気を使用して緩いナノ粒子を取り除きます。5〜15ミリメートルのビームの作動距離、5〜12キロボルトの強度、および1〜3のビーム強度のスポットサイズを使用して粒子を視覚化すると、サンプルが局所的に加熱され、粒子の表面形態が変化する可能性があります。マイクロ粒子は100倍の倍率で観察され、ナノ粒子は3000倍で識別可能になります。

倍率:球体の上部に焦点を合わせて、SEMで簡単に視覚化できる粒子を特定し、バッチごとに少なくとも3つの画像を収集して、粒子サイズと形態の代表的なサンプルを取得します。この方法を使用すると、粒子は、滑らかな表面形態とサンプル全体に分布する広範囲のサイズを持つ個々の非融合球として現れる単一の感情によって作成できます。ここに示されている微粒子の平均直径は730ナノメートルです。

ここに示されているのは、疎水性薬物であるカンピンをカプセル化している単一の感情によって作成されたナノ粒子です。これらの粒子は、平均直径340ナノメートルとさらに小さくなりました。乳化剤の濃度が高いほど、平均直径が2000ナノメートルから200ナノメートルに減少する小さな粒子が生成されました。

乳化剤の濃度が0.01から0.3%に増加したため、ここのSEM画像で示されているように。しかし、ビタミンE-T-P-G-Sの濃度が高すぎると、1%のビタミンE-T-P-G-Sを使用したときに離散的な粒子が形成されず、構造全体に重い融合とシート状の構造が存在することがわかった。真。乳化によってPLGナノ粒子を作製する方法を学んだら、表面修飾などの他の方法を実行して、体の特定の細胞タイプまたは領域との相互作用のためのナノ粒子を設計することができます。

このビデオを見た後、乳化によって再現性と調整可能なサイズの粒子を形成する方法をよく理解しているはずです。