ビタミンE-TPGSとのシングルエマルジョンまたはダブルエマルジョンにより形成されるPLGAナノ粒子

本手順の全体的な目的は、サイズ調整可能なポリマーナノ粒子を形成することです。まず、ポリマーを有機溶媒に溶解させ、薬剤または蛍光封入剤を添加します。次に、乳化剤を含む水相でポリマーを乳化させ、溶媒が蒸発するにつれて、より大量の水溶液中で粒子を硬化させます。

次に、粒子を洗浄し、遠心分離で回収して凍結乾燥し、長期保存します。最終ステップとして、走査電子顕微鏡（SEM）イメージングを用いて、ナノ粒子のサイズと表面形態を評価します。最終的に、乳化剤の濃度を変化させることでナノ粒子サイズを制御できることをSEMにより示します。

粒子をカスタマイズすることで、持続的な作用を持つ幅広い治療剤を封入して標的組織へ届けることが可能になるため、この手法の意義はさまざまなヒト疾患の治療へと広がります。この方法を視覚的に実証することは極めて重要です。

乳化の工程は、エマルション形成の細かな要因が粒子の特性に大きな影響を与える可能性があるため、習得が困難です。ナノ粒子調製を開始するには、約100 milligramsのポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）を13 by 100 millimeterの試験管に入れます。次に、ガラス製セロロジカルピペットを用いて1 milliliterのエチル酢酸をサンプルに添加し、試験管の上部をアルミホイルで覆い、さらにパラフィルムでホイルをしっかりと固定します。

溶媒の蒸発を防ぐため、パラフィルムでバイアルの上端とホイルの下端をしっかりと巻いてください。試験管に溶媒の液面を印付けし、ポリマーを一晩かけて溶解させます。翌日、蒸発が見られる場合は溶媒を追加してください。

超音波発生装置の近くにあるドラフトチャンバー内で、以下の器具および材料を準備します。ボルテックスミキサー、ゴムバルブ付きの小型ガラスパステールピペット2本、およびマグネチックスターラーを用意してください。さらに、超音波発生装置の下のスタンドに、氷水で満たした大きなビーカーを設置します。

次に、0.3% w/v ビタミンE-T-P-G-S 45 mLを200 mLのガラスビーカーに加え、撹拌速度を360 RPMに設定します。続いて、0.3% w/v ビタミンE-T-P-G-S 2 mLを13 x 100 mmのガラス試験管に加えます。疎水性剤を混ぜ合わせるため、試験管の壁面に触れないように注意しながら封入剤をポリマー溶液に直接加え、封入剤が均一に分散するまでチューブをボルテックスします。

親水性薬剤の場合、封入物をポリマー溶液で乳化させます。バッファーに溶解した薬液を最大 50 µL、ポリマー溶液の表面に加えます。混合液を氷上で約 10 秒間、または溶液が不透明で均質になるまで超音波処理します。

次に、vitamin E-T-P-G-Sを入れた試験管を垂直に保持し、高速でボルテックスします。ガラス製パステールピペットをボルテックス中のチューブの上端から1〜2 cmに保ち、ポリマー溶液を表面にゆっくりと滴下してください。ポリマー溶液をすべて添加し終えるまで、ピペットがチューブの側壁に触れないように注意してください。

溶液のボルテックス攪拌を続けます。ここで15秒間乳化させます。乳化したポリマーを直ちに超音波処理装置に移します。

試験管を氷水に浸けたまま、エマルションを10秒間×3回の間隔でソニケーションします。均一にソニケーションが行われるよう、プローブを上下に動かし、プローブが試験管の側面や底に触れないようにしてください。溶液を冷却するため、10秒間のソニケーションごとに5〜10秒間休止してから次へ進んでください。

次に、攪拌液から0.3% vitamin E-T-P-G-Sを1〜2 mL、エマルションに加えます。これにより乳化ポリマーの粘度が下がり、注ぎやすくなります。エマルションを攪拌液の中に流し入れます。試験管に残っている溶液をすべて攪拌液の中に洗い出してください。

3時間攪拌してナノ粒子を硬化させます。封入剤が光感受性の場合は、ビーカーをアルミホイルで包みますが、溶媒の蒸発を促進させるため上部は開けておきます。ナノ粒子を回収するには、まずナノ粒子を公称容量30 mLのオークリッジ製遠心チューブ2本に等分し、重量差が0.1 g以内になるように調整します。その後、固定角ローターを用いて、17,000 ×gで15分間、ナノ粒子を遠心分離します。

RC f. 遠心分離時間を長くすることで、より小さなナノ粒子の回収率を高めることができます。ナノ粒子のペレットを乱さないよう注意しながら、上澄み液を除去してください。

5 mLの蒸留水を加え、ウォーターバス、ソニケーター、およびボルテックスミキサーを用いてナノ粒子を完全に懸濁させます。2本の遠心管の内容物を1本にまとめ、さらに20 mLの蒸留水を加えて全量を30 mLにします。その後、遠心分離と洗浄のステップをさらに2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。

最後のペレット再懸濁液の液量は4〜5 mLにする必要があります。SEMイメージング用に、テロスフリーナノ粒子の少量分注液を、残りの液とは別に凍結保存します。PLGAナノ粒子の均一で完全な再懸濁のため、凍結保護剤としてポリマーに対して1〜2の重量比でTLOを添加します。

これにより、粒子表面を損傷させ凝集を誘発する可能性のある氷結晶の形成を防ぐことができます。ナノ粒子をあらかじめ重量を量った5 mL centrifuge tubeに移し、-80 °Cで少なくとも30分間凍結させます。次に、チューブのキャップを取り外し、上部をラボペーパーで覆ってゴムバンドで固定します。

融解が生じた場合に内容物が溶けないよう、迅速に操作します。ライオフィライザーに入れる前に再凍結し、5 mLのサンプルを72時間凍結乾燥させます。その後、キャップを閉めてチューブをラップで包み、凍結乾燥した粒子を-80 °Cで保存します。

イメージング当日、SEMスタブに両面カーボンテープを貼り付けます。後で参照できるように、スタブの金属部分に油性マジックでラベルを付けます。金属製スパチュラを使用して、少量の凍結乾燥ナノ粒子を採取し、テープの表面に静かに広げます。

ラボ用ティッシュでスタブの表面を掃くか、圧縮空気を使用して緩いナノ粒子を取り除きます。ビームの作動距離を5〜15 mm、加速電圧を5〜12 kV、スポットサイズを1〜3に設定して粒子を可視化します。ビーム強度が高すぎると、試料の局所的な加熱を招き、粒子の表面形態が変化する可能性があります。マイクロ粒子は100倍の倍率で観察し、ナノ粒子は3000倍で判別可能です。

SEMで容易に可視化できる粒子を特定するため、球体の上部に拡大フォーカスを合わせ、粒子径と形態の代表的なサンプルを得るために、1バッチあたり少なくとも3枚の画像を収集します。この方法により、滑らかな表面形態を持ち、サンプル全体に広範囲なサイズ分布を示す、融合していない個々の球体として単一乳化で粒子を作成できます。ここで示しているマイクロ粒子の平均直径は730 nanometersです。

ここでは、疎水性薬剤であるcampinを封入し、単一乳化法によって作成されたナノ粒子を示しています。これらの粒子はさらに小型化し、平均粒径は340 nmとなりました。乳化剤の濃度を高めることでより小さな粒子が生成され、平均粒径は2000 nmから200 nmまで減少しました。

SEM画像に示されているように、乳化剤の濃度が0.01%から0.3%に増加するにつれて変化が見られました。しかし、ビタミンE-T-P-G-Sの濃度が高すぎると、1%のビタミンE-T-P-G-Sを使用した場合には個別の粒子が形成されず、構造全体にわたって激しい融合やシート状の構造が認められました。乳化法によるPLGナノ粒子の作製方法を習得すれば、表面修飾などの他の手法を用いて、特定の細胞型や体内領域と相互作用するようにナノ粒子を設計することが可能です。

このビデオを視聴することで、乳化法を用いて再現性があり、サイズ調整可能な粒子を形成する方法について十分に理解することができます。