Name: ビタミンE-TPGSとのシングルエマルジョンまたはダブルエマルジョンにより形成されるPLGAナノ粒子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学ぶPLGAナノ粒子の乳化法による調製技術。ビタミンE-TPGSを乳化剤として用い、濃度を変えることで220nmから1.98µmまでの粒径制御が可能です。走査型電子顕微鏡による評価方法も解説し、薬物送達システムの開発に応用できます。

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1. ナノ粒子の調製
溶剤または溶解/乳化ポリマーを含むすべてのステップは、化学ドラフト内で実行する必要があります。
<ol>
	<li>100 mg (+/- 5 mg) のポリ (乳酸 - グリコール酸) (PLGA) を秤量し、13 mm x 100 mm の試験管に入れます。</li>
	<li>1 mLの溶媒(酢酸エチル(EtAc)またはジクロロメタン(DCM))をガラス血清ピペットでサンプルに移します。</li>
	<li>チューブの上部をアルミホイルの小片で覆い、ホイルをしっかりとパラフィルムし、バイアルの上端とホイルの下端にパラフィルムをしっかりと包み</li>込みます。
	<li>試験管の外側に溶剤のレベルをマークします。ポリマーを一晩溶解させ、蒸発が発生した場合は翌日に溶媒を追加します。 
	注:ポリマーは、必要に応じて、ナノ粒子調製の日に溶解することもできます。手順1.1〜1.3に従い、次にすべてのポリマーが完全に溶解するまで(~10分)強でボルテック</li>スします。
	<li>超音波装置の隣に次の機器/材料でヒュームフードの作業領域を準備します:ボルテクサー、ゴム球付きの2つの小さなガラスパスツールピペット、および磁気攪拌板。氷水でいっぱいの大きなビーカーを超音波装置の下のスタンドに置きます。</li>
	<li>マグネティックスターバー付きの200mlガラスビーカーに0.3%ビタミンE-TPGS45mlを加え、攪拌速度を360rpmに設定します。</li>
	<li>13 mm x 100 mmのガラス試験管に2 mlの0.3%w / vビタミンE-TPGSを加えます。.</li>
	<li>薬を追加: 
	疎水性剤の場合:封止剤をポリマー溶液に直接追加し(試験管の壁を避けるように注意)、封止剤が均一に分散するまでチューブを渦巻きにします。 
	親水性剤の場合:先に進む前に、ポリマー溶液で封止剤を乳化します。最大50 μlの薬物を水またはバッファーに浸してポリマー溶液の表面に加えます。ポリマーで薬物を乳化するために短時間超音波処理する(通常は10秒、または均質で不透明な溶液を達成するために必要に応じて)。この超音波処理ステップは氷上で実行する必要があります。</li>
	<li>オープンチューブポリマー/封止材をボルテクサーの近くに置きます。ビタミンE-TPGSを含む試験管を垂直に高渦上に保持しながら、ガラスパスツールピペットを使用してポリマー/封止剤溶液を滴下します。チューブの側面を避け、ポリマー溶液を渦状乳化剤の表面に直接落とすように注意してください。1 mlのポリマー溶液全体をビタミンE-TPGSに添加した後、溶液(現在はエマルジョン)をさらに15秒間ボルテックスし続けます。</li>
	<li>すぐに乳化ポリマーを超音波装置に移します。試験管を氷水に浸し、エマルジョンを10秒のバースト3回(700 Wの超音波発生器の40%の振幅、プローブ先端サイズの1/8)で超音波処理します。エマルジョンをプローブの上下に動かして、試験管の側面または底部にプローブが触れないように注意しながら、超音波処理を均一にします。10秒ごとに超音波処理の間に一時停止して、溶液を冷ましてから続行してください。</li>
	<li>攪拌溶液から0.3%ビタミンE-TPGSをガラスパスツールピペットでエマルジョンに1〜2ml加えると、乳化ポリマーが薄くなり、注ぎやすくなります。エマルジョンを攪拌液に空にします。この手順を繰り返して、試験管から残っている溶液を攪拌液に洗い流します。</li>
	<li>ナノ粒子を3時間撹拌しながら硬化させます。封止材が感光性の場合、ビーカーをアルミホイルで包み、溶媒の蒸発を容易にするために上部を開いたままにすることができます。</li>
</ol>
2. ナノ粒子コレクション
<ol>
	<li>硬化したナノ粒子を2本のOak Ridge遠心分離チューブ(公称容量30 mL)に分割し、0.1 g以内にバランスを取ります。</li>
	<li>固定角ローターでナノ粒子を17,000 x gで15分間遠心分離します。遠心分離時間が長いほど、より小さなナノ粒子のより高い画分が収集されます。</li>
	<li>ナノ粒子ペレットを乱さないように注意して、上清を捨ててください(水を注いだり、ピペットで落としたりすることができます)。15 mLのdiH2Oを加え、ウォーターバスソニケーターおよび/またはボルテクサーを使用してナノ粒子を完全に再懸濁します。</li>
	<li>2本の遠心分離チューブの内容物を1つに結合し、ステップ2.1〜2.3を2回繰り返し、毎回30mlのdiH2Oで合計3回の洗浄を行います。最後のペレット再懸濁液の液量は4〜5 mlである必要があります><。
	この時点で、1:2のトレハロース:ポリマーの重量比を凍結保護剤として添加することができます(SEMイメージングのためにトレハロースを含まないナノ粒子の小さなアリコートを凍結します)。凍結プロセス中に形成される氷結晶は、粒子表面を損傷して凝集を誘発する可能性があり、トレハロースの含有は、PLGAナノ粒子の均一かつ完全な再懸濁を改善することが示されています13。</li>
	<li>ナノ粒子をあらかじめ秤量した5 mLの遠心分離チューブに移し、-80°Cで最低30分間凍結します。</li>
	<li>凍結した内容物が溶けないように素早く移動し、チューブのキャップを外し、上部を輪ゴムで上部に固定して上部を覆います。 **溶けた場合は、凍結乾燥機に入れる前に再凍結してください。</li>
	<li>5mlの容量で72時間凍結乾燥します。凍結乾燥粒子は、パラフィルムで包まれたチューブに-80°Cで保存します。</li>
</ol>
3. サイジングと表面形態
走査型電子顕微鏡
<ol>
	<li>SEM用のサンプルは、イメージングの日に準備する必要があります。SEMスタブに両面カーボンテープのストリップを置きます。油性マーカーは、後で参照できるようにスタブの金属部分にラベルを付けるために使用できます。</li>
	<li>金属ヘラを使用して、少量の凍結乾燥ナノ粒子を収集し、テープの表面全体に静かに広げます。スタブの表面をラボティッシュで磨くか、圧縮空気を使用して緩いナノ粒子を取り除きます。</li>
	<li>サンプルを金パラジウムで30〜120秒間スパッタコーティングします。スパッタ時間を長くすると、イメージングに適した表面が滑らかになりますが、表面の細かいディテールが失われる可能性があります。</li>
	<li>粒子を可視化するための一般的なパラメータは、5〜15 mmの作動距離、5〜12 kVのビーム強度、および1〜3のスポットサイズです。ビーム強度が高いと、サンプルが局所的に加熱され、粒子の表面形態が変化する可能性があります。マイクロ粒子は100倍の倍率で観察され、ナノ粒子は3,000倍の倍率で区別できます。</li>
	<li>理想的なサンプルは、スタブの平らな表面全体に粒子を均一にコーティングしたものです。場合によっては、凍結乾燥により二次構造(フレークや球体を含む)が生じることがあります。フレークの端、フレークがテープと出会う場所、または球体の上部に焦点を当てると、SEMで簡単に視覚化できる粒子を見つけるのに役立ちます。</li>
</ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

PLGA粒子は、通常、サイズ、封止材、表面特性などの粒子特性をカスタマイズできる方法であるシングルエマルジョンまたはダブルエマルジョンによって調製されます7。これらの特性やその他の特性は、溶媒の種類、供給比、乳化方法、乳化剤の種類など、多くの変数に依存します。しかし、私たちの経験では、1人の実験者が一貫した特性を持つ粒子を生成することは可能です。同じプロトコルを使用して、よく訓練された実験者は、平均直径317 nm±99、342 nm±112、298 nm±104、361 nm±110、339 nm±115、360 nm±123、および364 nm±110のナノ粒子の7つの別々のバッチを生成しました。よく訓練された実験者のバッチを平均すると、平均直径は340 nm±25、平均バッチ内標準偏差は110 nm±8になります。最初の実験者によって訓練された2番目の実験者は、同じプロトコルを使用して、平均直径328 nm±138のナノ粒子を生成しました。しかし、数か月間独立してナノ粒子を作っていた3人目の実験者は、同じプロトコルに従って平均直径220 nm±70のナノ粒子を製造しました。したがって、予想される直径範囲で粒子を作ることは可能ですが、これは微妙な実験技術の正確な複製に依存します。バッチをプールすることで、同一の凝集特性を持つナノ粒子を大量に生産できる可能性があります。たとえば、 in vitro または in vivo 研究のためにナノ粒子を表面修飾する場合、複数の(最大6)200 mgバッチを調製、洗浄、収集し、1つのチューブに混合し、次に表面修飾のために分割します。これにより、ナノ粒子サイズ、薬物負荷、電荷、および修飾に利用できる表面部位の割合が、2 つの治療グループ間で同等になります。別の例では、関心のある変数が、異なる薬剤がナノ粒子の異なるバッチにロードされる薬効である場合、薬物負荷の変動性を測定および制御することが重要です。製造された粒子のバッチごとに粒子特性を測定し、バッチ間のばらつきを制御するために実験を設計および再現することが重要です。
有機相と水相の完全なエマルジョンは、小さな粒子を形成するために重要です。ポリビニルアルコール(PVA)は、おそらく最も一般的に使用される乳化剤です。私たちや他の人々は、ビタミンE-TPGS9、PVA14、スパン15、ポロキサマー16 など、さまざまな乳化剤および安定化剤を使用してきました(PLGA粒子の製造に使用される幅広い薬剤の徹底的な議論については、Wischkeらによるレビューを参照してください 。適切に乳化されたポリマーは、均質な乳白色/不透明な溶液として現れます。貧弱な(または「壊れた」)エマルジョンは、巨視的な不均一性または粒度を示し、チューブ内で視覚的に異なる2つの層に分離することさえあります。これは一般に、ナノ粒子の形成に失敗したことを示しています。エマルジョンは、超音波装置にすぐに移送されない場合、ステップ1.9の後に破損する可能性があります。これが発生した場合は、均一になるまで再び渦を巻き起こし、すぐに超音波処理器に進みます。超音波処理ステップ(1.10)の後に分離は行われるべきではありません。粒子がより大きな水体積に分散されたら(ステップ1.11)、溶液は均一に不透明からわずかに半透明になるはずです。粒子サイズが小さくなるにつれて半透明の品質が増加し、非常に小さなナノ粒子では青色の色合いが観察される場合があります。粒子が薬物をカプセル化している場合、この色相は観察されない場合があります。エマルジョンが大きな水性に均一に分散しない場合、または粒状に見える場合は、実験を続行しないでください。粒子ペレットの外観とその凝集力に多少の変化が見られるのは正常です。一部のペレットは、穏やかな渦で再懸濁する場合がありますが、他のペレットは数分間のウォーターバス超音波処理を必要とする場合があります。再懸濁には5分以上かからないようにしてください。凍結乾燥された粒子は、綿のようなものから流動性のあるものまで、さまざまな質感をとることができます。
ナノ粒子材料としての PLGA の多くの利点の 1 つは、製造プロセスを最適化して、意図した用途に適したサイズの粒子を作成できることです。大きなナノ粒子は、小さなナノ粒子よりも疎水性薬物のより高い割合(ポリマーの重量に対して)をカプセル化しますが、薬物放出速度論も影響を受ける可能性があります18-20。ナノ粒子のサイズは、細胞による粒子の内在化のメカニズムや組織内の分布に直接影響し、送達効果に劇的な違いが生じる可能性があります。たとえば、単核食細胞システムは、体循環中の1μmを超える薬剤にタグを付けて除去します。小さなナノ粒子は、より大きなナノ粒子がタイトな細胞外マトリックスに閉じ込められる脳への直接注入に関心がある可能性があります。小さなナノ粒子の送達は、浸透および保持効果の強化を通じて腫瘍の受動的標的化を促進する可能性もあります。薬物のカプセル化効率は、特定の薬物の特性、粒子のサイズ、および乳化剤(つまり、水と溶媒への溶解度)によって大きく異なります。シングルエマルジョンとダブルエマルジョンは、薬物負荷とナノ粒子サイズにも影響します。シングルエマルジョンによる疎水性剤のカプセル化は、ダブルエマルジョン法と比較して、超小型ナノ粒子の生成に役立つ可能性があります。このトピック23-28 についての広範な議論のために、読者を他のリソースに誘導します。最後に、高速均質化を含む代替乳化法が利用可能であり、これらの他のアプローチは、特定の種類の薬物または薬物送達アプリケーションに利点を提供する可能性があります29。
単一エマルジョン法は、ナノ粒子の特性を変化させることができる幅広い製剤変数を変化させる機会を提供します。たとえば、代わりにジクロロメタン (DCM) を溶媒として使用すると、一般に、より広いサイズ分布を持つより大きなナノ粒子が生成されます。酢酸エチル(EtAc)は水に混和するため、一次エマルジョン中のポリマー液滴の表面張力が低下し、より小さなナノ粒子が生成されます。DCMは、同じ量のEtAcに置き換えることができます。代替溶媒または溶媒のブレンドを使用して、薬物のカプセル化と粒子特性を最適化できます。他の製剤パラメータも粒子サイズを変更することができます:例えば、溶媒量、溶媒:ポリマー比、超音波処理強度、または遠心分離の速度/時間を増やすと、すべて収集された粒子のサイズが減少します。順次遠心分離(例えば、高速で低速の遠心分離で大きな粒子を最初に除去し、その後、より長いスピンで超小さな粒子を回収する)またはろ過を行うことで、分画粒子のサイズを決定することができます。
ここでは、平均直径が220 nmから1.98 μmの範囲のPLGA粒子の調製を可能にする製剤パラメータについて説明します。PLGAで構成される粒子を製造するためのこれらの方法は、将来のドラッグデリバリーアプリケーションin vitro または in vivoのために粒子設計(サイズ、封止材、および表面特性)を最適化するために使用できます。

ポリマーは、過去数十年で、標的腫瘍治療1から免疫系の調節2に至るまでの用途で、ますます人気のある薬物送達手段となっています。ポリマーカプセル化または結合薬物は、ポリマー関連薬物が分解から保護されているため、自由に送達される薬物よりも効果的であることがよくあります。この保護は、生物学的半減期が長くなり、全身性の副作用が減少して有効性が向上する可能性があります3-5。
ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)は、ナノスケール送達システムの理想的な特性の多くを示し、カプセル化された薬剤の長期放出を提供し、乳酸およびグリコール酸の生体適合性生成物に分解します。PLGAにカプセル化された低分子、タンパク質、および核酸は、さまざまな疾患アプリケーション8で活性の向上を示しています。重要なことに、この材料プラットフォームは、粒子を特定の組織にターゲティングしたり、イメージング目的で、リガンドのサイズ、電荷、表面表示などの機能を簡単にカスタマイズできます。PLGAはすでに生分解性縫合糸の形でヒトで使用されているため(例:Purasorb、Purac Biomaterials、Vicryl、Ethicon Inc.)、臨床応用の可能性は高いです。
油水(シングル)または水-油水(ダブル)エマルジョンは、PLGAを使用して疎水性および親水性の薬物をマイクロスケールまたはナノスケールでカプセル化できる1つの方法です。簡単に言うと、PLGAは有機相(油)に溶解し、それを界面活性剤または安定剤(水)で乳化します。疎水性薬物は油相に直接添加されますが、親水性薬物(水)は、粒子が形成される前に最初にポリマー溶液で乳化される場合があります。高強度超音波処理バーストは、小さなポリマー液滴の形成を促進します。得られたエマルジョンをより大きな水相に加え、数時間攪拌すると、溶媒が蒸発します。硬化したナノ粒子を回収し、遠心分離により洗浄します(図1)。
ここでは、酢酸エチル(EtAc)を溶媒とし、ビタミンE-D-α-トコフェロールポリエチレングリコールコハク酸(TPGS)を乳化剤として、シングルエマルジョンとダブルエマルジョンを使用してPLGAナノ粒子を製造する技術について説明します。ビタミンE-TPGSの使用は、乳化およびカプセル化効率の改善を含む、安定化剤(例えば、ポリ(ビニルアルコール)、PVA)よりもいくつかの可能な利点を提供する。他のグループでは、がん細胞に一般的に過剰発現し、標的細胞から薬剤を放出することで薬剤耐性に寄与することが知られている膜貫通排出タンパク質であるP-gpの阻害など、ビタミンE-TPGSの利点が報告されています。さらに、走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して粒子を特性評価およびサイズ化する方法を示し、プロトコルの変更によるサイズ変更に関するさらなるガイダンスを提供します。

<table><tbody><tr><td>ポリ(乳酸-共-グリコール酸)&amp;nbsp; (PLGA)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>固有粘度: 0.55-0.75 dl/g</td></tr><tr><td>酢酸エチル (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>塩化メチレン (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビタミンE TPGS</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール</td><td></td><td></td><td>加水分解度 87-89%, 30,000-70,000 Da</td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波破砕機</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 705</td><td>700 W (超音波処理装置)</td></tr><tr><td>ソニケーターチップ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 in</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>マルチポジションスターラー</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>超遠心機</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>固定角ローター</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバスソニケーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

ビタミンe-tpgsとのシングルエマルジョンまたはダブルエマルジョンにより形成されるplgaナノ粒子

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)は、生分解性ポリマーの脂肪族ポリエステルファミリーの生体適合性メンバーです。PLGAは、特に吸収性縫合糸の形でヒトに使用することがすでにFDAに承認されているため、ドラッグデリバリーアプリケーションとして長い間人気のある選択肢でした。疎水性および親水性の薬物は、シングルエマルジョンまたはダブルエマルジョンを介してPLGA粒子にカプセル化されます。簡単に言えば、薬物をポリマーで溶解するか、有機相でポリマーで乳化し、次に水相で乳化します。溶媒が蒸発した後、粒子は凍結乾燥と長期保存のために遠心分離機で洗浄および収集されます。PLGAは水溶液中での加水分解によりゆっくりと分解し、カプセル化された薬剤は数週間から数ヶ月の期間にわたって放出されます。PLGAは薬物送達に多くの利点を持つ材料ですが、ナノ粒子の再現性のある形成は困難な場合があります。さまざまな機器、試薬バッチ、および乳化の正確な方法の使用により、かなりの変動性がもたらされます。ここでは、乳化剤ビタミンE-TPGSを使用して、シングルエマルジョンまたはダブルエマルジョンによって形成される微粒子およびナノ粒子の形成と特性評価について詳しく説明します。粒子の形態とサイズは、走査型電子顕微鏡(SEM)で決定されます。さまざまな乳化剤濃度で作製したナノ粒子の代表的なSEM画像、イメージングアーチファクトや乳化の失敗例を提供します。このプロトコルは、代替の乳化剤(ポリ(ビニルアルコール)、PVAなど)または溶媒(ジクロロメタン、DCMなど)の使用に容易に適合させることができます。

本プロトコルを用いて作製したPLGAマイクロ粒子およびナノ粒子の代表的なSEM画像を図 2a および 2bに示す。粒子は融合していない個別の球状として観察され、表面形態は平滑で、サンプル全体に広範囲のサイズ分布が見られる。
各バッチの平均粒径を決定するため、ImageJの「measure」機能を用いてSEM画像から直接測定を行います。代表的な粒径分布を得るには、視野内からランダムに選択した粒子について、少なくとも150箇所の粒径測定を行う必要があります。粒子のバッチごとの平均サイズは、処方パラメータに依存します。例えば、Figure 2aでは、PLGA 100 mgに対して溶媒 1 mlを用い、乳化相に0.05%のVitamin E-TPGSを使用することで、マイクロ粒子（平均粒径 730 nm±370）が形成されました。一方、Figure 2bでは、PLGA 200 mgに対して溶媒 4 mlを用い、疎水性薬剤であるcamptothecinを封入し、乳化相に0.3%のVitamin E-TPGSを使用することで、ナノ粒子（平均粒径 340 nm±70）が形成されました（詳細な処方パラメータは図の説明に記載されています）。一般的に、乳化剤の濃度が高いほど粒子は小さくなり、乳化剤濃度を0.3-0.01%の範囲で変化させることで、平均粒径 220-2,000 nmの範囲で制御することが可能です（Figure 3）。
収率は74-98%の範囲でした（1人の実験者が、異なる溶媒、乳化剤、および乳化条件を用いて調製した22バッチのナノ粒子）。小サイズのナノ粒子は、遠心分離および洗浄ステップ、特に洗浄上澄みをペレットから捨てる際に失われやすいため、より大きな（&gt;150 nm）バッチではより高い収率が得られる可能性があります。液を注意深くピペッティングすることで、この問題を回避できます。遠心分離の速度を上げるか、時間を長くすることでも、極小分画のナノ粒子の回収率を高め、かつペレットを緻密にすることで洗浄ステップでの損失を減らし、収率を向上させることができます。本プロトコルでは、乳化剤にTPGS、溶媒にEtAcを用いて粒子を製造することに焦点を当てていますが、代替の溶媒や乳化剤の使用も可能です。一般的に、EtAcはDCMよりも小さくサイズが均一なナノ粒子を生成することが分かりました（例：溶媒中のPLGA 100 mg/mlを2 mlの0.1% TPGSに乳化させた場合、粒子径はEtAcで540 nm±190、DCMで2,160 nm±1,530）。これは、おそらくEtAcが水混和性であるのに対し、DCMはそうではないためと考えられます。PVAは一般的によく用いられる乳化剤であり、当研究グループや他のグループでも広く使用されています。市販のPVAの異なるバッチを用いて調製したナノ粒子には、ばらつきがあることが観察されました。したがって、再現性を向上させるためには、可能な限り同じストックのPVAを使用することを推奨します。当グループの検討では、PVAはTPGSよりもはるかに高い濃度においてより効果的な乳化剤であることが分かりました（例：DCM中のPLGA 100 mg/mlを2 mlの5% PVAに乳化させた場合、粒子径は140 nm±48）。
SEMを用いたナノ粒子の特性評価は、装置やイメージングプロセスの違いにより困難な場合があります。したがって、粒子形成上の問題を示す形態学的特徴と、イメージング中に不注意に導入されたアーティファクトを区別することが重要です。SEM画像では、粒子の融合（図4aおよび 4b）、ディンプリング（図4c）、またはクラッキング（図4f）が観察されることがあります。これらのアーティファクトは、粒子が不適切に形成されたことを示す場合もありますが（e.g. 図4aでは、乳化剤濃度が高すぎたため独立した粒子が形成されなかった）、特性評価手法によって導入されたアーティファクトである可能性もあります（e.g. 図4bでは、スパッタコーティング中にサンプルが加熱され、図4cでは、イメージング中にSEMビームによる局所的な加熱が粒子の表面形態を変化させた）。イメージングアーティファクトを避けるためには、スパッタコーティング時間を最小限に抑え、ビーム強度を低く保つ必要があります。スパッタ時間を長くするとより滑らかな形態が観察されますが、これにより粒子の融合が誘発される可能性があります。一方で、スパッタ時間が短すぎると、粒子が帯電して画像キャプチャ中に移動するため、イメージングが困難になる場合があります。素早く画像をキャプチャすることで、長時間のビーム曝露と画像の歪みを避けることができます（図4dおよび 4e）。また、高強度のビーム曝露は、ナノ粒子表面の膨張やクラッキングを引き起こす可能性があります（図4f）。特性評価パラメータを変更しても形態学的アーティファクトを最小限に抑えられない場合は、それらがナノ粒子自体の真の問題を表している可能性があります。作製プロセスにおいて、融合は、高出力の超音波処理による過熱、溶媒の不完全な蒸発、洗浄工程中の不完全な再懸濁、または凍結乾燥の失敗に起因して起こる可能性があります。
<img alt="油水分離プロセス；超音波処理、蒸発、回収；凍結乾燥の図解。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 1"> 
図 1. ナノ粒子作製の概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。
<img alt="ナノ粒子の構造（SEM）および粒径分布（μm, nm）、比較分析チャート。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 2"> 
図 2. 単一乳化法で作製したPLGAマイクロ粒子およびナノ粒子のSEM像とそれに対応する粒径分布。(A)では、1 ml の酢酸エチルに溶解した 100 mg の PLGA を 2 ml の 0.05% Vitamin E-TPGS 中に乳化させ、45 ml の 0.01% Vitamin E-TPGS 中で硬化させて粒子を形成した。対応する粒径分布を(C)に示す。(B)では、4 mL の酢酸エチルに溶解した 200 mg の PLGA および 40 mg の camptothecin を 4 ml の 0.3% Vitamin E-TPGS 中に乳化させ、90 ml の 0.3% Vitamin E-TPGS 中で硬化させて粒子を形成した。対応する粒径分布を(D)に示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。
<img alt="粒子径解析。棒グラフとSEM画像は、マイクロスフェアのサイズに対するTPGS%の影響を示している。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図3"> 
図3. 粒子径は乳化剤濃度に依存する。 Vitamin E-TPGS濃度の増加により、ナノ粒子はより小さくなった。1 mlの酢酸エチルに溶解した100 mgのPLGAを、(A) 0.01%、(B) 0.05%、(C) 0.1%、または(D) 0.3%のVitamin E-TPGSに乳化させ、45 mlの0.3% Vitamin E-TPGS中で硬化させて調製した粒子の平均径と、対応するSEM画像を示す。エラーバーは、単一バッチの2枚の画像から得られた200回の直径測定の標準偏差を表す。スケールバーは、(A-C) 5 μm、(D) 200 nmを示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。
<img alt="粒子の形態と凝集を示すSEM顕微鏡写真。粉末微細構造解析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 4"> 
図 4. SEMで観察された表面形態のアーティファクト。(A)では、サンプル全体にわたって激しい融合とシート状の構造が見られた。Vitamin E-TPGSの濃度が高すぎたため（1%）、独立した粒子を形成できなかった。(B)では、サンプルの一部に融合が見られたが、特にスパッタコートに隙間がある箇所には、独立したナノ粒子の大きな領域が存在していた。これらの融合アーティファクトは、スパッタコート工程中の加熱によるものと考えられる。(C)では、粒子は当初滑らかに見えたが、サンプルをSEMビームに長時間さらした結果、ディンプル形成とラフリングが生じた。(D)は、サンプルへのSEMビーム照射を最小限にして撮影した低解像度の画像であり、粒子は丸い形態で滑らかに見える。(E)では、同じサンプルをより長時間照射しており、元の形態に明らかな歪みが観察される。(F)では、高電圧設定（12 kV）での長時間ビーム照射により、粒子の加熱と亀裂が生じた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。

ビタミンE-TPGSを乳化剤として使用して、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)で構成されるナノ粒子および微粒子の製造と特性評価について説明します。乳化剤の濃度などの配合パラメータを変化させることにより、平均直径が220nmから1.98μmの範囲のナノ粒子を製造することが可能です。

ビタミンE-TPGSとのシングルエマルジョンまたはダブルエマルジョンにより形成されるPLGAナノ粒子

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

本手順の全体的な目的は、サイズ調整可能なポリマーナノ粒子を形成することです。まず、ポリマーを有機溶媒に溶解させ、薬剤または蛍光封入剤を添加します。次に、乳化剤を含む水相でポリマーを乳化させ、溶媒が蒸発するにつれて、より大量の水溶液中で粒子を硬化させます。次に、粒子を洗浄し、遠心分離で回収して凍結乾燥し、長期保存します。最終ステップとして、走査電子顕微鏡（SEM）イメージングを用いて、ナノ粒子のサイズと表面形態を評価します。最終的に、乳化剤の濃度を変化させることでナノ粒子サイズを制御できることをSEMにより示します。粒子をカスタマイズすることで、持続的な作用を持つ幅広い治療剤を封入して標的組織へ届けることが可能になるため、この手法の意義はさまざまなヒト疾患の治療へと広がります。この方法を視覚的に実証することは極めて重要です。乳化の工程は、エマルション形成の細かな要因が粒子の特性に大きな影響を与える可能性があるため、習得が困難です。ナノ粒子調製を開始するには、約100 milligramsのポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）を13 by 100 millimeterの試験管に入れます。次に、ガラス製セロロジカルピペットを用いて1 milliliterのエチル酢酸をサンプルに添加し、試験管の上部をアルミホイルで覆い、さらにパラフィルムでホイルをしっかりと固定します。溶媒の蒸発を防ぐため、パラフィルムでバイアルの上端とホイルの下端をしっかりと巻いてください。試験管に溶媒の液面を印付けし、ポリマーを一晩かけて溶解させます。翌日、蒸発が見られる場合は溶媒を追加してください。超音波発生装置の近くにあるドラフトチャンバー内で、以下の器具および材料を準備します。ボルテックスミキサー、ゴムバルブ付きの小型ガラスパステールピペット2本、およびマグネチックスターラーを用意してください。さらに、超音波発生装置の下のスタンドに、氷水で満たした大きなビーカーを設置します。次に、0.3% w/v ビタミンE-T-P-G-S 45 mLを200 mLのガラスビーカーに加え、撹拌速度を360 RPMに設定します。続いて、0.3% w/v ビタミンE-T-P-G-S 2 mLを13 x 100 mmのガラス試験管に加えます。疎水性剤を混ぜ合わせるため、試験管の壁面に触れないように注意しながら封入剤をポリマー溶液に直接加え、封入剤が均一に分散するまでチューブをボルテックスします。親水性薬剤の場合、封入物をポリマー溶液で乳化させます。バッファーに溶解した薬液を最大 50 µL、ポリマー溶液の表面に加えます。混合液を氷上で約 10 秒間、または溶液が不透明で均質になるまで超音波処理します。次に、vitamin E-T-P-G-Sを入れた試験管を垂直に保持し、高速でボルテックスします。ガラス製パステールピペットをボルテックス中のチューブの上端から1〜2 cmに保ち、ポリマー溶液を表面にゆっくりと滴下してください。ポリマー溶液をすべて添加し終えるまで、ピペットがチューブの側壁に触れないように注意してください。溶液のボルテックス攪拌を続けます。ここで15秒間乳化させます。乳化したポリマーを直ちに超音波処理装置に移します。試験管を氷水に浸けたまま、エマルションを10秒間×3回の間隔でソニケーションします。均一にソニケーションが行われるよう、プローブを上下に動かし、プローブが試験管の側面や底に触れないようにしてください。溶液を冷却するため、10秒間のソニケーションごとに5〜10秒間休止してから次へ進んでください。次に、攪拌液から0.3% vitamin E-T-P-G-Sを1〜2 mL、エマルションに加えます。これにより乳化ポリマーの粘度が下がり、注ぎやすくなります。エマルションを攪拌液の中に流し入れます。試験管に残っている溶液をすべて攪拌液の中に洗い出してください。3時間攪拌してナノ粒子を硬化させます。封入剤が光感受性の場合は、ビーカーをアルミホイルで包みますが、溶媒の蒸発を促進させるため上部は開けておきます。ナノ粒子を回収するには、まずナノ粒子を公称容量30 mLのオークリッジ製遠心チューブ2本に等分し、重量差が0.1 g以内になるように調整します。その後、固定角ローターを用いて、17,000 ×gで15分間、ナノ粒子を遠心分離します。RC f. 遠心分離時間を長くすることで、より小さなナノ粒子の回収率を高めることができます。ナノ粒子のペレットを乱さないよう注意しながら、上澄み液を除去してください。5 mLの蒸留水を加え、ウォーターバス、ソニケーター、およびボルテックスミキサーを用いてナノ粒子を完全に懸濁させます。2本の遠心管の内容物を1本にまとめ、さらに20 mLの蒸留水を加えて全量を30 mLにします。その後、遠心分離と洗浄のステップをさらに2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。最後のペレット再懸濁液の液量は4〜5 mLにする必要があります。SEMイメージング用に、テロスフリーナノ粒子の少量分注液を、残りの液とは別に凍結保存します。PLGAナノ粒子の均一で完全な再懸濁のため、凍結保護剤としてポリマーに対して1〜2の重量比でTLOを添加します。これにより、粒子表面を損傷させ凝集を誘発する可能性のある氷結晶の形成を防ぐことができます。ナノ粒子をあらかじめ重量を量った5 mL centrifuge tubeに移し、-80 °Cで少なくとも30分間凍結させます。次に、チューブのキャップを取り外し、上部をラボペーパーで覆ってゴムバンドで固定します。融解が生じた場合に内容物が溶けないよう、迅速に操作します。ライオフィライザーに入れる前に再凍結し、5 mLのサンプルを72時間凍結乾燥させます。その後、キャップを閉めてチューブをラップで包み、凍結乾燥した粒子を-80 °Cで保存します。イメージング当日、SEMスタブに両面カーボンテープを貼り付けます。後で参照できるように、スタブの金属部分に油性マジックでラベルを付けます。金属製スパチュラを使用して、少量の凍結乾燥ナノ粒子を採取し、テープの表面に静かに広げます。ラボ用ティッシュでスタブの表面を掃くか、圧縮空気を使用して緩いナノ粒子を取り除きます。ビームの作動距離を5〜15 mm、加速電圧を5〜12 kV、スポットサイズを1〜3に設定して粒子を可視化します。ビーム強度が高すぎると、試料の局所的な加熱を招き、粒子の表面形態が変化する可能性があります。マイクロ粒子は100倍の倍率で観察し、ナノ粒子は3000倍で判別可能です。SEMで容易に可視化できる粒子を特定するため、球体の上部に拡大フォーカスを合わせ、粒子径と形態の代表的なサンプルを得るために、1バッチあたり少なくとも3枚の画像を収集します。この方法により、滑らかな表面形態を持ち、サンプル全体に広範囲なサイズ分布を示す、融合していない個々の球体として単一乳化で粒子を作成できます。ここで示しているマイクロ粒子の平均直径は730 nanometersです。ここでは、疎水性薬剤であるcampinを封入し、単一乳化法によって作成されたナノ粒子を示しています。これらの粒子はさらに小型化し、平均粒径は340 nmとなりました。乳化剤の濃度を高めることでより小さな粒子が生成され、平均粒径は2000 nmから200 nmまで減少しました。SEM画像に示されているように、乳化剤の濃度が0.01%から0.3%に増加するにつれて変化が見られました。しかし、ビタミンE-T-P-G-Sの濃度が高すぎると、1%のビタミンE-T-P-G-Sを使用した場合には個別の粒子が形成されず、構造全体にわたって激しい融合やシート状の構造が認められました。乳化法によるPLGナノ粒子の作製方法を習得すれば、表面修飾などの他の手法を用いて、特定の細胞型や体内領域と相互作用するようにナノ粒子を設計することが可能です。このビデオを視聴することで、乳化法を用いて再現性があり、サイズ調整可能な粒子を形成する方法について十分に理解することができます。

plga-nanoparticles-formed-single-or-double-emulsion-with-vitamin-e

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ビタミンE-TPGSを使用した単一または二重エマルジョンによって形成されるPLGAナノ粒子

マイクロバブルのInsonationは減少時間平均音響パワーで、同様に治療薬の標的化送達のための腫瘍切除のための有望な戦略である。本研究の目的は、皮下C6神経膠腫への非熱的血管アブレーションとペイロードの配信を最大にするためには、低いデューティサイクルの超音波パルス化戦略とナノキャリアを開発することである。...

コントラストの超音波は、薬剤ベアリングナノ粒子デリバリーと微小血管アブレーションを経由してマウスの神経膠腫の治療を対象と

この記事では、ジブロック共重合体を用いたポリマーをベースとしたナノ粒子を合成するナノ析出の方法を説明します。私たちは、ジブロックの合成共重合体、ナノ析出技術、及び潜在的なアプリケーションについて説明します。...

ナノ析出法を通じて、ジブロック高分子ナノ粒子の製剤

出典: Zhu, J., et. al., 神経成長因子カプセル化のための新規 HDL 模倣ナノ粒子の調製と特性評価。J. Vis.

高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子への神経成長因子のカプセル化

このプロトコルの目標は、両親媒性ブロック共重合体で構成されるミセル薬物送達システムにおける物理的に閉じ込められた難水溶性薬物の調製と特性評価を記述することです。...

調製とキャラクタリゼーション個々のとマルチ薬ロード物理的に捕捉さ高分子ミセル

ここでは、胎盤のコンドロイチン硫酸 A 結合ペプチド (plCSA BP) の合成のためのプロトコルを提案する-共役脂質高分子ナノ粒子を介してシングル...

胎盤のコンドロイチンの合成とキャラクタリゼーション (plCSA) の硫酸塩 - 脂質のターゲット設定 - 高分子ナノ粒子

フラッシュ NanoPrecipitation (FNP)...

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

この資料では、脂質被覆 74 nm ナノ粒子の falcarindiol...

ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

本研究では、ナノリポソーム調製の薄い脂質膜法を用いた古典的な水和を説明し、続いてナノ粒子の特性を説明する。47...

生体活性親水性球状タンパク質の捕捉に対するナノリポソームの調製と特性解析

脂質ナノ粒子は、mRNAおよびDNAカプセル化のためのマイクロ流体混合プラットフォームアプローチを用いて開発される。...

マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

このプロトコルは、注射可能な、上分子ポリマーナノ粒子(PNP)ヒドロゲルバイオマテリアルの合成および処方を記述する。これらの物質の薬物送達、バイオ医薬品安定化、細胞カプセル化および送達への応用が実証されている。...

細胞および薬物送達用途のための注射可能な高分子ポリマーナノ粒子ヒドロゲル

効率的なアジュバントを合理的に設計するために、ポリ乳酸-コグリコール酸ナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を開発しました。PNPEは、強力な細胞接触のための独特の柔らかさと疎水性界面を有し、ハイコンテント抗原ローディングを提供し、抗原提示細胞への送達システムの細胞親和性を改善し、抗原の効率的な内在化を誘導した。...

抗原インターナリゼーションを促進する粒子安定化エマルジョンの細胞親和性

学ぶPLGAナノ粒子の乳化法による調製技術。ビタミンE-TPGSを乳化剤として用い、濃度を変えることで220nmから1.98µmまでの粒径制御が可能です。走査型電子顕微鏡による評価方法も解説し、薬物送達システムの開発に応用できます。

ビタミンE-TPGSとのシングルエマルジョンまたはダブルエマルジョンにより形成されるPLGAナノ粒子

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