タンパク質A膜吸着体と合理化されたワークフローを用いたキメラヒトFc発現タンパク質の単離と特性評価

本手順の全体的な目的は、プロテインAメンブレンアブソーバーと効率化されたワークフローを用いて、キメラヒトFc発現タンパク質を効率的かつ効果的に単離および特性解析することです。まず、0.22 micronフィルタを用いて細胞培養上清を清澄化します。次に、フローシステムを組み立て、プロテインAメンブレンアブソーバーに細胞培養上清の灌流を開始します。

次に、ヒトFc発現タンパク質をメンブレンアブソーバーから溶出し、超ろ過によって得られたEITを濃縮し、続いて透析によるバッファー交換を行います。最終ステップとして、フローサイトメトリーとウェスタンブロッティングを用いて、濃縮タンパク質の品質と量を決定します。最終的に、プロテインAメンブレンアブソーバーと合理化されたワークフローを用いることで、プロテインA充填カラムを用いた従来のアフィニティークロマトグラフィーと比較して、処理時間の短縮とタンパク質収量の向上の可能性が示されました。

この手法のカラムアフィニティークロマトグラフィーなどの既存の手法に対する主な利点は、メンブレンアブソーバーを用いることで、処理時間を短縮しつつ、タンパク質をより高収率で回収できる可能性があることです。また、適切な特性評価方法を選択することでも処理時間を短縮できます。製造元の指示に従ってメンブレンアブソーバーを準備し、注入するすべての溶液が室温であり、0.22 micronフィルターでろ過されていることを確認してください。まず、10 milliliterのシリンジに0.22 micronフィルターでろ過したPBSまたはDPBSを満たし、気泡を取り除きます。

メンブレンアブソーバーに空気が混入しないようにするため、使用直前にDPBSを還流させ、保存液の除去とメンブレンアブソーバーの平衡化を行います。真空駆動式の0.22 micron滅菌ろ過ユニットを用いて、メンブレンアブソーバーへの還流直前に細胞培養上清をろ過し、Protein Aメンブレンアブソーバーに負荷させます。細胞培養上清をルアーロックシリンジに吸引し、気泡をすべて排出して、材料と装置を組み立てます。まず、シリンジをメンブレンアブソーバーの入口に接続します。

必要に応じて、メンブレンアブソーバーの出口に柔軟なチューブを接続します。シリンジとメンブレンアブソーバーの間に0.22 micronのシリンジフィルターを装着します。アブソーバーからの透過液を回収するために、フラスコまたはボトルを使用してください。

シリンジポンプを希望の体積流量に設定しますが、メーカーの推奨流量を超えないようにしてください。細胞培養上清を膜吸収剤に流し、透過液を回収します。必要に応じて、シリンジに上清を補充してください。

必要に応じて、ラボの好みに合わせてフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、またはELISAを用いて、通り抜け液中のタンパク質の有無を試験してください。通常、膜吸収体からタンパク質を溶出させるために通り抜け液を再還流させる必要はありません。まず、膜吸収体を 10 milliliters の DPBS で洗浄し、非結合タンパク質を除去します。その後、目的の流速で膜吸収体からタンパク質を溶出させます。

10～15 mLの溶出バッファーを使用します。溶出液量の10%の中和バッファーを含むチューブにEITを回収します。タンパク質の溶出後、製造元の指示に従ってメンブレンアブソーバーを再生してください。

4°Cでの長期保存のため、メンブレンアブソーバーをDPBSで調製した20%エタノールで満たします。すべてのEITを10 kilodalton分画分子量遠心ろ過ユニットに回収します。

遠心透析については、製造元の指示に従ってください。10 kilodaltonの分画分子量を持つ小容量透析ユニットを用い、任意のバッファーに対して透析を行います。透析後の試料にバッファーを追加する必要がある場合があります。

タンパク質の沈殿が懸念される場合は、目的のゲルを用い、還元または非還元条件下でSDS-PAGEを行い、精製タンパク質およびFC標準物質を分離します。ランタイムを最小限に抑えるため、ミニゲルではなくミニゲル（※原文ママ）を使用し、精製タンパク質のバンドシグナルがFC標準物質の線形シグナル範囲内に収まるよう、DPBSで希釈したサンプルを含む複数の量の精製タンパク質をロードしてください。ゲルでの分離後の画像解析において、製造元の指示に従い、セミドライブロッターを用いた不連続緩衝液系で、タンパク質をゲルからポリフッ化ビニリデン膜に転写します。転写時間は通常5～10分です。

転写効率を確認するため、転写後にゲルをクマシー染色します。真空補助式タンパク質検出装置を用い、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼを標識したanti FCまたはanti IgGを用いて免疫ブロッティングを行います。免疫ブロッティングにかかる時間は、通常1時間未満です。

任意の基質および方法を用いてイムノブロットを発色させます。画像解析により精製タンパク質を定量します。FC標準品のバンドシグナルを用いて線形回帰分析を行います。

R²が0.90より大きい場合は、直線の式を用いて、必要に応じてサンプルの希釈率を考慮しながら、バンドのシグナルからタンパク質量を算出してください。タンパク質の定量はfcに基づいて行われるため、タンパク質とfcの分子量差に応じて値を補正します。R²が0.90未満の場合は、迅速ウェスタンブロッティングの手順を繰り返してください。

最後に、機能的アッセイまたはフローサイトメトリーによるFC検出法を用いてタンパク質を検証します。開始細胞培養上清中の機能的GAL one HFCの存在を確認するために、ウェスタンブロッティングまたはEISAフローサイトメトリーを用いました。青色のヒストグラムで示されているのがその結果であり、赤色で示されている新鮮な細胞培養培地を陰性対照として使用しました。このヒストグラムに緑色で重なっているのはフロースルーであり、メンブレンアブソーバーがGAL one HFCを効率的に捕捉し、保持したことを示しています。GAL one HFCは、アミンベースの酸性バッファーを用いて1分あたり1 mLの速度で1 mLずつメンブレンアブソーバーから溶出されました。その後、中和された溶出分画を用いて、フローサイトメトリーにより機能的GG one HFCの存在をテストしました。GL one HFCのシグナルは、陰性対照とほぼ同等であった溶出液1から、EEU 3で最大となり、その後溶出液9および10でほぼ一定のレベルまで減少するという順次的な変化を示しました。

一部の吸着剤による保持のため、最終的なEEU 10はネガティブコントロールのシグナルと同等には至りませんでした。精製されたGL one HFCの定量および特性評価は、セミドライ転写と真空補助イムノブロッティングによって迅速化したウェスタンブロッティング法により実施されました。GA one HFCのシグナルをHFC定量標準と比較することで、精製物の量と質の両方が決定されました。

GAL one HFCおよび分解されたGAL one HFCのシグナルは、標準範囲内であった。HFC標準バンドのシグナル強度は、存在するHFCの量と線形関係にあった。画像処理に基づき、HFCによる精製GAL one HFCの濃度は450 micrograms per milliliterであると決定された。

G1HFCの分子量で補正します。精製物の濃度は720 µg/mLでした。対照的に、ここに示すウェスタンブロットのレーン6および7には、精製GAL1HFCが過剰にロードされており、HFC標準範囲を飽和または超過するシグナルが発生したため、定量化が不可能となりました。

ウェスタンブロッティングの代替として、クマシーゲル染色を迅速な品質管理チェックおよび定量方法として利用できます。分解したGAL1-HFCサンプルでは、約25 kilodaltonsおよび40 kilodaltonsのバンドに加えて、約10 kilodaltonsにバンドが存在していたことに注意してください。このバンドは分解したGAL1-HFCであり、ウェスタンブロットに使用した検出抗体とは反応しませんでした。

このビデオを視聴することで、メンブレンアブソーバーを用いてキメラヒトFC発現タンパク質を精製する方法と、それらのタンパク質をわずか4時間で特性評価する方法について十分に理解できるはずです。