Name: マウスにおける運動耐容能および心臓適応に関する化学的に誘発卵巣障害の影響を研究するための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: 学ぶ、VCDを用いてマウスに化学的誘発卵巣障害を導入し、運動耐容能と心臓適応を評価する方法。閉経後の心血管リスクと運動療法の基礎研究に有用です。

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この作品は、HL007249号Konhilasおよび心血管科学の学際トレーニンググラント（に授与NIHから国立とメンター研究科学開発賞（K01 AR052840）および独立科学者賞（K02 HL105799）によって、NIHの助成金（HL 098256）によってサポートされていました）。サポートは、アリゾナ大学のSarverハートセンターからとスティーブンM. Gootter財団から受信されました。

全ての実験は、住宅、動物の世話は、ガイドラインに付着し、アリゾナ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する2011年NIHガイドラインにプロトコルを用いて行った。 1。 4 - ビニルシクロヘキセンジエポキシドによる治療<ol><li> VCDの投与プロトコール：化学ドラフト内で、きれいなフラスコに、VCDの0.587ミリリットルを加えごま油で10mlに最終容量をしてから、静かに、カバーを反転させて混合し、パラフィルムで密封する。最大7日間、投与バイアルにソリューションを転送パラフィルムで、それをシールし、4℃で保存する。すべての試薬は、滅菌されていることを確認してください。 <ol><li> VCDは、胡麻油に溶解するように、車両制御などのごま油を使用してください。ストアVCD（MW = 140.2グラム/モル、密度= 1.09グラム/ ml）を-20℃で</li><li> VCDの注入プロトコル：生後2ヶ月では、重さや部屋の気性の毎日の腹腔内注射を投与し20日間連続して160ミリグラム/ kgの用量でatureのVCD。 2.5ミリリットル/ kgの容量で、ビヒクル溶液、ごま油と同様にして対照マウスに注射する。 注意：噴射期間中は、地元の感染の可能性を減らすために、注射部位を交互にしてみてください。注射のために必要な量を計算するには、次の式を使用します。ソリューションの体重（g）×キロ/千GX 2.5ミリリットル/キログラム=体積（ml）27 Gの針を用いて、約50ミリリットル/注射できるように注入するために。原因針のサイズに局所麻酔薬は必要ありません。 </li><li>発情周期のモニタリング：噴射期間が完了した後、膣スメアを取得することによって、日々の発情周期を監視する。背首筋法を用いて、マウスを拘束。 0.5cmの深さに、膣口に滅菌生理食塩水0.2ミリリットルをスポイトを挿入します。生理食塩水（3回）、粉砕すると、空白のスライド上に1滴を置く。すぐに顕微鏡で標準光microscを使用してサンプルを評価100Xの大きさで、OPE。 注：膣細胞診はサイクリングの損失を保証するため、卵巣不全を検証と判断された。図2（a）は 、一般的な膣のマウスでの発情周期の異なる段階間で細胞診、すなわち発情前期、発情期、発情後期、17〜19の発情を示している。発情前期の間に、細胞は、有核上皮細胞（ 図2A、矢印は、有核細胞を示す）が挙げられる;発情期の間、細胞は主に扁平上皮細胞角化され;発情は白血球の優位と、細胞型の混合によって特徴付けられる;発情間期は、白血球によって支配されています。焦点面の調整は、サンプル全体の細胞および核を可視化するために必要とされてもよい。 図2Bに示されるように、典型的なマウスの発情周期は4〜5日である。マウスは、持続的な発情間期における15日間連続した後に非環式と見なされます。連続してあたりの試験期間を通じて発情周期を監視するIODは、VCD処理マウスにおける発情周期の欠如を確認した。 </li></ol></li></ol> 2。自主的なケージホイール演習 近交系の​​C57BL / 6およびB6C3F1雌マウス、老齢7ヶ月は、自主的なケージホイールランニングにさらされている。 28日間ケージホイールに邪魔されないアクセスをケージ内に個別ハウス動物（47センチメートル×26センチメートル×14.5センチメートル）。 <ol><li>機器のセットアップ：ケージホイール装置は、車輪の回転によって活性化され、デジタル磁気カウンターを搭載した5.0センチメートル広い走行面11.5センチ径ホイールで構成されています。各車輪がテストを実行する前に、メーカーのガイドラインに従ってケージホイールを校正。 、走行輪の内側の直径を測定円周を計算し、ホイールサイズなどのデジタルカウンタにこの値を入力する。 <ol><li>テープを使用して、ホイールスタンドにデジタル磁気カウンタのコンピュータ部分を取り付けます。 </li><li>コンピューター入力端子を接続しますテープを使用して、ホイールスタンドにデジタル磁気カウンタのイオン。 </li><li>磁石が再び被害を噛んから磁石を保護するために十分にテーピング、コンピュータにケーブル接続と同じ側の中央のバーにデジタル磁気カウンタの自由なマグネットを取り付けます。ホイールの各回転は車輪の回転を完了するためのいかなる干渉や抵抗なくコンピュータによって記録されるように磁石を配置する必要があります。 注：ダクトテープを走行輪にデジタル磁気カウンタの部品を取り付けるために首尾よく使用されている。テーピングは完全に磁石をカバーし、動物が咀嚼による損傷を防止するのに十分であるべきである。磁石は、その動きを妨げることなく、車輪のできるだけ近くに配置されるべきである。しかし、セットアップはダメージを噛むために毎日監視し、必要に応じて修復する必要があります。 </li><li>動物用ケージの上部配線を介してホイールスタンドをスライドさせてケージに車輪を取り付けます。トンホイールスタンドを固定しますバインダークリップで、彼はケージの配線。 注意：クリップが離れて動物から、配線の上にある必要があります。ケージの配線を介してコンピュータ部分と余分なケーブルを通します。動物の手の届かないところにコンピュータと余分なケーブルを配置します。これは、中型プラスチックコンピュータと余分なケーブルを保持するためにケージの配線の上に皿を秤量配置することによって達成することができる。 </li></ol></li><li>演習：指定されたごみは、ランダムに定住制御や運動療法のいずれかにマウスを割り当てます。すべての動物を水と標準ハード齧歯類固形飼料を自由に与える。 <ol><li>手動磁気カウンタによって与えられた距離のRAN（キロメートル/日）および実行に費やされた合計時間（時間/日）、毎日、値を記録。同じ1時間の時間枠内で記録的距離と時間の値行使期間の28日間の期間を通して、正確で一貫性のある値のための毎日。クリア（ゼロ）正確な読み取りをフォローを確保するために、毎日の記録後の磁気カウンタ日ING。 </li><li>グループごとに距離と速度の平均値を計算します。各マウスについて、毎日、距離と時間の与えられた値に基づいて速度を計算します。データは、各測定されたパラメータについて毎日または毎週平均値として表示することができる。 </li></ol></li><li>組織の収穫：特定の行使期間の終了時に、吸入麻酔下で頸椎脱臼によりケージから取り出し、30分以内に行使し、座りがちな対照動物を安楽死させる。体重を量り取り、迅速に心臓、骨格筋、および卵巣を切除。 <ol><li>組織の収穫時には、マウントしてヘマトキシリンおよびエオシン（H &amp;E; 図2C）で収集された卵巣を染色。拡大して、カウントして、原始の一次、二次、または各VCD処理および対照動物20のための胞状卵胞として分類している。原始卵胞は小さな一次卵母細胞、密接に卵母細胞とは対照的に平坦化されたか、扁平顆粒膜細胞の単層、および基底が含まれていますラミナ。一次卵胞は、卵母細胞を取り囲む単一層に配置された1つ以上の立方顆粒膜細胞の存在によって定義される。二次卵胞は、顆粒膜卵母細胞の周りに複数の層を形成する細胞、および卵胞が含まれています。胞状卵胞は、流体を収容する空洞又は「洞」によって特徴付けられる。 </li><li>心を切除し、腹側の内側切開すると、振動板を開いた後、心臓を視覚化する。急速に冷リン酸緩衝生理食塩水に十分にウォッシュアウト残留心室血液中のベースと場所で心を切り出す。 、余分な組織の中心部をトリミング心臓全体の重さとスナップ凍結し、液体窒素中。 </li><li>修飾氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で、他のすべての切除された組織を洗浄し、スナップ凍結し、液体窒素で冷却したイソペンタン中。 </li></ol></li></ol> 3。強制トレッドミル運動<ol><li>強制運動パラダイムTを使用する場合O運動能力を測定し、トレッドミルを使用し、次のように設定： <ol><li>トレッドミルランプのベースに電気ショックグリッドを配置します。生成されたこのショックは、運動のための刺激として機能します。電気刺激の強度と頻度は、ユーザーが手動で制御する。グリッドは、有効または各レーンごとに個別に無効にすることができます。すべてのデータ収集は手作業で行われている。 </li><li>定期的に、メーカーのガイドラインに従って、トレッドミルのキャリブレーションを行います。 <ol><li>トレッドミルコントローラ前面パネルのトグルを「STOP」に設定されていることを確認してください。 </li><li>所定の位置にしっかり速度トレッドミルベルトレーン1をセンサとは、以下に示すような位置にねじナットで固定します。 </li><li>トレッドミルコントローラーのフロント·パネル上のダイヤルで、88.7メートル/分に速度を調整後、トレッドミルコントローラフロントパネルに2 Hzに電気刺激周波数を設定します。 </li><li>キャリブレーション手順を初期化するために「オドメーターリセット」ボタンを押してください。 <stronG&gt;注：定住やnonexercise対照群は、実験計画に含める必要があります。定住グループは、運動群にマッチした時代です。我々は以前の兄弟で収容された定住マウスと比較した場合に行使されたマウスと同じ大きさのケージ内に個別定住マウスが目的のパラメータに影響を与えなかったことハウジングを示している。したがって、座りがちなマウスを行使したマウスと同じ部屋に兄弟と一緒に保管された。 </li></ol></li></ol></li><li>順化：毎日実験前にトレッドミル3-7日にマウス順応。これを行うには、ベルトとトレッドミルでのマウス動かないとショック場所があるが（ノイズ）にベルトモータと、オフグリッド。少なくとも15分間、乱さマウスを残す。 </li><li>ウォームアップ：このプロトコルで使用されるように、次のようなステップをウォームアップ。 <ol><li>トレッドミル上で各マウスを置きます。ショックグリッドを無効にし、15分間4メートル/分にベルト速度を上げる。 </li><li>ショックグリッドを有効にして、ベルト速度を維持さらに10分間4m /分のベルト速度。 </li></ol></li><li>運動トレーニングレジメン<ol><li>ウォームアップに続いて、グリッドのショックを維持し、15分間、5m /分にベルト速度を増加させる。 </li><li>さらに15分間15メートル/分にベルト速度を上げます。 </li><li>訓練の後、戻ってケージにマウスを転送します。 注：本研究では、運動トレーニングを1週間毎日行った。 </li><li>急性運動療法：急性運動療法は、極度の運動負荷の短期的および長期的な影響を判断するために設計されています。 <ol><li>ウォームアップに続いて、10、15、20、25に5m /分のベルト速度を増加させ、30m /分、10分間隔で。 注：マウスが動作して続行するか、消耗や苦痛の徴候を示すことができない場合の練習を終了します。我々の研究では、ほとんどの動物は、25m /分で停止し、動物がまだ30m /分の段階を通過しなかった。 </li><li>各テストの間に2〜3日できるように、各マウスを3回テストします。すべてEXER全体の平均値を計算する各マウスのCISEセッション。 </li></ol></li><li>持久力のための運動療法：持久運動プロトコルはトレッドミル運動刺激に長時間露光のためにマウスを訓練するために設計されています。このタイプのプロトコルは、適度な運動ストレスの長期的影響に耐える能力を試験する。 <ol><li>ウォームアップ期間中に概略をベルト速度で始まり、4メートル/分。 </li><li>徐々に20μmの最終速度まで1m/minによりベルト速度を増加/分に達した。典型的な試験プロトコールの合計時間は50分である。 </li><li>運動療法の後、戻ってケージにマウスを転送します。 注：枯渇への実行マウスが回避される。実験中の任意の時点でマウスが枯渇の兆候を示した場合は、ショックグリッドを非アクティブにし、マウスは休息と回復することができます。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4。データと統計解析<ol><li>として今回の結果は、平均±SEMと2方向ANOVA（治療群とEXEを使用主な要因としてrciseは）学生 - ニューマンクールズ事後検定または平均値の差を比較するためにスチューデントのt検定を行った。 </li><li>定住グループの平均心臓質量に各行使動物の質量を比較することで、運動と心臓の質量の変化率（％）を決定します。心臓質量の差は、それぞれの動物について座りがちな動物からのパーセント変化として表される。 &lt;0.05のp値は統計的に有意であると考えられる。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ケージホイール運動とトレッドミル運動療法を実行して、両方のは、私たちのこれまでの研究16,21,22で使用されてきた。すべての動物は、環境または人間の妨害を最小限にするために、専用の練習室に保存されています。動物の外乱運動性能「生体リズムを大幅に動物の影響を与えることができる」と。このため、全体の動物の世話、パフォーマンスの監視と記録、運動レジメンは、同じ毎日の時間枠内で行う必要があります。調べでは、このようなストレス曝露の期間を制限し、適切なときにケージをカバーするなどの予防措置を示すことにより、動物に余分なストレスを避けるために努力すべきである。 ケージホイール演習 ケージホイール装置を製造する場合、マウスがマウントして終了するために、車輪が簡単にアクセスできる必要があります。そこにすべきホイールを中心に営巣し、周波数を妨げるからマウスを防ぐために、ケージの下部にある最小限の寝具E·ホイールの動き。マウスが行使されるようホイールの各回転をカウントするように磁気センサが、車輪の静止部分とフリーホイールに固定された磁石の上に置いた。磁気センサに取り付けられた記録装置がワイヤケージの蓋の上に配置されるべきであり、すべての露出されたワイヤが損傷を噛むに対する障壁を提供するように、マウスからテープ又は手の届かないところに保たれる必要があるいずれか。磁石と磁気センサは損傷し、不要な動きの両方を防止するために適切な構造体にテープで固定した。毎日のデータ収集中に、すべてのテープ線材は、密接にそのまま残り、必要に応じてretapedあるべき配線を保証するためにチェックする必要があります。マウスが新しい環境に順応し、定期的に運動を開始するのは、数日を要することがあるので、データ記録は、個々の動物に合わせて調整されるべきである。動物がホイールに多くの時間を費やす傾向にあるが、ランニングのほとんどが夜間に発生します。したがって、一部の動物はHIGを公開してもよい時間演奏活動彼らは昼間は休眠見えても。さらに、いくつかの動物が制限されたケージホイールランニングを示すことは珍しいことではありません。一般的に、平均的な1キロ/日以下にのぼるケージホイール活動がランダムなケージ活動の結果であり、大幅なランニング刺激に関連付けられていない。そのため、その稼働パラメーター1キロ/日または1時間/日以下である動物は、最終的なデータ解析nonrunnersで除外されるべきである。 個々の研究と関係するマウスの系統の特定の目的に依存して、運動の長さを変更することができる。我々の以前の研究では、関係する両方のマウス系統のため、平均車輪実行速度とケージホイールの運動の持続時間が徐々に経時的に増加し、4週間でプラトーに達したことを示した。 ケージホイールランニングは、一般的にストレスの少ない条件下で実施されているとした動物モデルでの自主的な運動の種類、である。 UNL特定のパラメータを事前に設定することが可能なのIKEトレッドミル運動は、すべてのテストケージに実行されている自主的かつ簡単に、環境や行動の手がかりの影響を受けている。大規模な実験群の番号が使用されていない限りそのため、異なる実験設定間の比較は、一般的に回避される。運動パラダイムのこのタイプの恩恵を受けることができる研究の他の潜在的な領域は、認知神経科学などの生理学的結果と行動反応を組み込む研究である。自主ケージホイールパラダイムを利用した研究のために、最も重要なステップは、ケージセットアップして、運動活動の監視している。 トレッドミル運動 順化工程はトレッドミル運動プロトコルのために動物を用意する必要がある。個々の研究の特定の目的に応じて、順応期間の持続時間は変化し得る。本研究では、一週間の期間は、動物がacclimできるように選択されたトレッドミル装置およびケージ内のモーターのノイズに食べた、ウォームアップ期間は運動トレーニング療法の重要なステップである。ヒト対応と同様に、マウスが負傷し、潜在的なデータアーティファクトを避けるために、任意の集中的な運動療法に入る前にウォームアップする必要があります。ショックグリッドは15分間オフにして、本研究では、我々は可能な最低速度（4メートル/分）でベルトを開始しました。関係するすべてのマウスは、ベルトのオンとオフの実行を開始した。ショックグリッドは、次いで、オンになって、ベルト速度/分で4メートルに維持した。過剰ストレスをマウスを回避するために、我々は穏やかなレベル（1 Hz）と、電気ショックを設定します。数日以内に、すべてのマウスは、トレッドミルベルトに適合した。 実行中の持続時間ならびに加速度は、各実験計画に合わせて調整することができる。推奨される開始加速度/分1メートルです。枯渇の兆しを見せてマウスのトレッドミルレーンはすぐにオフにする必要があります。一般的に枯渇の兆候はマイルが示す次のようにトレッドミル上のCEは、以下のとおりです。 <ol><li> &gt; 5月10日秒間ショックグリッドに連続暴露、 </li><li>シングル運動療法時のショックグリッド露出&gt; 5倍になる能力を実行しているの損失、および</li><li>少なくとも3xシングル運動療法中に&gt; 2秒間ショックグリッドの曝露をもたらし容量を実行しているの損失。 </li></ol>上記の値は、主に特定の実験のための指針として使用されるべきである。これらのパラメータは、マウス系統からのマウス系統、実験する実験、および研究者への研究者の間で変化などあらゆる運動プロトコルのために決定される必要がある。 ケージホイールの運動とは異なり、トレッドミルの研究では、走行性能の環境と生物学的要因の影響を排除するために数回繰り返されなければならない。それも、同じ動物のためのテストの間のパフォーマンスを実行しているの変動を見ることは珍しいことではありません。各運動療法はSTREにマウスを実行している公開されているのでssは、テストの間に適切な休息間隔が必要である。マウスが回復するために我々の経験では、各テストの期間休止2〜3日は十分であった。 ヒトトレッドミル運動と同様に、持久運動の速度は、最高の心拍数または血液酸素飽和度、マウスの研究と技術的に困難な偉業によって決定される。トレッドミル試験の最も重要なステップは、通常、個々のマウス間で変化枯渇の判定であり、80％の最大速度とした。枯渇のための基準は、主に主観的であるため、私たち自身の経験では、結果の記録を大幅に、個々の研究者の間で異なる場合があります。これにより、記録時に同じ基準の一貫した適用は非常に重要です。

閉経の自然な開始は、最終的には、卵巣の老化で、その結果、閉鎖によって卵巣の原始卵胞の枯渇によって特徴付けられる。米国では、女性の生涯の30％以上が、閉経後に費やされます。卵巣機能の低下に応じて、いくつかの生理学的および心理的な影響が増加肥満、血管不安定性、および気分や睡眠障害など、発生する可能性があります。そのため、閉経前のカウンターパート1,2と比較して増加し、肥満/肥満のため、閉経後の女性は、心血管疾患（CVD）3など、メタボリックシンドロームと関連する併存疾患、特に影響を受けやすい。また、CVD患者のための正常な心臓リハビリは、定期的な有酸素運動が含まれており、その運動は、これらの科目4,5における心血管疾患の罹患率と死亡率を減少させることがますます明らかになってきています。しかし、どのように運動能力のCHA前へ閉経後転移がよく研究されていない時にnges。さらに重要なことは、閉経後の女性におけるCVDリスクのための予防措置として、運動の役割は格段に代役のまま。 女性では閉経を模倣するために最も一般的に使用される誘導性モデルは、卵巣摘出（OVX）齧歯類である。最近では、職業化学4 -ビニルシクロヘキセンジエポキシド（VCD）は、特に、最終的には他の組織6で見られる明らかな毒性が卵巣不全で、その結果、閉鎖症の自然なプロセスを加速することにより、小さな一次および原始卵胞をターゲットにすることが示されている。人間の月経周期と類似しているVCD処理マウスの発情周期は、周囲への閉経後を模倣し、ひいては結果のエストロゲンの段階的撤退で、VCD注射が完了した後に、2〜3カ月以内に止まる移行。このように、卵胞デプリート、卵巣無傷動物は密接に天然のヒトに近似を通しての進行前に閉経に閉経後の移行7-9。さらに、このような感染症などの手術による合併症を減らすこと、OVXモデルへの非外科的な代替手段を提供します。本研究では、閉経期のマウスでは心臓の適応に対する運動の影響を研究するために、VCD誘発性の閉経マウスを用いた。 雌雄のげっ歯類10月13日におけるエストロゲンとケージホイールの運動との間の関連性を示唆しているいくつかのインスタンスがあります。外科OVXによるエストロゲン枯渇はマウスおよびラット14,15に自主的な運動活性を低下させる。運動の二つの方法がVCD誘発性閉経期のマウスの運動能力をテストするために本研究に使用した。ケージホイール走行は、一般に、動物モデルにおける自発的な運動の種類とみなされ、ストレスの少ない条件下では、おそらく、実行される。しかし、ケージホイールランニングexerciする動物を必要とする動物の相対的な運動能力、を示すものではありませんはるかに高いレベルでSE。強制トレッドミル運動、強度と耐久性を行使する耐性として測定運動能力を決定するために使用した。加えて、我々は以前にケージホイール運動は心肥大のための刺激を提供し、この肥大成長はセックス依存16であることを示している。そのため、我々はまた、VCD誘発の更年期マウスでのケージホイール運動に対する心臓の適応を測定した。

<table><tbody><tr><td>4-ビニルシクロヘキセンジポキシド(VCD)</td><td>シグマ</td><td>V-3630</td><td></td></tr> 直径<tr><td>11.5cmホイール、幅5.0cmの走行面</td><td>Petsmart</td><td>モデル6208</td><td></td></tr>デジタル<tr><td>磁気カウンター</td><td>シグマスポーツ</td><td>モデルBC600</td><td></td></tr><tr><td>トレッドミルエクササイズ</td><td>コロンバスインスツルメンツ</td><td>モデル1055SDRM</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける運動耐容能および心臓適応に関する化学的に誘発卵巣障害の影響を研究するための方法

A Method to Study the Impact of Chemically-induced Ovarian Failure on Exercise Capacity and Cardiac Adaptation in Mice

閉経後の女性におけるCVDリスクの予防措置が十分に研究されていないような心血管疾患（CVD）のリスクは、閉経後の女性に増加し、まだ、運動の役割。したがって、我々は、自主的なケージ輪運動や更年期マウスでの心臓適応に関する強制トレッドミル運動の影響を調査した。女性では閉経を模倣するために最も一般的に使用される誘導性モデルは、卵巣摘出（OVX）齧歯類である。しかし、OVXモデルは、ヒトにおける閉経から数相違点があります。本研究では、閉経期のマウスでは、運動の影響を研究するための代替閉経モデルとして卵巣不全を加速雌マウスへの4 - ビニルシクロヘキセンジエポキシド（VCD）を投与した。 VCDが選択的に密接ペリにするために事前に閉経後のヒトでの自然な進行を模倣内分泌状態となるプライマリおよび原始卵胞の損失を加速させる。運動に対する運動の影響を判断するために、容量及びVCD処置雌マウスにおける心臓の適応は、二つの方法が使用された。まず、自主ケージホイールにVCD処理および未処理のマウスのグループを露呈した。第二に、我々は、強度と耐久性を発揮するために許容範囲として測定別々のグループのVCD処理および未処理マウスでは運動能力を決定するために、強制的にトレッドミル運動を使用していました。

例えば、本研究で使用したような典型的な実験プロトコルを、 図1に示されている。 VCD治療の20日間連続して、次の、膣細胞診は、VCDを注射したマウスにおける周期性の有無を決定するために使用した;車両を注射したマウスもモニターした。発情周期におけるステージを膣スミアの上皮細胞、角化上皮細胞、および白血球の割合（ 図2A）によって決定した。だけ角化上皮細胞の存在は、マウスが発情したことを示し、したがって、依然としてサイクリングした。マウスでの発情周期は一般的に4日間続き、したがって、VCDは、動物に注射し、膣細胞診は、白血球（ 図2A）の大部分を明らかにしている、持続的な発情間期の15日後に非環式であると考えられた。 VCD処理マウスの発情周期が不規則になり、その後、VCD注入の開始（ 図2B）の後に、2〜3カ月以内に消滅</強い&gt;。 VCD卵巣組織は、対照と比較して、有意な萎縮を示した。高倍率では、プライマリおよび原始卵胞（ 図2C）の完全な枯渇を参照してください。 運動パフォーマンス上のVCD誘発性卵巣不全の効果をテストするために、我々は次の4〜6週間定住またはケージのどちらかの車輪運動グループに7ヶ月のVCDとビヒクル処置したマウス（2系統、C57BL / 6およびB6C3F1）を無作為化サイクリングの停止（ 図1）。毎日の運動値は、4週間の運動期間中、各行使動物のための時間と距離を記録した。距離、時間、速度の毎日の走行値の毎週の平均値を、ビヒクルまたはVCDで処置したC57BL / 6マウスについては、図3に示されている。我々は、C57BL / 6またはB6C3F1マウスのどちらかでのVCDと、ビヒクル処置群の間にケージホイールに毎日の平均時間、距離、速度によって測定された運動性能に大きな違いを見ていない株（ 図4A）。算出された車輪速度が徐々に実行して、以前16に示すように4週間の走行期間にわたって増加したが、実験群間の有意差はなかった。これらの研究は、自発的なケージホイール行使VCD誘発性卵巣障害の影響は、少なくとも2マウス系統を超越示している。 自発的なケージホイール運動プロトコルの継続時間の後に、身体形態計測を記録し、心臓を迅速に切除し、秤量した。我々は以前に自主的なケージホイールの運動が心臓16質量の増加を誘発することが示されている。ここで、我々はまた、絶対的な心臓重量（HW）によって測定し、HWは、脛骨の長さ（TL）（ 表1）に正規化されたケージホイールの運動に応答して心臓肥大を示している。定住の対応と比較した場合、絶対的な心の塊とHW / TL比は車両とVCDで処理したマウスでは有意に大きかった。しかし、measuはありませんでした自主ケージホイール運動後の制御やVCD誘発性卵巣不全のマウスの間、心肥大におけるrable違い。 次に、トレッドミル運動能力を決定するために実行して不随意（強制）を使用した。まず、消耗するまでの平均速度を段階的に10分毎に増大した高強度のプロトコルにマウスを供した。平均すると、媒体で処置したマウスの最大速度は26.7±0.95メートル/分であったとVCD処置したマウスの最大速度は枯渇する前に28±1.4メートル/分であった。我々は、持久力のためにアッセイするために20m /分（最大約80％）で動作する低強度を使用した。 図4Bに示すように、高または低強度の運動能力に有意差はVCD誘導性卵巣不全マウス運動能力に影響を及ぼさなかったことを示す、車両及びVCD処置群の間に認められなかった。 結論として、VCDの処理によって誘導閉経は、自発的または強制のどちらかRには影響しません<html> unning能力だけでなく、運動に対する心臓適応反応。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig1.jpg" /> 図1。VCD投与し、実験プロトコル。マウスは、VCD 20日間連続で生後2ヶ月から始まる（160 mg / kg）を、またはごま油（車両制御）を投与した。 VCDまたはビヒクル注射後、発情周期をモニターし、方法のセクションに記載のようにcyclicitiesを決定した。卵巣機能の喪失は、60〜90日以内に発生し、膣細胞診により確認した。生後7ヶ月で、マウスを4週間自主ケージホイール運動にさらされたか、トレッドミル運動プロトコルに供した。 oad/51083/51083fig2highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51083/51083fig2.jpg &quot;/&gt; マウスにおける図2のVCD誘発性卵巣不全A：発情周期の4段階を示す車両注射したマウスからの未染色の膣スメアの細胞診：1）発情前期、国連が特徴主に有核上皮細胞からなる2）発情、 - 核角化細胞;有核上皮細胞（矢印）、未有核角化上皮細胞（矢印）、および白血球からなる3）発情後期、;白血球の主になる4）発情間、;およびB：車両およびVCDを注射したグループの発情周期の平均長さ（日数）。 1サイクル発情中の次の期間の初日に発情中の最初の日から測定される。膣細胞診は、注射の開始後約6週間を開始しました。 VCDを注射した動物の発情周期は、車両を注射した動物に比べて、不規則になり。生後8ヵ月の時点で卵巣組織のH＆E染色：S、および12発情サイクルの後、すべてのVCDの細胞診は、サイクリング、C示さなくなった動物が注入されない。断面は、20Xの車両処理（左のパネル）およびVCD処理（右パネル）マウス（上のパネル）および200X（下のパネル）倍率のため5μmの厚さで行わ。 200Xの倍率で卵巣組織は、車両と比較して、VCD処置マウスには卵胞の数が表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51083/51083fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig3.jpg" /> 図3。車両やVCD処理C57BL/6J雌マウスの自主ケージホイールの性能。左のパネル：平均の走行距離（km /4週間の試験期間中、すべての1週間の期間の日） 中央のパネル：4週間の試験期間中、すべての1週間の期間の平均実行時 ​​間（時間/日） 右パネル：平均走行速度（キロメートル/時）のすべてのための4週間の試験期間にわたって1週間の期間。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51083/51083fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig4.jpg" /> 図4。自主ケージホイールと車両とのVCD処置マウスにおけるトレッドミルのパフォーマンス。 ：（上のパネル ）、C57BL / 6の平均走行距離（キロメートル/日）および4週間の試験期間中、24時間、ホイール（時間/日）に費やされた時間。 （ 下のパネル ）＆＃160; B6C3F1平均走行距離（km /日）および4週間の試験期間Bより、24時間、ホイール（時間/日）に費やす時間：C57BL / 6のトレッドミル実行しているパラメータ。最大時間方法の項に詳細なプロトコルを使用して（ 上のパネル ）と最高速度（Botoomパネル ）。

二つの運動パラダイムは、運動能力や運動に対する心臓の適応上の閉経の影響を調べるために新たに開発された化学的に誘発された更年期マウスモデルで試験した。

The risk of cardiovascular disease (CVD) increases in post-menopausal women, yet, the role of exercise, as a preventative measure for CVD risk in ...

本手順の全体的な目的は、卵巣における卵胞閉鎖の自然な過程を加速させ、それによって卵巣不全、エストロゲンの枯渇、および非サイクル状態の雌個体を作り出すことで、閉経に極めて近い状態を再現することです。これはまず、ビニルシクロジキシド（VCD）という化学物質を15〜20日間連続して投与することで達成されます。VCDは、小 primary follicles（一次卵胞）および primordial follicles（原始卵胞）の自然な閉鎖過程を加速させることで、これらを特異的に標的として破壊することが示されています。次のステップは、VCD投与開始から約6週間後に膣細胞診を開始し、エストルスサイクルおよび卵巣の周期性を判定することです。閉経および卵巣不全によるサイクルの消失を確認するため、腟細胞診により15日から20日間にわたる持続的なdsteまたは非サイクル状態が観察される必要があります。最終ステップは、随意的なケージホイール走行や心機能適応など、閉経または閉経への移行期によって影響を受ける可能性のある介入を実施することです。最終的に、随意的なケージホイール活動と心機能適応を用いて、閉経によってケージホイール活動が低下するかどうかを確認します。この手法の既存の方法（切除術など）に対する主な利点は、切除術がエストロゲンの急激な枯渇を招く外科的手順であるのに対し、本手法は閉経前後の移行期に起こる自然な進行性のエストロゲン喪失とは異なる点にあります。この手法の意義は、閉経後の女性における代謝性疾患および心血管疾患の治療にまで及びます。なぜなら、閉経後の女性は閉経前の女性と比較して、メタボリックシンドロームおよび心血管疾患を含むその関連併存疾患に対して特に罹りやすいためです。腟細胞診のステップでは、適切な塗抹技術の習得とESTサイクルの特定に細心の注意を払う必要があり、習得が困難であるため、本手法を視覚的に実演することは極めて重要です。4. ビニルシクロリンジオキシド（VCD）を-20°Cで保存します。注入プロトコルのためにVCDを調製するには、清潔な投与用バイアルに0.587 mLのVCDを加え、ゴマ油で最終容量を10 mLにし、パラフィルムで封印して緩やかに転倒混和します。4°Cで最大7日間保存してください。VCD投与プロトコルを開始するために、生後2ヶ月のマウス2匹を20日間連続で計量し、投与期間中は27ゲージの針を用いて、室温のVCDを160 mg/kgの用量で毎日腹腔内投与します。局所感染の可能性を低くするため、同様の方法で投与部位を交互に変更してください。投与期間の終了後、対照群のマウスには溶媒であるセサミオイルを2.5 mL/kgの容量で投与します。膣 smearsを採取し、estrus周期を毎日モニタリングします。本研究を成功させるための重要な要因の一つは、細胞診判定のために高品質な膣 smearsを採取することです。マウスを背側項皮把持法（dorsum scruff method）で固定します。0.2 millilitersの滅菌生理食塩水を充填した点眼瓶を、腟口から0.5 centimetersの深さまで挿入します。点眼瓶を用いて注入した生理食塩水を3回混ぜ合わせ、その後、1滴を空白のスライドグラスに滴下します。直ちに標準的な光学顕微鏡を用い、100 xの倍率で各サンプルを鏡検し、卵巣不全を確認します。続いて、VCDで閉経を誘導したマウスを運動実験に使用します。ケージホイール装置は、直径11.5 centimeterのホイールと幅5 centimeterの走行面で構成されており、ホイールの回転によって作動するデジタル磁気カウンターが装備されています。ホイール走行を開始する前に、製造元のガイドラインに従ってケージホイールの校正試験を行ってください。走行ホイールの内径を測定します。円周を算出し、この値をホイールサイズとしてデジタルカウンターに入力します。ホイールをケージに取り付ける際は、ホイールをスライドさせ、アニマルケージ上部のワイヤーに通してください。バインダークリップを使用して、ホイールスタンドをケージの金網に固定します。クリップは、動物から離れた金網の上部に取り付けてください。コンピューター部分と余分なケーブルは、ケージの金網の間を通して通してください。コンピューターと余分なケーブルを、動物の手の届かない場所に配置します。これは、ケージの配線の上に中サイズのプラスチック製量り皿を置き、コンピューターと余分なケーブルを固定することで実現できます。次に、デジタル磁気カウンターのコンピューター部分をホイールスタンドに取り付けます。ダクトテープを使用して、デジタル磁気カウンターのフリーマグネットを、コンピューターへのマグネットケーブルと同じ側のセンターバーに取り付けます。この際、マグネットが噛み込みによる損傷を受けないよう、十分にテープで固定してください。マグネットは、ホイールの各回転が、干渉や回転への抵抗なくコンピューターに記録される位置に配置する必要があります。ランニングホイールをホイールに取り付けます。ホイールスタンドの支柱をホイール中央バーの取付穴に挿入して固定します。ホイールが自由に回転できることを確認してください。装置は毎日、齧られたことによる損傷がないか監視し、必要に応じて実験向けに修理してください。生後7か月の近交系C57BL/6およびB6C3F1の雌マウスを、同一リッターから選び、運動群または座りっぱなしの対照群にランダムに割り当てます。実験動物は、47×26×14.5 cmのケージに個別に収容し、28日間、制限なくケージホイールを利用できるようにします。対照群の動物は、ホイールのないケージに共同で収容します。すべての動物に水と標準的なハード齧歯類用飼料を与えます。手動でリドを添加し、磁気カウンターで計測された走行距離と総走行時間の数値を毎日記録します。28日間の運動期間を通じて正確で一貫した値を得るため、毎日同じ1時間の時間枠内で距離と時間の値を記録してください。毎日の記録後、翌日の正確な読み取りを確実にするために磁気カウンターをリセットしてください。規定の運動期間終了後、組織採取前に安楽死させた動物の体重を記録します。心臓を摘出するために、腹側正中線を切開し、横隔膜を開いて速やかに心臓を確認します。心臓を根元から切除し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水に入れて、心室内に残った血液を十分に洗浄します。心臓から余分な組織を取り除き、心臓全体の重量を測定し、必要に応じて液体窒素で急冷凍結させます。追加の切除組織を採取し、修飾した氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、液体窒素で冷却したイソペンタン中で急冷凍結させます。本研究では、VCD処理により卵巣不全を誘発し、腟細胞診の顕微鏡検査によってこれを確認しました。エストルスサイクルの段階は、上皮細胞、定量された上皮細胞、および白血球の割合によって決定され、PROEsでは有核上皮細胞が優位になります。ここで矢印は有核細胞を示しています。発情期には、主に無核の扁平上皮細胞が定量化されます。メストラス期は、白血球が優位な混合細胞型によって特徴づけられます。ディアストラス期は、白血球が支配的となります。マウスにおけるエストラス周期は、VCD注入前は通常4日間です。持続的な発情休止期が15日間続いた場合、その動物は無周期であると見なされました。この図は、対照群（vehicle）およびVCD注入群におけるエストラス周期の平均日数を表しています。1サイクルは、発情期（ES）の初日から次の発情周期の初日までとして測定した。ESの腟細胞診は、注射開始から約6週間後に開始した。VCDを注射した動物のESTROサイクルは、溶媒を注射した動物と比較して不規則になることが観察され、12回のESTROサイクルの後、VCD注射プロトコルの完了時には、すべてのVCD注射動物の細胞診においてサイクルの消失が示された。卵巣組織切片のH&amp;E染色では、対照群と比較して、VCD処理した卵巣組織に有意な萎縮が認められた。20倍および200倍の倍率で観察したところ、VCD投与組織では一次卵胞および原始卵胞の完全な消失が認められました。VCD誘発性卵巣不全が運動能力に及ぼす影響を調べるため、2系統の7ヶ月齢のVCD投与マウスおよび溶媒投与マウスを用いて試験を行いました。4週間の運動期間中、運動させた各個体について、ホイール走行の1日あたりの時間と距離の値を記録しました。この図は、走行距離、時間、および速度の1日あたりの走行値の週平均を示しています。Vehicle投与群またはVCD投与群のC57BL/6マウスにおいて、1日平均走行距離およびホイール上での滞在時間で測定した運動パフォーマンスに、VCD投与群とVehicle投与群との間で有意な差は認められませんでした。これはC57BL/6およびB6C3F1の両マウス系統において同様でした。この結果は、VCD誘発性卵巣不全が自発的なケージホイール運動に及ぼす影響が、自発的ケージ運動プロトコルの期間終了後、少なくとも2つのマウス系統に共通して認められることを示しています。また、身体形態測定値を記録し、心臓を迅速に摘出して重量を測定しましたが、これらは以前の観察結果と一致していました。絶対心重量および脛骨長で標準化した心重量により、ケージホイール運動に応答した心肥大が観察されました。座位対照群と比較して、vehicle投与群およびVCD投与群では絶対心重量および心重量/脛骨長比が有意に大きかったものの、対照群とVCD誘発性卵巣不全群の間で心肥大に測定可能な差は認められませんでした。自発的なケージホイール運動後、最終的にVCD投与群およびvehicle投与群を対象に強制トレッドミル走行を行い、高強度および低強度の運動能力を測定しました。高強度プロトコルでは、マウスに疲労の兆候が現れるまで、ベルト速度を10分ごとに段階的に上げた。平均して、対照群（vehicle投与群）のマウスが疲労に至るまでの最大速度は26.7 ± 0.95 m/minであり、VCD投与群のマウスの最大速度は28 ± 1.4 m/minであった。持久力の評価には、20 m/minの低強度走行を用いた。平均して、対照群（vehicle投与群）のマウスが疲労困憊に達するまでの最大時間は28.3 ± 1.3分であり、VCD投与群のマウスは29.7 ± 1.4分であった。対照群とVCD投与群の間で、高強度または低強度の運動能力に有意な差は認められず、VCD誘発性卵巣不全がマウスの運動能力に影響を与えないことが示された。本手法の開発により、細胞、分子、および生理学分野の研究者が、げっ歯類における閉経の役割を探索する道が開かれた。このビデオを視聴することで、適切なVCD注射の実施方法、膣細胞診の行い方、および生理学的介入の導入方法について十分に理解することができるはずです。

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妊娠の確立は、複雑な胚と子宮のクロストークを含む動的なプロセスです。これらの過程に対する母体の子宮環境の正確な寄与は、依然として活発な研究分野である。ここでは、これらの研究課題に対処するための in vivo 動物モデルの設計を支援するための詳細なプロトコルが提供されています。...

卵巣摘出マウスモデルにおける妊娠確立への子宮寄与の研究方法

さまざまな性腺外組織および臓器における卵胞刺激ホルモン(FSH)は、複数の疾患の病因と関連しています。卵巣摘出術およびFSH処理マウスモデル(OVF)を使用して、FSHの性腺外作用を調べることができます。...

マウスモデルにおける卵胞刺激ホルモンの in vivo での独立効果の探索

このプロトコルでは、ミニポンプを使用して制御されたレトロゾール放出を通じて、マウスに多嚢胞性卵巣症候群 (PCOS)...

マウスにおける多嚢胞性卵巣症候群の誘導のための改良技術

この記事では、さまざまな心拍数での圧力/体積分析によるマウスの左心室機能の測定について説明します。...

ボーディッチ影響を調べる：圧力体積関係を測定するために、マウスにおける心臓カテーテル検査

この研究は、ヒトの骨格筋におけるミトコンドリア酸化的リン酸化的リン酸化）能力（OXPHOS）能力を定量化するin vivo phosphorus-31磁気共鳴分光法（31PMRS）技術の実現可能性を示しています。...

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツールインビボミトコンドリア酸化的リン酸化能力

学ぶ、VCDを用いてマウスに化学的誘発卵巣障害を導入し、運動耐容能と心臓適応を評価する方法。閉経後の心血管リスクと運動療法の基礎研究に有用です。

マウスにおける運動耐容能および心臓適応に関する化学的に誘発卵巣障害の影響を研究するための方法

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