マウスにおける運動耐容能および心臓適応に関する化学的に誘発卵巣障害の影響を研究するための方法

本手順の全体的な目的は、卵巣における卵胞閉鎖の自然な過程を加速させ、それによって卵巣不全、エストロゲンの枯渇、および非サイクル状態の雌個体を作り出すことで、閉経に極めて近い状態を再現することです。これはまず、ビニルシクロジキシド（VCD）という化学物質を15〜20日間連続して投与することで達成されます。VCDは、小 primary follicles（一次卵胞）および primordial follicles（原始卵胞）の自然な閉鎖過程を加速させることで、これらを特異的に標的として破壊することが示されています。次のステップは、VCD投与開始から約6週間後に膣細胞診を開始し、エストルスサイクルおよび卵巣の周期性を判定することです。

閉経および卵巣不全によるサイクルの消失を確認するため、腟細胞診により15日から20日間にわたる持続的なdsteまたは非サイクル状態が観察される必要があります。最終ステップは、随意的なケージホイール走行や心機能適応など、閉経または閉経への移行期によって影響を受ける可能性のある介入を実施することです。最終的に、随意的なケージホイール活動と心機能適応を用いて、閉経によってケージホイール活動が低下するかどうかを確認します。

この手法の既存の方法（切除術など）に対する主な利点は、切除術がエストロゲンの急激な枯渇を招く外科的手順であるのに対し、本手法は閉経前後の移行期に起こる自然な進行性のエストロゲン喪失とは異なる点にあります。この手法の意義は、閉経後の女性における代謝性疾患および心血管疾患の治療にまで及びます。なぜなら、閉経後の女性は閉経前の女性と比較して、メタボリックシンドロームおよび心血管疾患を含むその関連併存疾患に対して特に罹りやすいためです。腟細胞診のステップでは、適切な塗抹技術の習得とESTサイクルの特定に細心の注意を払う必要があり、習得が困難であるため、本手法を視覚的に実演することは極めて重要です。

4. ビニルシクロリンジオキシド（VCD）を-20°Cで保存します。注入プロトコルのためにVCDを調製するには、清潔な投与用バイアルに0.587 mLのVCDを加え、ゴマ油で最終容量を10 mLにし、パラフィルムで封印して緩やかに転倒混和します。4°Cで最大7日間保存してください。

VCD投与プロトコルを開始するために、生後2ヶ月のマウス2匹を20日間連続で計量し、投与期間中は27ゲージの針を用いて、室温のVCDを160 mg/kgの用量で毎日腹腔内投与します。局所感染の可能性を低くするため、同様の方法で投与部位を交互に変更してください。投与期間の終了後、対照群のマウスには溶媒であるセサミオイルを2.5 mL/kgの容量で投与します。

膣 smearsを採取し、estrus周期を毎日モニタリングします。本研究を成功させるための重要な要因の一つは、細胞診判定のために高品質な膣 smearsを採取することです。マウスを背側項皮把持法（dorsum scruff method）で固定します。

0.2 millilitersの滅菌生理食塩水を充填した点眼瓶を、腟口から0.5 centimetersの深さまで挿入します。点眼瓶を用いて注入した生理食塩水を3回混ぜ合わせ、その後、1滴を空白のスライドグラスに滴下します。直ちに標準的な光学顕微鏡を用い、100 xの倍率で各サンプルを鏡検し、卵巣不全を確認します。

続いて、VCDで閉経を誘導したマウスを運動実験に使用します。ケージホイール装置は、直径11.5 centimeterのホイールと幅5 centimeterの走行面で構成されており、ホイールの回転によって作動するデジタル磁気カウンターが装備されています。ホイール走行を開始する前に、製造元のガイドラインに従ってケージホイールの校正試験を行ってください。

走行ホイールの内径を測定します。円周を算出し、この値をホイールサイズとしてデジタルカウンターに入力します。ホイールをケージに取り付ける際は、ホイールをスライドさせ、アニマルケージ上部のワイヤーに通してください。

バインダークリップを使用して、ホイールスタンドをケージの金網に固定します。クリップは、動物から離れた金網の上部に取り付けてください。コンピューター部分と余分なケーブルは、ケージの金網の間を通して通してください。

コンピューターと余分なケーブルを、動物の手の届かない場所に配置します。これは、ケージの配線の上に中サイズのプラスチック製量り皿を置き、コンピューターと余分なケーブルを固定することで実現できます。次に、デジタル磁気カウンターのコンピューター部分をホイールスタンドに取り付けます。

ダクトテープを使用して、デジタル磁気カウンターのフリーマグネットを、コンピューターへのマグネットケーブルと同じ側のセンターバーに取り付けます。この際、マグネットが噛み込みによる損傷を受けないよう、十分にテープで固定してください。マグネットは、ホイールの各回転が、干渉や回転への抵抗なくコンピューターに記録される位置に配置する必要があります。

ランニングホイールをホイールに取り付けます。ホイールスタンドの支柱をホイール中央バーの取付穴に挿入して固定します。ホイールが自由に回転できることを確認してください。

装置は毎日、齧られたことによる損傷がないか監視し、必要に応じて実験向けに修理してください。生後7か月の近交系C57BL/6およびB6C3F1の雌マウスを、同一リッターから選び、運動群または座りっぱなしの対照群にランダムに割り当てます。実験動物は、47×26×14.5 cmのケージに個別に収容し、28日間、制限なくケージホイールを利用できるようにします。対照群の動物は、ホイールのないケージに共同で収容します。

すべての動物に水と標準的なハード齧歯類用飼料を与えます。手動でリドを添加し、磁気カウンターで計測された走行距離と総走行時間の数値を毎日記録します。28日間の運動期間を通じて正確で一貫した値を得るため、毎日同じ1時間の時間枠内で距離と時間の値を記録してください。毎日の記録後、翌日の正確な読み取りを確実にするために磁気カウンターをリセットしてください。

規定の運動期間終了後、組織採取前に安楽死させた動物の体重を記録します。心臓を摘出するために、腹側正中線を切開し、横隔膜を開いて速やかに心臓を確認します。心臓を根元から切除し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水に入れて、心室内に残った血液を十分に洗浄します。心臓から余分な組織を取り除き、心臓全体の重量を測定し、必要に応じて液体窒素で急冷凍結させます。

追加の切除組織を採取し、修飾した氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、液体窒素で冷却したイソペンタン中で急冷凍結させます。本研究では、VCD処理により卵巣不全を誘発し、腟細胞診の顕微鏡検査によってこれを確認しました。エストルスサイクルの段階は、上皮細胞、定量された上皮細胞、および白血球の割合によって決定され、PROEsでは有核上皮細胞が優位になります。

ここで矢印は有核細胞を示しています。発情期には、主に無核の扁平上皮細胞が定量化されます。メストラス期は、白血球が優位な混合細胞型によって特徴づけられます。ディアストラス期は、白血球が支配的となります。

マウスにおけるエストラス周期は、VCD注入前は通常4日間です。持続的な発情休止期が15日間続いた場合、その動物は無周期であると見なされました。この図は、対照群（vehicle）およびVCD注入群におけるエストラス周期の平均日数を表しています。

1サイクルは、発情期（ES）の初日から次の発情周期の初日までとして測定した。ESの腟細胞診は、注射開始から約6週間後に開始した。VCDを注射した動物のESTROサイクルは、溶媒を注射した動物と比較して不規則になることが観察され、12回のESTROサイクルの後、VCD注射プロトコルの完了時には、すべてのVCD注射動物の細胞診においてサイクルの消失が示された。卵巣組織切片のH&E染色では、対照群と比較して、VCD処理した卵巣組織に有意な萎縮が認められた。

20倍および200倍の倍率で観察したところ、VCD投与組織では一次卵胞および原始卵胞の完全な消失が認められました。VCD誘発性卵巣不全が運動能力に及ぼす影響を調べるため、2系統の7ヶ月齢のVCD投与マウスおよび溶媒投与マウスを用いて試験を行いました。4週間の運動期間中、運動させた各個体について、ホイール走行の1日あたりの時間と距離の値を記録しました。この図は、走行距離、時間、および速度の1日あたりの走行値の週平均を示しています。

Vehicle投与群またはVCD投与群のC57BL/6マウスにおいて、1日平均走行距離およびホイール上での滞在時間で測定した運動パフォーマンスに、VCD投与群とVehicle投与群との間で有意な差は認められませんでした。これはC57BL/6およびB6C3F1の両マウス系統において同様でした。この結果は、VCD誘発性卵巣不全が自発的なケージホイール運動に及ぼす影響が、自発的ケージ運動プロトコルの期間終了後、少なくとも2つのマウス系統に共通して認められることを示しています。また、身体形態測定値を記録し、心臓を迅速に摘出して重量を測定しましたが、これらは以前の観察結果と一致していました。

絶対心重量および脛骨長で標準化した心重量により、ケージホイール運動に応答した心肥大が観察されました。座位対照群と比較して、vehicle投与群およびVCD投与群では絶対心重量および心重量/脛骨長比が有意に大きかったものの、対照群とVCD誘発性卵巣不全群の間で心肥大に測定可能な差は認められませんでした。自発的なケージホイール運動後、最終的にVCD投与群およびvehicle投与群を対象に強制トレッドミル走行を行い、高強度および低強度の運動能力を測定しました。

高強度プロトコルでは、マウスに疲労の兆候が現れるまで、ベルト速度を10分ごとに段階的に上げた。平均して、対照群（vehicle投与群）のマウスが疲労に至るまでの最大速度は26.7 ± 0.95 m/minであり、VCD投与群のマウスの最大速度は28 ± 1.4 m/minであった。持久力の評価には、20 m/minの低強度走行を用いた。

平均して、対照群（vehicle投与群）のマウスが疲労困憊に達するまでの最大時間は28.3 ± 1.3分であり、VCD投与群のマウスは29.7 ± 1.4分であった。対照群とVCD投与群の間で、高強度または低強度の運動能力に有意な差は認められず、VCD誘発性卵巣不全がマウスの運動能力に影響を与えないことが示された。本手法の開発により、細胞、分子、および生理学分野の研究者が、げっ歯類における閉経の役割を探索する道が開かれた。

このビデオを視聴することで、適切なVCD注射の実施方法、膣細胞診の行い方、および生理学的介入の導入方法について十分に理解することができるはずです。