マウスにおける運動耐容能および心臓適応に関する化学的に誘発卵巣障害の影響を研究するための方法

この手順の全体的な目標は、卵巣の卵胞性閉鎖症の自然なプロセスを加速し、それによって卵巣不全、エストロゲンの枯渇、および閉経を密接に模倣した状態である非循環女性をもたらすことです。これは、最初に15〜20日間連続して投与することによって達成されます 二酸化ビニルまたはVCDの職業化学物質は、小さな一次および原始卵巣卵胞を特異的に標的にして破壊することが示されています 彼らの自然な閉鎖過程を加速することによって。2 番目のステップは、VCD 注射の開始から約 6 週間後に開始する膣細胞診により、睾殻周期と卵巣周期を決定することです。

15〜20日間の持続的なDSTEまたは非サイクリングは、サイクリングの喪失と卵巣不全を確認するために、膣細胞診によって観察されなければなりません。最後のステップは、自発的なケージホイール運動や心臓の適応など、更年期障害または更年期への移行によって影響を受ける可能性のある介入を実施することです。最終的に、自発的なケージホイール活動と心臓適応を使用して、更年期障害がケージホイール活動を低下させるかどうかを示します。

この技術の主な利点は、エクトミーなどの既存の方法よりも、エクトミーは、閉経前の移行中に発生するエストロゲンの自然な進行性の喪失とは異なり、エストロゲンの突然の枯渇をもたらす外科的処置であるということです。閉経後の女性は、閉経前の女性に比べてメタボリックシンドロームおよびそれに関連する併存疾患を含む心血管疾患に特に敏感であるため、この技術の意味は閉経後の女性の代謝および心血管疾患の治療にまで及びます。適切な塗抹技術とESTサイクルの同定を実行するために注意を払う必要があるため、膣細胞診のステップを学ぶのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。

4、二酸化ビニルサイクリンまたはVCDは、摂氏マイナス20度で保存されます。注入プロトコル用のVCDを準備するには、クリーンな投与バイアルにポイント587ミリリットルのVCDを追加し、ゴマ油カバーで最終容量を10ミリリットルにし、パラメータで密封し、穏やかに反転させて混合します。摂氏4度で最大7日間保管します。

VCD 注射プロトコルを開始するには、生後 2 か月の 2 匹のマウスの体重を 20 日間連続して測定し、注射期間中に 27 ゲージの針を使用して、1 キログラムあたり 160 ミリグラムの用量で室温 VCD の腹腔内注射を毎日投与します。同様の方法で局所感染の可能性を減らすために、注射部位を交互にしてみてください。注射期間終了後、制御マウスにビヒクル溶液ゴマ油を2.5ミリリットル/キログラムの量で注入します。

膣塗抹標本を取得して、esraサイクルを毎日監視します。この研究の成功に重要な要因の 1 つは、細胞診測定のための高品質の膣塗抹標本を取得することです。背筋法を使用してマウスを拘束します。

0.2ミリリットルの滅菌生理食塩水を入れたスポイトを膣口に0.5センチメートルの深さまで挿入します。注入した生理食塩水をスポイトと3回混合し、次に空白のスライドに1滴入れます。標準的な光学顕微鏡を使用して、100 x magnitudeで各サンプルを顕微鏡ですぐに評価し、卵巣の障害を検証します。

続いて、VCD誘導閉経期マウスを運動実験に用いる。ケージホイール装置は、直径11.5cmのホイールと幅5cmの走行面で構成されており、ホイールの回転によって作動するデジタル磁気カウンターが装備されています。各ホイールを作動させる前に、メーカーのガイドラインに従ってケージホイールをテストキャリブレーションします。

走行中のホイールの内径を測定します。円周を計算し、この値をホイールサイズとしてデジタルカウンターに入力してホイールをケージに取り付け、ホイールをスライドさせます。動物用ケージの上部の配線を通します。

ホイールスタンドをバインダークリップでケージ配線に固定します。クリップは、動物から離れた配線の上部に配置する必要があります。コンピューター部分と余分なケーブルをケージの配線に通します。

コンピュータを動物の手の届かないところに余分なケーブルを置きます。これは、コンピュータが余分なケーブルを保持するために、ケージの配線の上に中型のプラスチック製の計量皿を置くことによって達成できます。次に、デジタルマグネティックカウンターのコンピューター部分をホイールスタンドに取り付けます。

ダクトテープを使用して、デジタル磁気カウンターのフリーマグネットを、マグネットケーブルがコンピューターと同じ側の中央バーに取り付けます。繰り返しになりますが、磁石を噛む損傷から保護するのに十分なテーピングを行います。磁石は、ホイールの各回転がコンピューターによって記録され、完全なホイール回転に対する干渉や抵抗なしに配置する必要があります。

走行ホイールをホイールに取り付けます。ホイールスタンドポストをホイールの中央バーにある取り付け穴に挿入して立ちます。ホイールが自由に回転できることを確認してください。

セットアップは、咀嚼損傷について毎日監視し、必要に応じて修理する必要があります 近親交配 生後7か月のC 57、黒6、およびB 6 C3 F1雌マウスは、所定の同腹仔から、運動レジメンまたは座りがちな制御のいずれかにランダムに割り当てられます。実験動物はお一人様はどうですか?47 x 26 x 14.5センチメートルのケージで、ケージホイールに28日間邪魔されずにアクセスできるため、制御動物はホイールのないケージに一緒に収容されます。

すべての動物に水と標準的な硬いげっ歯類のチャウを与えます。Add lidoは、磁気カウンターによって与えられた走行距離とランニングに費やした合計時間の毎日の値を手動で記録し、運動期間の28日間を通じて正確で一貫した値を得るために、毎日同じ1時間の時間枠内の距離と時間の値を記録します。毎日の録音後、磁気カウンターをクリアして、翌日の正確な読み取りを確保します。

特定の運動期間の終わりに、安楽死させた動物の体重は、組織採取前に記録されます。心臓を運動させるには、腹側の内側を切開し、横隔膜を開いて心臓を急速に視覚化します。心臓の基部を切除し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水に入れて、残留心室血を十分に洗い流します 余分な組織の心臓を切り取り、心臓全体の重さを量り、必要に応じて液体窒素で凍結します。

追加の物品排出ティッシュを収集し、改質氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、液体窒素で冷却したスナップフリーズとイソップペンタンで洗浄します。この研究では、卵巣不全はVCD治療によって誘発され、膣塗抹標本の顕微鏡検査によって確認されました。esraサイクルの段階は、上皮細胞、定量化された上皮細胞、およびPROEの有核上皮細胞が優勢な白血球の割合によって決定されます。

ここで、矢印は、エストロ細胞が主に非有核定量扁平上皮細胞である間の有核細胞を示しています。Maestrosは、白血球が優勢な細胞タイプの混合物によって特徴付けられます。Diastrousは白血球によって支配されています。

マウスのエストロサイクルは、通常、VCDが注射される4日前に続きます。動物は、15日間の持続的な悲惨な状態の後、非周期的であると見なされました。この図は、車両とVCDインジェクショングループのest追加サイクルの平均長さ(日数)を示しています。

1つのサイクルは、ESの初日から次の期間の初日まで測定されます。ESでは、膣細胞診は注射開始から約6週間後に開始されました。VCD注射動物のESTROサイクルは、ビヒクル注射動物と比較して不規則になり、12回のエストロサイクル後、すべてのVCD注射動物の細胞診は、VCD注射プロトコルの完了時にサイクリングを示さなくなり、卵巣組織断面のHおよびe染色は、VCD治療卵巣組織に有意な萎縮を明らかにしました対照と比較して。

20倍倍、倍率200で見ると、VCD処理組織では一次卵胞と原始卵胞の完全な枯渇が観察されました。ビヒクルで処理された組織とは対照的に、VCD誘発性卵巣不全が運動パフォーマンスに及ぼす影響を7か月齢のVCDでテストし、ビヒクルで処理したマウスを2系統の毎日のケージホイール運動値で記録しました 4週間の運動期間中、各運動動物の時間と距離について記録されました。この図は、距離、時間、速度の毎日のランニング値の週平均を示しています。

C 57については、車両またはVCDのいずれかで治療された黒6匹のマウスでは、C 57、黒6またはB 6 C3 F1口系統のいずれかのVCDと車両治療群との間の1日の平均走行距離および車輪に費やされた時間によって測定された運動性能に有意差は観察されなかった。これは、VCD誘発性卵巣不全の影響を示しています 自発的なケージホイール運動は、自発的なケージ運動プロトコルの期間に続いて、少なくとも2つの口の緊張を超えます。身体形態測定法が記録され、心臓は迅速に切除され、以前の観察結果と一致する重量が測定されました。

ケージホイール運動に応答した心肥大は、絶対心重と脛骨の長さに正規化された心臓重量によって測定されました。座りがちなマウスと比較した場合、ビヒクルおよびVCD治療マウスでは、絶対心質量と心臓重量と脛骨の長さの比率が有意に高かったが、コントロールとVCD誘発性卵巣不全との間の心肥大に測定可能な差はなかった。自発的なケージホイール運動に続いてマウス、最後に、VCDおよびビヒクル処理されたマウスを強制トレッドミル走行に供し、高強度および低強度の運動能力を決定した。

高強度プロトコルでは、マウスが疲労の兆候を示すまで、平均ベルト速度を10分ごとに段階的に増加させました。平均して、ビヒクル処理マウスの最大速度は毎分26.7±0.95メートルであり、VCD処理マウスの最大速度は毎分28メートル±1.4メートルであった。毎分20メートルで低強度で走っているのは、持久力のアッセイに使用されました。

平均して、ビヒクル処理マウスの最大時間は28.3±1.3分であり、VCD処理マウスの最大時間は疲労前29.7±1.4分であった。ビヒクルとVCD治療群との間に高強度または低強度の運動能力に有意差は見られず、VCD誘発性卵巣不全がマウスの運動能力に影響を与えなかったことを示しています。その開発後、この技術は、細胞科学、分子科学、生理学の分野の研究者が更年期障害とげっ歯類の役割を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、適切なVCD注射の実施方法、膣細胞診の実施方法、および生理学的介入の実施方法について十分に理解しているはずです。