Name: 相互作用するリガンドおよび/またはアンタゴニストと、哺乳動物核内受容体残基を同定するために逆酵母ツーハイブリッドシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶ酵母ツーハイブリッドアッセイを用いて、ケトコナゾールとPXRの相互作用を解析し、薬剤耐性を示す変異を同定する方法です。核内受容体のリガンド結合メカニズム解明に貢献します。

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この作品は、衛生研究所（NIH）の国立研究所によってサポートされていましたCA127231と（SM）のデイモンラニヨン財団臨床研究者賞（CI 1502）を付与します。我々は彼らの機関やプロトコルの標準化へのこの技術の移植性を議論に彼の有用な洞察のためパラツキー大学オロモウツ、チェコ共和国からの教授ズデニェクドヴォルザークに感謝したいと思います。

1。酵母ベクターにおけるPXRとSRC-1融合の構築<ol><li>ヒトPXR LBD（107から434アミノ酸）およびヒトSRC-1完全長（アミノ酸1から1401）のPCR増幅。 <ol><li> SRC-1テンプレートとしてをpCMX-SRC1プラスミドを使用し、PXR LBDテンプレートとしてのpSG5-hPXRプラスミド8を使用してください。 </li><li>雪解けのPCRのSuperMix、DNAテンプレートとプライマーは（材料を参照）、氷上で保管してください。 </li><li> 0.25μgの/μLDNAテンプレート1μL、10 mMのプライマー対2μLそれぞれ、PCR法のSuperMix 45μL追加し、50μlに全量を、H 2 Oを加える。 </li><li> 2分2分、30秒、94℃で20サイクル、30秒、55℃、72℃、94℃の1サイクルでのPCRを設定し、拡張のための10分間の72℃での1サイクル。 1％アガロースゲル上で実行して、PCR産物を確認する。 </li></ol></li><li> PCR産物は、Y2Hベクターにクローニングする。 <ol><li> 1％アガロースゲルからPCR産物を精製する。ダイジェストPXR、LBD、PCR、およびY2HベクトルpSH2-1とBamHIとSalIで、NotΙとSalΙとSRC-1 PCRおよびY2HベクトルpGADNOTを消化。これを行うには、30μlに全量を最終的に1μgのDNAを、3μLの10×反応緩衝液、1μlの制限酵素、及びH 2 Oを加える。 </li><li> 1時間、37℃の水浴中で消化サンプルを置く。 1％アガロースゲル上で実行して消化を確認する。 </li><li> 1％アガロースゲルから消化サンプルを精製、ライゲーションはPCR産物とY2Hベクターを消化し、DH5αコンピテント細胞に形質転換する。 </li><li>コロニーをピックアップし、プラスミドDNAを分離します。 </li></ol></li><li>のNotI / SalI消化によってpGADNOT-SRC-1プラスミドDNAを識別をBamHI / SalI消化によってpSH2-1-PXRプラスミドDNAを識別します。配列決定により、すべての正のプラスミドDNAを確認してください。 </li></ol> 2。酵母ツーハイブリッドアッセイ<ol><li> 5ミリリットルのYPADに酵母株を接種し、一定の攪拌（30℃、220回転）で一晩インキュベートする。注： サッカロマイセス·セレビシエ株はCTY10-5Dた（MAT ADE2のTRP 1から901 LEU2-3、112 HIS3-200 GA L4 - GAL80 - URA3 :: のlexA-LacZ）ののlexAオペレータ10と統合されたGAL1-lacZ遺伝子が含まれています。ケトコナゾールに耐性の生酵母細胞を得ることではなく、アゾール耐性18〜20の原因は、CTY10-5D酵母の新規株としてトランスポーターの変化を運ばなかったものが最初に削除ERG3（ERG3の Δ）によって得られ、その後、追加、削除を導入したERG11（ERG3Δ/ ERG11Δ）遺伝子の相同組換えによる。構造の詳細は、以前に公開された原稿6に記載されている。 </li><li> （午前中）、次の日は、5ミリリットルのYAPD酵母（1:20）に接種し、一定の攪拌（30℃、220回転）により、OD 600〜0.2を得るために、インキュベートする。 </li><li> 2分間の微量2,000 rpmで細胞をペレットと上清を捨てる。その後PELLEを洗うオートクレーブ水で一回、0.1M LiAc形質との二度トン。 </li><li>最後の洗浄後、上澄み液を廃棄し、細胞ペレットに以下の試薬 ​​を追加します。240μLのPEG 3500 50％W / V、36μlの1 M LiAc形質、50μL2 mg / mlの沸騰したサケ精子のssDNA、H 2 Oを34μL。 、ミックス1μgのPSH-PXRおよび1μgのpGADNOT-SRC-1のDNAを加え、混合する渦。 </li><li> 30分間（30℃で220 rpm）を、丸底チューブをポリスチレン転換を攪拌、混合するミックスを転送します。 42℃の水浴にチューブを移動し、さらに30分間インキュベートする。 </li><li> 2分間2,000 rpmでチューブを遠心分離し、上澄み液を除去します。オートクレーブ水で一回ペレットを洗浄。 </li><li>チューブにピペット100μlの滅菌水、タッピング、ピペッティング優しい指で細胞を再懸濁し、-His/-Leuドロップアウトミディアム1リ​​ットル-His/-Leuドロップアウト中につき（製剤のプレート上にプレート：20グラムのブドウ糖、 1.7グラムのYNB、0.67グラムCSM-His/-Leu、5gの硫酸アンモニウム、1.5％寒天）及びセシ形質転換体を単離するための3〜4日間、30℃でubate。 </li></ol> 3。のX-galフィルターアッセイ<ol><li>ペトリ皿の部分のサイズにニトロセルロース膜をカット。向きをマークするためにニトロセルロース膜にラベルを付けます。 </li><li>酵母コロニーにpremarkedニトロセルロース膜を配置し、膜が平板培地の表面に接触していることを確認してください。 </li><li>膜を取り外し、3mmの濾紙上にコロニー側を上に置き、15分間-80℃で膜、ろ紙を置き。 </li><li> X-gal溶液を作る。追加50μL（1Lバッファが16.1グラムHPO 4 7H 2 O、5.5グラムののNaH 2 PO 4、H 2 O、0.75グラム2のNaが含まれているZバッファの5ミリリットルに20 mg / mlのX-galおよび15μlのβ-メルカプトエタノール塩化カリウム、硫酸マグネシウム4•7H 2 O 0.25グラム）。 Zバッファを4℃に維持した場合、これらの試薬を添加する前に室温にそれをもたらす。 </li><li> 3mmの濾紙の二つの円を配置シャーレ内と5ミリリットルのX-gal溶液でそれらを浸す。ペトリ皿から過剰の緩衝液を排出し、コロニー側を上にしてニトロセルロース膜を配置します。 </li><li>膜は、ろ紙との完全な接触をしているし、それが完全に濡れていることを確認して蓋を閉じます。ホイルにペトリ皿をラップし、一晩に30分間37℃でインキュベートする。 </li></ol> 4。液体のβ-galアッセイ<ol><li> OD 600 0.7に-His/-Leuドロップ液体培地中の酵母を育てる。 </li><li> 2分間3,000 rpmで1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機に1ミリリットル媒体搬送。上清を捨てる。 </li><li> 、ペレットを再懸濁させ、Zバッファの1ミリリットルを追加します。2分間、再び3000 rpmで遠心分離します。上清を捨てる。 </li><li>その後、50μlのクロロホルムと20μlの0.1％SDSを加え、混合し、細胞ペレットを再懸濁する2MEとZバッファの150を添加する。精力的に15秒間のサンプルをボルテックスする。 </li><li> ONPGソリューション（Z bufに1 mg / mlの700μlのを追加します。FER）。タイマーを設定し、黄色が全反応時間を開発し、注意することができるように十分に長い、30℃でインキュベートする。 </li><li>反応を停止し、420 nmの吸光度を測定するために、1MのNa 2 CO 3の500を添加する。ブランクは700μlのONPG水溶液を加えた500μlの1 MのNa 2 CO 3である。 </li></ol>ミラーユニット=（*千A420）/（A600 *分*のml）に次のようにミラーユニットを計算する A420：420 nmにおける吸光度の単位; A600：600 nmにおける吸光度の単位、 分 ：分単位での反応時間; ミリリットル ：中の反応容積

<ol><li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li>
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</ol>

利害の対立が宣言されていません。

私たちの修正Y2Hアッセイでは、PXR 6上のケトコナゾールとの相互作用に重要な残基を同定した。 SRC-1はコアクチベーターである（及びpGADNotベクターにクローニングした）ので、我々はまた、SRC-1は、これが活性化プロフィールを変更および/または漏出性に影響を与えるかどうかをPSHベクター系にクローン化されたときにla​​cZ発現を活性化し得るかどうかを試験した酵母ツーハイブリッドアッセイ。我々はERG3Δ/ ERG11Δを酵母ツーハイブリッドアッセイを行った私たちの再設計されたプラスミドを用いて。前と同様に、我々は、lacZ発現（青色コロニー）もPXR及びSRC-1で形質転換ERG3Δ/ ERG11Δ酵母株において誘導されることを示しているが、空のベクターで形質転換された酵母におけるLacZ発現の誘導（白色コロニー）が存在しない個別PXR又はSRC-1（データは示さず）。我々のアプローチはconventioに適していないタンパク質のための遺伝的相互作用のアロステリックリガンド - タンパク質残基を単離するための強力な新しい方法を提供し、NAL構造生物学および/ ​​ま...

酵母ツーハイブリッド（Y2H）アッセイが広くタンパク質-タンパク質相互作用を発見するために使用され、より最近では、タンパク質-タンパク質相互作用複合体7、図8、図9、図10、図11を破壊する新規な小分子の発見のために。しかし、このアッセイの従来のアプローチは、創薬または「ヒット」のために使用、改変された時にはまだ相互作用し、改変された残基11の尋問を可能にすること、タンパク質-タンパク質表面内の化学薬品化合物のアロステリック相互作用残基の検出を可能にしない。実際に、このような方法（単数または複数）は、開発することが可能であれば、タンパク質 - タンパク質相互作用の破壊のための重要なアロステリック相互作用残基のハイスループット評価に扱いやすい酵母系を可能にする。薬物発見の文脈において、タンパク質と化合物の相互作用を確立するための最も直接的な方法は、構造決定（タンパク質-阻害剤複合体、例えば crystalization）を含むであろう。これらのメソッドは中出しですbersome、精巧なリソースを使用し、それはすべてのタンパク質上の構造研究を行うことは技術的に実現不可能である。 扱いやすい遺伝的薬剤スクリーニング系は、細菌、1,2および哺乳動物ツーハイブリッドなどの他のモデル系において確立されている。しかしながら、これらのシステムは、Y2Hのような最適化お​​よび代替システムがまだほとんどの薬物発見で試験する必要がある。乏しい感度および特異法13を用いて相互作用の信頼性を含む限界があるが、単一のY2Hアッセイは、相互作用残基に関する特定の質問に答えるように改変することができる。核内受容体研究の分野において、Y2Hは、相互作用タンパク質14を定義するために使用されてきたが、これらのタンパク質相互作用はほとんど/アンタゴニストは、核受容体-タンパク質複合体と相互作用するリガンドた性質を定義するために使用されていない。したがって、我々の研究室では、特にありません受容体タンパク質のために、メソッドを定義することに力を注い逆Y2Hベースの検出プラットフォームを使用して残留物を相互作用新規リガンド/アンタゴニストを発掘だろ基づく方法を、プロテオミクスに容易に適用できる。 ケトコナゾールはPXRとその活性化因子SRC-1を破壊という我々の以前の知見に基づいて、我々は小説はPXR 6にケトコナゾール作用する残基を定義して、質問するために私達を可能にするY2H系を逆に開発しました。我々の方法は、DNA結合および転写活性化に関与する分離可能なドメインからなる酵母GAL4タンパク質の特性に基づく。タンパク質はGAL4活性化ドメインとの融合体として発現される完全長クチベーターSRC-1（ステロイド受容体コアクチベーター1）しながら、PXR LBDタンパク質はAD（LexAのDNA結合ドメイン（DNA-BD）との融合体として発現される）。 PXR及びSRC-1融合タンパク質間の相互作用は、酵母genomに統合されたレポーター遺伝子β-LacリZを含有するGAL4結合部位の転写活性化をもたらすE。ケトコナゾール、PXRアンタゴニストは、PXR及びSRC-1の相互作用15、16、17を破壊し、我々はX-gal活性のためのフィルター上のコロニーを染色した後、ケトコナゾールの存在下又は非存在下でPXR及びSRC-1との相互作用を検出することができる。 Y2Hの原理は、図1に示されており、実験手順を図2にまとめる。

<table><tbody><tr><td>酵母株CTY10-5d erg3&Delta;/erg11&Delta;</td><td>私たちの研究室</td><td></td><td>CTY10-5d酵母は、ERG3 およびERG11(erg3&Delta;/erg11&Delta;)遺伝子6をダブルノックアウトしました。</td></tr><tr><td>YPD Growth Medium</td><td>BD Biosciences 630409</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Difco 酵母窒素塩基 (YNB) w/o アミノ酸および硫酸アンモニウム</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CSM-HIS/-Leu 完全サプリメント混合物</td><td>MP Biomedicals</td><td>4250-412</td><td></td></tr><tr><td>ONPG (o-ニトロフェニル &Beta;-D- ガラクトピラノシド)。</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ルリアブロス (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Fisher</td><td>BP-1615</td><td></td></tr><tr><td>超音波処理サーモン精子DNA煮沸 (10 mg/ml)</td><td>Life Technology</td><td>156-017</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Acros Organics</td><td>61177</td><td></td></tr><tr><td>ケトコナゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1003</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>Acros Organics</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>酢酸リチウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>50% PEG-3350 溶液、フィルター滅菌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース メンブレン</td><td>Whatman</td><td>10402091</td><td></td></tr><tr><td>10 cm ペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>PXR LBD フォワードプライマー pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>PXR LBD リバースプライマー pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGACAGTTCATCC -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>SRC-1 フォワードプライマー pGADNOT 用</td></tr><tr><td>5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>SRC-1 reverse primer for pGADNOT</td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>our lab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>our lab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>our lab</td><td>R0189</td><td></td></tr></tbody></table>

相互作用するリガンドおよび/またはアンタゴニストと、哺乳動物核内受容体残基を同定するために逆酵母ツーハイブリッドシステム

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

薬物代謝および炎症の重要な調節因子として、プレグナンX受容体（PXR）は、代謝、炎症（ 例えば脂肪肝） の1,2を結ぶ疾患の病態生理に重要な役割を果たしている。 PXRのアゴニストリガンドの同定に多くの進歩があったが、薬物様拮抗薬およびPXR 3,4,5上のそれらの結合部位の限られた記述があります。重大な障壁を効率的PXRは1998年にクローニングされ、特徴付けられたという事実にもかかわらず、拮抗薬との構造の研究のために、完全長のタンパク質を精製することができないことであった。当研究室では、PXR 6に結合残基、アンタゴニスト、ケトコナゾールのを定義するのに基づく新規のハイスループット酵母ツーハイブリッドアッセイを開発しました。我々の方法は、ケトコナゾールと対話することが期待PXRのAF-2表面上の単一変異の効果を救うだろ突然変異のライブラリを作成する必要があります。救助または「機能獲得型」セコndは突然変異はPXRにケトコナゾールの遺伝的相互作用および表面残基（複数可）に関する結論が実現可能であるようにすることができる。従って、我々はそのコアクチベーター、SRC-1との相互作用PXR変異体の高スループットツーハイブリッド酵母画面を開発しました。酵母は抗真菌薬、ケトコナゾールの研究に対応するように変更されたこのアプローチを、使用して、我々は、ケトコナゾールに結合することができないのクローンが濃縮されたPXRに特定の変異を実証できた。逆論理によって、我々は、元の残基はケトコナゾールとの直接的な相互作用残基であると結論付けている。このアッセイは、核内受容体表面上の結合部位アンタゴニストをスクリーニングするための新規な、扱いやすい遺伝的アッセイを表す。このアッセイは、酵母、ならびに標準的な構造生物又はプロテオミクスベースの方法を使用して研究することができない細胞タンパク質（単数または複数）に関係なく、その細胞傷害能の任意の薬物に適用することができる。潜在的な落とし穴は、データの解釈（相補メソッド便利）、信頼を含めるシングルY2H法、酵母を取り扱うまたは酵母ツーハイブリッドアッセイを実施する専門知識、およびアッセイの最適化にある低インピーダンス。

我々は、PXRとステロイド受容体コアクチベーター1（SRC-1）の関連性の比色読み取りを検出できるかどうかを確認するためにアッセイを行った。酵母は有意なステロール生を有するので、予め酵母におけるlacZ発現は、追加の外因性リガンドを必要とせずに誘導することができることが示されている。私たちは、lacZ発現（青色コロニー）もPXRとSRC-1で形質転換された酵母株が誘導されることがわかったが、空のベクター、PXR、または個別に、SRC-1で形質転換された酵母におけるLacZ発現（白コロニー）の誘導はありません（ 図3）。ケトコナゾール（25μm）を酵母でPXRとSRC-1の相互作用を妨害するかどうかを判断するには、ケトコナゾールを含むレプリカプレートはエレベーター、ニトロセルロースおよびX-galフィルターを浸漬し、β-ガラクトシダーゼ液体アッセイを実施した。私たちは、（レプリカフィルタからすべてのコロニーは今や白だったので、ケトコナゾールは、酵母におけるPXRとSRC-1の相互作用を破壊ということであったかを示しまた、液体の酵素アッセイと大幅に減少、β-ガラクトシダーゼ活性）（ 図4A）...

ケトコナゾールに結合し、プレグナンX受容体（PXR）の活性化に拮抗する。 PXR変異体の酵母ハイスループットスクリーニングは、ケトコナゾールが結合するための独自の領域を規定する。この酵母ベースの遺伝的方法は、表面結合部位と会合したリガンドを有する新規な核内受容体相互作用を検出します。

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

この手順の全体的な目的は、プレグナンX受容体（PXR）と低分子阻害剤であるケトコナゾールの相互作用を明らかにする、酵母ハイスループットツーハイブリッドアッセイについて記述することです。これは、まず、一方はヒトPXRのリガンド結合ドメインを、もう一方はステロイド受容体共活性化因子1（SRC-1）を発現する酵母ツーハイブリッドプラスミドを構築することによって達成されます。液相β-ガラクトシダーゼアッセイで明らかになったように、ケトコナゾールの存在下では、ヒトPXRとSRC-1の相互作用が阻害されます。ケトコナゾールの存在下でのPXR変異体のフィルター検定によるコロニーの比色スクリーニングを併用することで、薬剤の作用に対して受容体を耐性にする変異の特定が可能となり、最終的に目視検査と液体β-ガラクトシダーゼ（beta galacto）測定の結果から、発現の低下を確認できます。SASEアッセイを用いて、ケトコナゾール存在下でのPXR活性化の変化を示すことで、相互作用に関与する元の残基を特定できます。この手法のアイデアは、私がアソシエートとして所属しているDr. Mannyの研究室で最初に得たものです。PXRに関する構造データが不完全であるという問題に直面した際、生化学的手法では、特に相互作用の規模が非常に小さく容易に修正できなかったため、同定を行うことが困難でした。構造特性を明らかにするため、キトシン耐性PXR変異体を検出するという原理に基づき、扱いやすく実現可能であり、かつ非常に高いスループットで数日以内に実施できる手法を考案しました。この手法は、受容体タンパク質に対する低分子の結合親和性を解明できるだけでなく、疾患において病原性を持つあらゆるタンパク質などの他の系にも適用可能です。特に、構造生物学的なアプローチにおける制限がある場合に、結合残基を事前に同定することで、低分子の標的相互作用因子の理解と設計を向上させることができます。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、ヒトPXRリガンド結合ドメインおよび全長ヒトSRC-1を増幅させます。PCR産物は1%アガロースゲル電気泳動で確認してください。次に、AROSゲルからPCR産物を精製します。テキストプロトコルに従って、PCR産物と2つのハイブリッドベクターを制限酵素消化し、消化サンプルを37 °Cの水槽で1時間静置します。1%アガロースゲルを用いて消化サンプルを精製し、その後、精製したPCR産物と2つのハイブリッドベクターをライゲーションし、37 °Cで一晩インキュベートした後、DH5αコンピテントセルに形質転換します。コロニーをピックアップし、プラスミドDNAを単離して、制限酵素消化によりベクターとインサートの存在を確認し、すべての陽性プラスミドDNAをシーケンシングで検証します。酵母株を5 mLのYAPDに接種し、30 °Cで220 RPMの定速振盪により一晩培養します。翌朝、酵母を1:20の割合で5 mLのYAPDに接種し、定速振盪により600 nmにおける光学密度（OD600）が0.2になるまで培養します。マイクロ遠心機を用いて2000 RPMで2分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を捨てます。次に、ペレットをオートクレーブ滅菌水で2回、0.1 M リチウムアセテートで1回洗浄します。最後の洗浄後の上清を捨てた後、テキストプロトコルに記載されている形質転換試薬を細胞ペレットに加え、ボルテックスで混合します。次に、調製したPXR含有ベクターおよびSRC含有ベクターを加え、混合します。再度、形質転換混合液をポリスチレン製ラウンドボトムチューブにピペットで移し、30分間撹拌します。チューブを42 °Cの水槽に移し、さらに30分間インキュベートします。次に、上澄みを除去した後、チューブを2000 RPMで2分間遠心分離します。ペレットをオートクレーブ滅菌水で1回洗浄します。滅菌水100 µLをチューブにピペッティングし、指で軽く叩くこととピペッティングによって細胞を再懸濁します。その後、ヒスチジンおよびロイシン欠損のドロップアウト培地に細胞を播種し、30 °Cで3〜4日間インキュベートして形質転換体を単離します。Xgaフィルターアッセイを開始するには、ペトリ皿の10mmの範囲に適合するように、ニトロセルロースメンブレンを三角形に切り出します。向きがわかるように、ニトロセルロースメンブレンにラベルを付けます。あらかじめ印を付けたニトロセルロースメンブレンを、メンブレンがプレート培地の表面に密着するように酵母コロニーの上に配置します。メンブレンを取り出します。コロニー側を上にして3 mmのフィルターペーパーの上に置き、メンブレンとフィルターペーパーを-80 °Cで15分間保持します。次に、ペトリ皿に3 mmのフィルターペーパーを2枚円形に配置し、5 mLのxal溶液で浸します。ペトリ皿から余分なバッファーを排出し、ニトロセルロース膜をコロニー側を上にして皿の中に配置します。膜がフィルターペーパーに完全に接触し、全体が濡れていることを確認して蓋を閉じます。ペトリ皿をホイルで包み、37 °Cで30分から一晩インキュベートし、ヒスチジンとロイシンを含まない液体培地で600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が0.7になるまで酵母を増殖させます。1 mLの培地を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、3000 RPMで2分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットに1 mLのZバッファーを加え、遠心分離します。前と同様に、腫瘍カプトエタノールを含むZバッファーを150 µL加え、細胞ペレットを再懸濁します。次に、50 µLのクロロホルムと20 µLの0.1%SDSを加え、激しく混合します。サンプルを15秒間ボルテックスします。続いて700 µLのONPG溶液を加え、タイマーを設定し、黄色に着色するまで30 °Cでインキュベートします。発色が確認されたら、全反応時間を記録します。1 Mの炭酸ナトリウムを500 µL加えて反応を停止させます。その後、420 nmにおける吸光度を測定します。最終ステップとして、テキストプロトコルに従ってミラー単位（Miller units）を算出します。酵母はかなりの量のステロールを自律的に産生するため、酵母におけるlaxyの発現は、追加の外来リガンドを必要とせずに誘導することが可能です。xalリフトアッセイの結果、青色コロニーとして可視化されたlaxyの発現が、PXRおよびSRC-1を形質転換した酵母株で誘導されていることが明らかになりました。これはβ-ガラクトシダーゼ液相アッセイでも示されています。しかしながら、空ベクター、PXR単独、またはSRC-1単独を形質転換した酵母では、lacZの発現誘導は見られませんでした。レプリカフィルター上のすべてのコロニーが白色であったことから、ケトコナゾールは酵母におけるPXRとSRC-1の相互作用を阻害することが示され、これは液相酵素アッセイによるβ-ガラクトシダーゼ活性の大幅な低下によっても証明されました。PXR二重変異体を用いてS rrc oneの酵母形質転換を行ったところ、ケトコナゾールに曝露されたコロニーが依然としてlaxy発現を保持していることが明らかになりました。これは、同一のPXRが強力なリガンドによって活性化される一方で、哺乳類アッセイにおけるケトコナゾールの拮抗作用を受けないことを示した当研究室の以前の研究結果と同様です。このビデオを視聴することで、ハイブリッドACを慎重に実施する方法とその適用箇所について、また、タンパク質上の低分子結合残基の研究に必要な修飾について、十分な理解を深めることができるはずです。この手順を試みる際は、受容体の極めて多様な変異体ライブラリを取得し、各200プラスの良好な形質転換効率を達成し、薬剤の有無にかかわらずフィルター上のほぼ同一のレプリカを作成し、最後にnase検出のための正確な視覚的および化学的検査を行うことが重要です。この手順に続き、少なくともbend ucがヒト細胞のタンパク質に適用可能か、また適用可能であれば、これらの残基をファーマコフォアとして防御するモデルを作成できるかといった追加の疑問に答えるために、Ian 200 a Acids protein pro as acidsやiCalドッキング相同性モデルなどの他の手法を実施することができます。

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JoVE Journal

Biology

生物学

神話では、モデル生物出芽酵母で発現されるタンパク質間の過渡と安定な相互作用を高感度に検出することができます。それが正常にハイスループットな方法でそれらの相互作用パートナーを同定するために、外因性および酵母内在性膜タンパク質の研究に適用されています。...

スプリットユビキチンによる膜酵母ツーハイブリッド（神話）システム：タンパク質間相互作用を識別するための強力なツール

我々は、従来の酵母ツーハイブリッドスクリーニング、タンパク質相互作用の同定に効果的な遺伝的なツールを変更しました。この変更は著しく、プロセスを短縮する作業負荷を軽減、そして最も重要なのは、偽陽性の数を減らします。さらに、このアプローチは、再現性と信頼性です。...

成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム

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以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

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酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

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異種タンパク質複合体-DNA相互作用研究のための改変酵母1ハイブリッドシステム

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受容体-リガンド相互作用を研究するための BW レポーター システム

4-ヒドロキシ タモキシフェン-依存性エストロゲン受容体 α リガンド結合ドメイン二量体化アクティビティ哺乳類の 2...

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Yeast Two-Hybrid Assayを用いたInteraction-Null/Impaired Mutantsの単離

タンパク質設計には、アミノ酸配列の構築と、機能的なバリアントを作成するための特定のモチーフの組み込みが含まれます。このアプローチは、抗生物質耐性病原体と戦うための抗菌ペプチド(AMP)の開発に不可欠です。この論文では、さまざまなバイオインフォマティクスツールを使用したタンパク質構築の手順を示します。...

I TASSER、trRosetta、UCSF Chimera、HADDOCKサーバー、HEX loriaの De Novo および In Silico Design of Proteinsへの応用

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相互作用するリガンドおよび/またはアンタゴニストと、哺乳動物核内受容体残基を同定するために逆酵母ツーハイブリッドシステム

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