臨床関連動物モデルおよび3D免疫化学における使用のための外科検体からのハイグレード神経膠腫細胞培養の最適化

この手順の全体的な目標は、ルーチン神経球を開発し、高悪性度星状細胞腫の培養と前臨床研究のための腫瘍形成細胞の大規模な拡大を開発することです。これは、最初に新鮮な腫瘍標本を急性解離し、単一細胞を赤血球や破片から分離することによって達成されます。第2ステップでは、腫瘍細胞をニューロスフィアで培養し、ニューロスフェアが観察されるまで成長因子を補充した培地で培養します。

ニューロスフェアは、in vivo実験や分子特性評価のために培養することも、免疫学的特性評価のためにパラフィンに正式かつ固定して埋め込むこともできます。最終的には、神経球培養の長期的な自己再生同所性腫瘍形成と分子プロファイリングを評価できます。10%FBS長期血清培養のような既存の方法に対する主な利点は、この技術が元の腫瘍の分子的および遺伝的特性を保持することです。

この方法により、患者特異的な膠芽腫細胞培養物や臨床的に重要な研究のための動物モデルを生成するための生腫瘍バンクの確立が可能になります。このモデルが悪性神経膠腫患者の治療的検査に及ぼす影響は明らかです。このモデルは原発腫瘍を最も忠実に表しており、前臨床環境での治療試験を可能にします。

この方法は、高悪性度神経膠腫に関する洞察を提供することができますが、他のヒトや動物の腫瘍にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、適切な無菌技術とケア、および長期的な細胞生存率を優先するための複数のステップを必要とするため、苦労します。私たちが最初に3D組織学法のアイデアを思いついたのは、標識されたタンパク質と切片の細胞内局在が優れているため、ニューロスフェア全体を標識してイメージングしたり、細胞を解離したりするより一般的な方法に関連していました。

この組織学法の視覚的なデモンストレーションは、固定、クリアリング、処理、および埋め込みのステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。すべてのニューロスフェアが試薬に適切に曝露され、均一に処理され、形態学および免疫組織化学に利用可能な最良のペレットが得られるように注意が必要です。200〜500ミリグラムの腫瘍サンプルから始めて、メスの刃を使用して組織をミンチにします。

10ミリリットルの培地が入った15ミリリットルのチューブにピースを移し、懸濁液を数回反転させて組織溶液を混合します。腫瘍片を重力によって沈殿させ、次に培地を取り除きます。培地が汚れなくなるまで、腫瘍片から破片を洗い続けます。

次に、メディアを取り外します。混合腫瘍サンプル0.5グラムあたり2ミリリットルの酵素組織解離溶液を加え、反転して溶液を穏やかに混合します。組織溶液を37°Cで組織培養インキュベーター内で回転させてインキュベートします。

30分後、2ミリリットルのピペットで懸濁液をトライレートします。腫瘍がほぼ単一細胞懸濁液に消化されたら、2容量の停止溶液で酵素を停止し、細胞懸濁液を5ミリリットルの血清学的ピペットで混合します。次に、40マイクロメートルのセルストレーナーで未消化の物質をろ過し、Gの800倍と室温で5分間細胞をペレット

次いで、10ミリリットルの培地で3回洗浄した後、5ミリリットルの培地で最終細胞ペレットを懸濁する。この細胞懸濁液を5ミリリットルのリンパライトMにゆっくりと重ね合わせ、次いで細胞集団をGの1300倍および室温で20分間分離する。次に、有核細胞を含む界面層を、10ミリリットルの培地を含む15ミリリットルのチューブに集めます。

次いで、成長因子を添加したニューロスフィア培地に細胞を再懸濁し、1ミリリットル当たり10〜5細胞の1倍未満でそれらをプレート化する。不規則なT25組織では、摂氏37度と5%二酸化炭素の培養フラスコ。加湿組織培養インキュベーターで。

1〜3週間で形成される浮遊神経球を新しいフラスコに移し、付着した細胞や破片から分離します。免疫組織化学によってニューロスフェアを解析するには、まずニューロスフェアをペレット化し、次にペレットを乱さないように注意します。上清を取り除き、チューブに10ミリリットルのDPBSを追加します。

次に、DPBSを取り出し、ペレットを10%中性の緩衝ホルミンに再懸濁し、細胞を室温で20分間インキュベートします。ステロイドを再度ペレット化した後、一連のエタノールインキュベーションでそれらを再懸濁します。2回目の95%エタノールインキュベーション後、細胞が明るく、白く、凝縮するまで、PHEを無水エタノールで再懸濁します。

次に、レンズペーパーで小さなコーンを作ります。ビーカー内の小さな漏斗に入れ、レンズペーパーを無水アルコールで濡らします。新鮮な100%エタノールでペレットを少し緩めてから、余分なアルコールを注ぎます。

レンズペーパーコーンに球体を注ぎ、球体が先端に行くことを確認し、追加の無水エタノールでチューブをすすぎます。レンズペーパーコーンを通して残っているステロイドを注ぎ、次に漏斗からコーンを取り外します。次に、レンズペーパーを正方形に折り、ステロイドができるだけしっかりと密閉されていることを確認して、パッケージのニューロスフェアをカセットに移します。

次に、カセットを自動ティッシュプロセッサーに入れ、プロセッサーを実行します。次に、カセットを取り外し、パラフィン包埋システムの加熱部分に置きます。表面に破片、ほこり、またはその他の破片がないことを確認した後、温暖化ウェルの鉗子からすべてのパラフィンを吸い上げます。

次に、きれいなパラフィンフリー鉗子を温め、温めたベース型に少量のパラフィンを加えます。次に、パケットをカセットから取り出し、埋め込みシステムの加熱部分に置きます。スポが見えるまで丁寧に紙を開けます。

予温した鉗子を使用してできるだけ多くの材料を集め、次にスフェロイドをベース型の液体パラフィンに移します。塊を慎重に分割し、ステロイドを角から均一な中央層に移動します。ベースモールドを冷却エリアに移動して、ステロイドを所定の位置に固定します。

最後にカセットを追加し、パラフィンをゆっくりと充填します。カセットが完全に冷えたら、表に記載されているように、神経球パラフィンブロックを免疫組織化学のために切片化できます。新たに診断された88の腫瘍と37の再発腫瘍の合計から長期神経球培養を確立するためのこのプロトコルの効率は、新たに診断された腫瘍と再発腫瘍の両方で41.6%類似していました。

一部の膠芽腫サンプルでは、最初の数日でニューロスフェアが形成されましたが、他のサンプルではより長い培養時間が必要でした。神経球形成の効率は、新たに診断された高細胞密度腫瘍と再発性および壊死性腫瘍の結果によって例示されるように、組織内の壊死のレベルにのみ依存していたわけではなく、どちらも実証されたばかりのように処理され、各神経球の腫瘍形成能力をテストするニューロスフェアをもたらしました。免疫不全マウスでの培養は、がん幹細胞の濃縮に対するこのアプローチの重要な検証です。

この実験では、免疫不全マウスの脳に2つの異なる膠芽腫神経球培養物を移植しました。異種移植腫瘍は、脳への浸潤、実質、壊死などの膠芽腫の形態学的特徴を示しました。この実験では、ニューロスフェアを形成しない細胞を、これらの代替培地細胞の腫瘍形成である2%FBSを添加したニューロススフィア培地で培養しました。

神経膠芽腫と比較して、ニューロスフィア培養異種移植片をヌードマウスレシピエントに評価しました。生存率に差はありません。腫瘍増殖の動態または形態は、2つの植え付け前培養方法間で観察されました。

ニューロスフェア培地で増殖した10%FBS膠芽腫細胞で培養したほとんどの初代神経膠芽腫細胞では、SOX 2を含む神経幹細胞マーカーがダウンレギュレーションされていますが、2%FBSを添加すると、先ほど示したように、処理後もSOX 2の発現が保持されます。そしてこの実験では、ニューロスフェアをhおよびeで標識し、核局在を示すための抗酸化2抗体と細胞膜局在を示すための上皮成長因子抗体を用いた。得られた画像が示すように、実証された方法は、ニューロスフェアの3D構造を維持しながら、タンパク質発現および翻訳後修飾の分析を最適化する。 また、高悪性度神経膠腫の不均一な分子組成は、この手順の後、結果に影響を与える可能性があります。

頭蓋内移植のような他の方法は、動物モデルで元の腫瘍を再現するために行うことができます。この技術は神経腫瘍学に革命をもたらし、臨床的に関連性のある環境での前臨床試験を可能にしています。このビデオを見れば、長期的なニューロスフェアを開発および維持する方法や、分子解析用の形式的で固定的なパラフィン包埋ニューロスフェアを作製する方法について十分に理解できるはずです。

人間の組織を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、個人用保護具、適合剤、潜在的に危険な薬剤などの予防措置を常に使用する必要があることを忘れないでください。