デュアルカラータイム·ゲーティッド誘導放出枯渇（STED）ナノスによる免疫シナプスの可視化

この手順の全体的な目標は、TED顕微鏡を使用してNK細胞溶解性シナプス内のFアクチンなどの構造を視覚化することです。これは、まず活性化抗体を用いてガラス上のシナプスを再現することによって達成されます。手順の2番目のステップは、パーメを固定し、目的の構造のために細胞を染色することです。

次に、スライドをレーザー走査型共焦点顕微鏡で画像化し、続いてステッドデプレッションを適用して画像の解像度を向上させます。最後のステップは、デコンボリューションアルゴリズムを使用して画像を処理することです。最終的に、結果は、デュアルカラーステッドと内視鏡検査のおかげで、細胞構造の100ナノメートル未満の解像度を示すことができます。

この方法は、細胞骨格とエキソサイトーシスの関係など、細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。私たちの場合、ナチュラルキラー細胞による溶解性顆粒と呼ばれる特殊なリソソームの分泌に興味があります。一般に、この方法に不慣れな個人は、TED枯渇レーザーのアプリケーションで調整できる変数が複数あるため、苦労します。

枯渇ビームの不適切な適用は、分解能の向上の代わりに悪化をもたらします 準備では、10%FCSで30ミリリットルのRPMI媒体を温め、別々に。BD CYの1ミリリットルは、摂氏37度まで両方のサイオプパーマ効果。次に、カバースリップを抗体でコーティングするプロセスを開始します。

1.5番のカバースリップを取り、PAPペンを使用します。カバースリップに10セント硬貨サイズの正方形を作ります。テスト条件ごとに1つの正方形を準備します。

各円に200マイクロリットルの抗体をPBSで1ミリリットルあたり5マイクログラムでロードします。NK 92細胞の活性化には、抗CD18抗体および抗NK P 30抗体を使用してください。37°Cで30分間ロードされたカバースリップをインキュベートし、その後、室温PBSに浸してそれらを洗い流し、テストされた各条件の細胞をすぐに追加して、500,000個の細胞を使用する準備ができている必要があります。

細胞を10ミリリットルの予温培地で洗浄し、次にそれらを同じ温めた培地に再懸濁します。細胞を完全に懸濁させた状態で1ミリリットルあたり250万個の細胞で、カバー上の各抗体正方形に200マイクロリットルをデカントします スリップ この場合、摂氏37度の細胞とカバースリップをインキュベートします CO2 5%。インキュベーション洗浄後、NK細胞内の顆粒を分極するのに十分な時間であり、カバーは室温でPBSで穏やかに滑ります。

まず、1ミリリットルの温かいBD CYエフェクトサイトパーマ溶液に1マイクロリットルのTRITTON X 100を追加します。次に渦。この溶液の200マイクロリットルをカバースリップの各条件の正方形に適用します。

次に、セルを室温で暗所に置き、10分間待ちます。インキュベーションが終了したら、カバースリップを染色バッファーで優しく洗います。次に、囲まれた領域の端を綿棒で乾かします。

次に、染色バッファー中の一次抗体200μLを周囲の領域に加え、カバースリップを暗所で30分間インキュベートします。ステッドイメージングに適した二次抗体には、Alexa floor 4、88、Pacific Orange、Horizon V 500などがあります。これらはそれぞれ、1〜200の希釈で良好に機能します。

インキュベーション洗浄後、カバーを滑り込ませて染色し、緩衝液を軽くたたいて乾かします。前回と同様に、200マイクロリットルの二次抗体を各条件の正方形に塗布します。その後、さらに30分間暗闇に座らせます。

この時点で、追加の洗浄後に追加の抗体を追加することが可能です。例えば、Phinを1〜200で印加してfアクチンを検出することができます。封入剤には、Steadと互換性のないprolongover vector shieldを選択してください。

フィン染色を使用する場合は、2つのチオエタノールの使用を避けてくださいが、大丈夫ですが、スライドに10〜20マイクロリットルの封入剤を塗布します。カバースリップを逆さまにして、気泡を避けながら、カバーを中腹にゆっくりと下げます。その後、スライドを24時間インキュベートします。

カバーをした状態で、翌日にスリップアップし、カバースリップをマニキュアで密封し、イメージングを進めます。レーザーとソフトウェアを起動します。ステッドデプレッションレーザーは、100%の電力でウォームアップし、位置合わせする必要があります。

接眼レンズを使用してサンプルに焦点を合わせ、次にソフトウェアに目を向けます。最初のチャネル(波長が最も長いチャネル)をスキャンします。フロア4では、レーザーの出力、励起ビームの位置、検出器の範囲を最適化します。

100を超える設定は避けてください。次に、共焦点画像をキャプチャし、ピクセルを確認します。彩度、ライン、フレームの平均化は、どちらもピクセル解像度を向上させます。

目標は、ピクセルあたり30ナノメートル未満にすることです。ある程度の飽和は、stead として許容されます。次に、50%の電力でステッドデプレッションビームを印加し、画像をキャプチャします。

解像度が向上すれば、より多くのパワーを加えることができます。さらに、励起レーザー出力、ライン平均、またはゲインを調整することで、解像度を向上させることもできます。背景を減らすには、0.3ナノ秒の時間ゲーティングを適用し、上向きに調整します。

新しい解像度は、半角の最大半幅全体の計算を使用して見積もる必要があります。満足したら、すべてのチャンネルを微調整したときに、2番目のチャンネルでこれらの手順を繰り返します。すべてのスキャンシーケンスで単一の染色コントロールをイメージングすることにより、スペクトルのオーバーラップを確認します。

軽度のオーバーラップは、ソフトウェアによるスペクトルアンミキシングで補正できますが、回避するか最小限に抑えるのが最善です。次に、定量的イメージング用の画像を取得します。実験条件に応じて、条件ごとに少なくとも20枚の画像を取得します。

保存した画像をデボルブするには、適切なソフトウェアでファイルを開きます。各チャンネルのパラメータ、特に励起スペクトルと入射スペクトル、ステッド枯渇放出、およびイメージング方向を確認します。次に、ソフトウェアのデコンボリューション計算を適用します。

通常はデフォルト設定で十分ですが、信号対雑音比は床力によって異なるため、実験ではパラメータを手動で設定する必要があります。stead で最適でない解像度につながる可能性のあるいくつかの一般的な落とし穴があります。1つはサンプリング中です。

これにより、粒状性が生じ、これらのfアクチンフィラメントのようなピクセル情報が失われます。多くの場合、ラインまたはフレームの平均化を増やすと、この問題が解決されます。別の問題は、長いピクセルによって引き起こされる漂白またはオーバーサンプリングです。

通常、画像取得前のスキャンによる過剰なライン平均化による滞留時間も原因である可能性があり、画像を取得する前にスキャンを小さくするか、スキャン速度を速くすることで修正できます。レーザー出力を下げることも、すべてが機能するのに役立ちます。イメージが格段に良くなります。

デコンボリューションにより、さらに画像が向上します。量的にも質的にも。この手順を試みている間、100ナノメートル未満の解像度を定期的に取得する必要があります。

各実験の前にステッドビームアライメントを行い、その後はこの手順の後に約1時間に1回行うことを忘れないでください。定量分析などの他の方法を実行して、共局在化、細胞内局在、分子相互作用に関する追加の質問に答えることができます。