胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

この手順の全体的な目的は、高解像度の生体内イメージング（ intravital imaging）のために、標準的な2光子顕微鏡を準備することです。まず、レーザーの調整を含む顕微鏡の光軸調整を行い、次に、最適なビーム形状とビーム配置を実現するためにビームマルチプレクサーの調整を行います。

マルチビームスキャンの場合、ストライプ照明パターンで試料をスキャンすることで生画像を取得します。最後に、アルゴリズムを適用して高解像度の最終画像を算出します。最終的に、ストライプ照明顕微鏡法を用いて、従来は生体内顕微鏡観察では不可能であったマウスリンパ節の胚中心における免疫系の挙動の詳細を明らかにします。

構造照明や局在化顕微鏡などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、生体サンプルの深い組織層に適用できることです。レーザービームの形状を変更する必要がないため、手法が非常にシンプルであり、あらゆる多光子顕微鏡に容易に導入することが可能です。ここでは、最小限の光退色と最速の撮像速度で、最適な解像度とコントラスト品質を実現するための多光束二光子ストライプ照明顕微鏡のセットアップを示します。

テキストプロトコルに記載されている通りにセットアップの調整を検討してください。調整後、ビームがプリズムベースパルスコンプレッサーの終端にある入射ミラーの直上に配置されたミラーに正確に戻っているかを確認します。ここから光路が設定されると、ビームはビームマルチプレクサーへと反射されます。

マルチビームストライプ照明を行う場合は、スキャナーをオフにした状態で多光子顕微鏡を使用します。均一に蛍光を発する試料をステージ上に置き、レーザービームを試料内部かつ表面付近（対物レンズの前面レンズに近い位置）に集光させ、ビームマルチプレクサ内のミラーを調整してください。

顕微鏡をマルチビームモードに設定し、ビーム数と偏光を選択します。例えば、蛍光スライドをイメージングしてPビームを確認する場合、Pシャッターを開き、ビームをフォーカスさせながらCCDカメラを連続的に作動させ、ビームが中心位置にあることを確認します。Pビームの調整が完了したら、64ビームモードに切り替え、対応するシャッターを開きます。

ビームの位置を確認します。1枚目から5枚目のビームマルチプレクサーミラーを調整し、ビームの照射位置が等間隔になるようにします。ストライプ照明アルゴリズムはこの前提に基づいているため、均一に蛍光を発するサンプルを、不均一な構造を持つサンプルに置き換えてください。

例えば、Conval領域の根のサンプルを採取し、マルチビーム画像をスキャンします。画像が鮮明で、均一かつ直線的に表示されていることを確認してください。不均一なサンプルを均一なサンプルに置き換えます。

XYスキャナーを起動してスキャンプロセスを制御します。マルチビームスキャニング用のストライプ状の励起パターンを生成するため、Yスキャナーミラーをビーム照射線に対して垂直に移動させます。

ブロックシフトと呼ばれるXスキャナーミラーを移動させ、ここに示されたブロック数分だけ生成されたパターンを繰り返し、長方形のストライプ画像を作成します。不均一サンプルを再び設置し、スキャナーをマスタートリガーとして使用します。カメラをスキャナーと同期させ、ストライプ画像を自動的に取得および保存し、ストライプ画像の繰り返し取得を行います。

十分な繰り返し回数、シフト回数、および適切なステップ長を選択して、Xスキャナーミラーを異なる位置に移動させます。2つの連続するストライプ画像間のシフトステップは、2つの連続するビーム幅間の距離をカバーするように設定してください。Xシフトは、指定された励起波長における側方分解能の限界値より小さい値に設定します。

例えば、1回のシフトあたりXスキャナーミラーを10ステップ動かし、12回または13回シフトさせることで、最高の空間分解能が得られます。共焦点領域のルートスライドを用いて、共焦点領域の画像が最も鮮明になるまでこれら2つの値を最適化します。従来のCCD画像および算出されたストライプ照明画像に対して、ラインプロファイルツールを使用してください。

ラインプロファイルの幅を比較します。本例では、これは回復期の細胞壁からの蛍光信号です。スキャナーの動作に同期させて各生のストライプ画像を取得し、TIFFまたはバイナリファイルなどに個別に保存します。高解像度のストライプ照明画像の二次元行列を生成するには、評価ルーチンで一連の生のストライプ画像を行列として開いてください。

深部組織におけるストライプ照明マルチビーム多光子顕微鏡観察を行うには、詳細に既述されている最小最大アルゴリズムまたはフーリエ変換ベースのアルゴリズムのいずれかを使用します。生体内で、異なる組織深さにおけるストライプ画像を経時的に取得し、既述の手法に従って評価することで、胚中心、B細胞、および濾胞樹状細胞の間の動的な相互作用を高解像度3D動画として作成します。有効点広がり関数（PSF）の次元は、顕微鏡の空間分解能に対応します。

我々は、mionリンパ節におけるコラーゲン線維の第二高調波発生信号、または515 nanometersで発光する100 nanometerポリスチレンビーズの蛍光信号を取得することで、この三次元関数を測定しました。CCDカメラを用いたフィールド検出T-P-L-S-Mやポイント検出T-P-L-S-Mなどの確立された二光子レーザー走査顕微鏡技術と比較して、我々のマルチビームストライプ照明T-P-L-S-Mを使用しました。これらの測定から、試料表面において、水平方向および軸方向の分解能の両方が回折理論によって予測される期待値に一致することが明らかになります。

しかしながら、イメージング深度が増すと、屈折率が大きく変動する媒体を通過する励起光と蛍光の両方の光路長が伸びるため、使用するセットアップに関わらず空間分解能が著しく低下します。イメージング深度に依存せずM-B-S-I-T-P-L-S-Mを用いることで、標準的なT-P-L-S-M手法と比較して、横方向分解能で約20%、軸方向分解能で220%の向上を達成しました。

成体マウスの二次リンパ器官内における免疫応答中のB細胞のクローン選択は、記憶B細胞または形質細胞へと分化するための第一段階である。このプロセスにおいて、胚中心内の免疫複合体構造レベルでの濾胞樹状細胞とB細胞の間の非常にダイナミックな相互作用が、中心的な役割を果たしていると考えられている。高解像度の生体内顕微鏡技術を用いることで初めて、この細胞間コミュニケーションと免疫応答への影響を解析することが可能となる。ここでは、濾胞樹状細胞を anti CD 2135 FAB ATO five 90 で標識して示している。

M-B-S-I-T-P-L-S-Mにより、ポップラーリンパ節の胚中心において、最大120 micronの深さまで免疫複合体沈着クラスターの次元を生体内で可視化および定量化することが初めて可能となりました。これらの画像は、従来のPMTベースの手法とM-B-S-I-T-P-L-S-Mによって取得された、胚中心における免疫複合体沈着の3D蛍光画像の直接比較を示しています。さらに、免疫複合体沈着と胚中心B細胞との相互作用を高解像度で捉えることができ、増殖、分化、またはアポトーシスに関する生体内機能プローブと組み合わせて解析することが可能になりました。

この手順を試みる際は、カメラ検出ベースの手法を用いると、標準的な光電子増倍管ベースの多光子顕微鏡と比較して、撮像速度は約8倍速くなる一方で、最大撮像深さは約25%浅くなることに留意することが重要です。このビデオを視聴することで、顕微鏡の光路調整、ビームラティスのアライメント、スキャンパラメータの算出、および最終的な高解像度画像の算出方法を含め、ストライプ照明法を用いてマルチフォールド顕微鏡をセットアップする方法について十分に理解できるはずです。これは、生体深部組織実験に適用されます。