Name: 胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶ多光子顕微鏡を用いたストライプ照明顕微鏡法で、マウスのリンパ節における免疫応答の高解像度生体内イメージングを実現します。この手法は深部組織での詳細な観察を可能にします。

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我々は、C57BL / 6、B1-8 GFPトランスジェニックマウスを提供するためのストライプ化照明手法、K. RajewskyとA.ハーバーマンの開発中に実りある議論をR. Heintzmannに感謝します。私たちは、経済的支援のために（RNに）助成金Rahel-ハーシュフェローシップの下シャリテ、（AEH）はHA5354/4-1とSFB633、プロジェクトA15、（RN）の助成金NI1167/3-1の下でドイツ学術振興を認める。私たちは、特に有益な議論やインフラをサポートするためにネットワークJIMIを認める

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).</li>
<li>Esplugues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Th17+cells+occurs+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of Th17 cells occurs in the small intestine.</a> Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Herz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+two-photon+intravital+microscopy+to+the+infrared+by+means+of+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator.</a> Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).</li>
<li>Hell, S. W., Rittweger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy%3A+Light+from+the+dark%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microscopy: Light from the dark.</a> Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).</li>
<li>Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supraresolution+imaging+in+brain+slices+using+stimulated-emission+depletion+two-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy.</a> Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).</li>
<li>Bianchini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-wavelength+two-photon+excitation+-+stimulated+emission+depletion+%28SW2PE-STED%29+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).</li>
<li>Berning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscopy+in+a+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanoscopy in a living mouse brain.</a> Science. 335 (6068), 551(2012).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).</li>
<li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGu%2C+M+%22Advanced+optical+imaging%22">Advanced optical imaging</a>. , Springer Verlag. Berlin. (2001).</li>
<li>Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shack-Hartmann-wave+front-sensor-based+adaptive+optics+system+for+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).</li>
<li>Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+in+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+A%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics in microscopy.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).</li>
<li>Niesner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+single+and+multibeam+two-photon+microscopy+for+high-resolution+and+high-speed+deep+tissue+and+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging.</a> Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).</li>
<li>Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+wave-front+correction+in+TPM+using+coherence-gated+wave-front+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).</li>
<li>Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superpenetration+optical+microscopy+by+iterative+multiphoton+adaptive+compensation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).</li>
<li>Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+via+pupil+segmentation+for+high+resolution+imaging+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues.</a> Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+laser+scanning+microscopy+through+spatiotemporal+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation.</a> Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).</li>
<li>Andresen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-resolution intravital microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (12), (2012).</li>
<li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+for+structured-illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics for structured-illumination.</a> Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).</li>
</ol>

フォルカー·アンドレセンはLaVisionバイオテック社、ビーレフェルト、ドイツの株主である。他の著者は、利益相反を持っていない。

生体内光学的イメージングの目的は、動的におよび機能的に健康と病気5における組織および器官の機能を理解するために、細胞運動性および相互作用を可視化することである。その空間分解能、コントラスト並びにその時間分解能を制限し、これを達成するための最も強力な技術、多光子レーザ走査顕微鏡法、依然として前方歪み波に関連する制限を克服しなければならず、散乱、遅い捕捉、光退色および光損傷、 。 成功を収めた2より良い励起を達成するためのソリューション（および放出）深部組織のより良好な空間分解能をもたらす、増加したコントラスト（増加による信号の増加信号対雑音比）、及び、従って、還元、光退色および光損傷における光子管理があります：アダプティブオプティクスアプローチや長い励起波長の使用-調整可能な赤外励起6。過去10年間で、波面対応の考え方適応光学素子によるctionバイオ光学イメージングにし、また、多光子顕微鏡法に天文学から転送された。最初の補償光学は、2光子顕微鏡波面センシングに依存していたとsubdiffraction参照を必要なためのアプローチが、天文学...

二光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）、赤外線、超短パルス励起1に関連の深い組織のイメージングのための利点で、様々の運動性との相互作用のパターンを明らかにすることによって、単一細胞レベルでの生命過程に関する我々の見解に革命をもたらしました動物の2-5を生きた細胞サブセット。しかし、現在の技術は、それが健康と病気における組織内の細胞応答の分子基盤に関する唯一のまばらな情報をレンダリングするので、新たな治療戦略を開発するための前提条件として臓器機能と機能障害のメカニズムを解明するために、まだ不十分である。現在の技術は、散乱による数百ミクロンの唯一の空間的な窓を可能にし、空間分解能と成体動物の非常にコンパクトな組織で特に明白である信号対雑音比6、フロント歪みの影響を振る。これらの散乱や波面歪みの影響は非常に異質ANによるものである3D空間分解能の深さに依存する劣化への第一歩でも有数の組織における屈折率のD異方性分布し、最終的に弾道励起光子、信号対雑音比、すなわち喪失に起因する信号の全損失に。生命科学や生物医学深部組織用途の観点では、これは現在の技術は、信号対雑音比の低下は、システムがいくつかを見落とす原因となるのに対して乏しい分解能は偽陽性の相互作用をもたらすので一概にセルラー通信を明らかにすることができないことを意味する薄暗い構造間の相互作用。 明白に動的な方法で細胞間相互作用を検出するために、非常に改善された空間分解能が深部組織内で必要とされる。第一励起状態の枯渇で現在導入された強力な特殊な数値計算アルゴリズムに基づいてナノスコピー技術、 例えば構造照明のアプローチ、 例えば 、 </em&gt; STED、RESOLFT、または分子の局在について、 例えば dSTORM、Palmは、固定された細胞にだけでなく、生きた細胞培養7で多くのアプリケーションを発見した。しかし、組織切片、生体組織や生物にこれらのアプリケーションを拡張するために、我々はまだ深刻な技術的な問題を克服する必要があります。二光子励起は、異なる波長で、並びに励起用の単一波長（sw2PE-STED）でSTEDおよび発光が同じで、それぞれ埋め込 ​​まれた細胞9を用いて脳切片8または人工マトリックス中に横方向の解像度を向上させるために適用された刺激標準TPLSMとして距離分解能。 1光子STEDを使用して、樹状突起棘のダイナミクスは、67〜10nm程度の分解能で生きTHY1 EGFPマウスの脳皮質（最大10から15ミクロンの深さ）の表面に画像化することができた。発生生物学のための多目的なツールは2倍に改善された2Dを提供し、多焦点構造化照明顕微鏡によって提供されている解像度。しかしながら、この技術は、例えば、ゼブラフィッシュ胚11と光散乱の低い傾向を有する生物において使用することができる。それでも、これらの技術はいずれも、出産後発症を伴う疾患の生物医学および臨床研究のための重要なモデルであり、数百μm、大人の動物の高度に散乱組織に適用することはできません。 点広がり関数（PSF）、すなわち 、回折限界の波面形状を計算するために使用される近似の独立したが、レンズを通して集束した後、光軸（距離分解能）に沿ったPSFの幅よりも少なくとも3倍大きい光軸（横方向の解像度）12に垂直PSF幅。ゼルニケの係数によって定量化異なる次数の前歪みはかなり、特に視神経に沿って、はるかに大きいのPSFにつながる深部組織イメージングに集中電磁波の波面形状を変更し、波13〜15軸A1。したがって、回折法および波面歪み効果の両方が深い組織イメージングの制限要因としての光軸に沿って解像度を指しています。ナノスの技術は、回折限界を打ち消す一方のみに焦点を当て、軸方向分解能と回折波面歪みの影響の両方に対抗してコントラストを向上させる技術は、高解像度の生体内イメージングのために必要とされる。理想的には、この技術は十分な速さで、携帯動態のモニタリングを可能にするためにもである必要があります。 PSF異常とTPLSMにおける補償光学を用いたコントラスト損失のリアルタイム補正が盛んに研究され、過去十13,14,16-18に改善され、したがって、弾道励起のより良い管理につながる現時点で得られる最善の選択であるされています光子は14。まだ、原因ほとんどはフロント補正を振ることに補償光学で使用されるアプローチ反復的であり、彼らは、HA、その小領域ごとに繰り返さなければVEの（数10×10〜2）は、組織における屈折率の高い不均一性のために、取得速度は、細胞運動性および通信を画像化するために必要なよりも著しく低い。また、適応光学における物理的限界はTPLSMはまだ回折によって決定され改善された。 illumination（SPIN）及び検出側（SPADE）上の時間変調の空間変調は、理論的に解像度を向上させるレーザ走査顕微鏡法に適用することが提案されている。生体内イメージングでの実用化はまだ19を実証されていない。 一緒になって、生きている成体動物における深部組織の画像化の解像度を向上させる技術の開発のための高い需要が存在する。本研究では、マルチビームストライプ照明多光子レーザーの走査プロセスを制御することにより、励磁パターンの空間変調を実現缶詰顕微鏡（MB-SI-MPLSM）20。励起ビーム断面が空間的に変調された構造化照明のアプローチに反して、我々は、励起の空間変調を実現するためにのみスキャン処理を用いる。より長い波長に励起を拡張することによって、我々は独立して、光の、高散乱組織（ 例えばリンパ節、自由散乱路47ミクロン6）の深部組織における空間分解能と信号対雑音比の両方を改善することができる我々は検出非線形の信号、 例えば蛍光、第二高調波発生や他の周波数ミキシング現象。 900 nmの最大励起波長でこのアプローチを用いて、我々は、マウスのリンパ節の胚中心における少数の分子の規模で動的に画像細胞タンパク質構造にできる。従って、我々は良好な抗プロービングの過程で濾胞樹状細胞およびB細胞の表面上の抗原搬送ユニット間の相互作用を視覚化することができ二次リンパ器官における免疫応答の間GEN。

<table><tbody><tr><td>ATTO590 &ndash;カップリング用NSH</td><td>ATTO Tec、ドイツ</td><td>AD-590-35</td><td></td></tr><tr><td>CD21/35 &ndash;ファブフラグメント&ndash;ATTO590</td><td>DRFZ、ベルリン</td><td></td>カップリング<td>反応は、私たちの機関の中央研究室で行われました。</td></tr><tr><td>B1-8 Jk-/- EGFP+</td><td>Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US</td><td></td><td>ジャクソン研究所(JAX)でも見つけることができます。</td></tr><tr><td>EasySep ネガティブセレクションマウスB細胞濃縮&nbsp;</td><td>StemmCell Technologies, ドイツ</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンビーズ (605), 0.2 & micro;m</td><td>Life Technologies, ドイツ</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriMScope I</td><td>LaVision Biotec, ビーレフェルト, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO (手動版)</td><td>APE, ベルリン, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II</td><td>Coherent, デュイスブルク, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浸対物レンズ、20X、NA 0.95、IR、WD 2 mm</td><td>Olympus Germany、ハンブルク、ドイツ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

生体深部組織の多光子顕微鏡による細胞の通信を監視することは、健康と病気の太い組織サンプルや臓器内の免疫細胞の運命を理解するための鍵となります。多光子顕微鏡の走査パターンを制御し、適切な数値計算アルゴリズムを適用することによって、我々は、3倍より良い軸方向分解能及び改善された信号対雑音比を達成することを可能にする、ストライプ状照明アプローチを開発し、 すなわちコントラスト、以上で標準の多光子顕微鏡法と比較して、非常にリンパ器官の組織の散乱内100μmの組織の深さ。撮像深度による磁界検出器の使用にわずかに低かったのに対し、取得速度、ならびに光退色および光損傷効果は、標準的な光電子増倍管ベースの手法と同様であった。ストライプ照明アプローチを使用することにより、我々は、二次濾胞樹状細胞上の免疫複合体沈着物の動態を観察することができる̵1;胚中心のいくつかのタンパク質分子のレベルで。

リンパ節における空間分解能効果的な点広がり関数（EPSF）の寸法は、顕微鏡12の空間分解能に対応する。我々は、（CCDカメラを用いて）確立された二光子レーザー走査顕微鏡技術、 すなわち磁界検出TPLSMと比較して我々のMB-SI-TPLSMにより、リンパ節中のコラーゲン繊維の第二高調波発生信号を取得することにより、この3次元関数を測定し、 （光電子増倍管を用いて）点検出TPLSM。 これらの測定値から、試料の表面に、両側および軸方向の解像度が回折理論20によって予測された期待値に対応する明らかになる。しかしながら、増加する撮像深さ、したがって高度に変化する屈折率を有する媒体を介して励起及び放出放射線の両方の光学経路の増加に伴って、空間分解能が独立著しく劣化する懸垂採用セットアップします（ 図2）。 MB-SI-TPLSMによって、我々は、独立して撮像深度の、約に達した。横方向の解像度と標準TPLSMアプローチに比べて220パーセントより良...

成体マウスのリンパ節における120μmの深さまでの造影による高解像度の生体内イメージングは​​、空間的に多重焦点二光子顕微鏡の励磁パターンを調節することによって達成される。 100μmの深さでは、このように散乱や回折限界を回避し、（横）487 nmおよび551 nmの（軸方向）の解像度を測定した。

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

この手順の全体的な目的は、高解像度の生体内イメージング（ intravital imaging）のために、標準的な2光子顕微鏡を準備することです。まず、レーザーの調整を含む顕微鏡の光軸調整を行い、次に、最適なビーム形状とビーム配置を実現するためにビームマルチプレクサーの調整を行います。マルチビームスキャンの場合、ストライプ照明パターンで試料をスキャンすることで生画像を取得します。最後に、アルゴリズムを適用して高解像度の最終画像を算出します。最終的に、ストライプ照明顕微鏡法を用いて、従来は生体内顕微鏡観察では不可能であったマウスリンパ節の胚中心における免疫系の挙動の詳細を明らかにします。構造照明や局在化顕微鏡などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、生体サンプルの深い組織層に適用できることです。レーザービームの形状を変更する必要がないため、手法が非常にシンプルであり、あらゆる多光子顕微鏡に容易に導入することが可能です。ここでは、最小限の光退色と最速の撮像速度で、最適な解像度とコントラスト品質を実現するための多光束二光子ストライプ照明顕微鏡のセットアップを示します。テキストプロトコルに記載されている通りにセットアップの調整を検討してください。調整後、ビームがプリズムベースパルスコンプレッサーの終端にある入射ミラーの直上に配置されたミラーに正確に戻っているかを確認します。ここから光路が設定されると、ビームはビームマルチプレクサーへと反射されます。マルチビームストライプ照明を行う場合は、スキャナーをオフにした状態で多光子顕微鏡を使用します。均一に蛍光を発する試料をステージ上に置き、レーザービームを試料内部かつ表面付近（対物レンズの前面レンズに近い位置）に集光させ、ビームマルチプレクサ内のミラーを調整してください。顕微鏡をマルチビームモードに設定し、ビーム数と偏光を選択します。例えば、蛍光スライドをイメージングしてPビームを確認する場合、Pシャッターを開き、ビームをフォーカスさせながらCCDカメラを連続的に作動させ、ビームが中心位置にあることを確認します。Pビームの調整が完了したら、64ビームモードに切り替え、対応するシャッターを開きます。ビームの位置を確認します。1枚目から5枚目のビームマルチプレクサーミラーを調整し、ビームの照射位置が等間隔になるようにします。ストライプ照明アルゴリズムはこの前提に基づいているため、均一に蛍光を発するサンプルを、不均一な構造を持つサンプルに置き換えてください。例えば、Conval領域の根のサンプルを採取し、マルチビーム画像をスキャンします。画像が鮮明で、均一かつ直線的に表示されていることを確認してください。不均一なサンプルを均一なサンプルに置き換えます。XYスキャナーを起動してスキャンプロセスを制御します。マルチビームスキャニング用のストライプ状の励起パターンを生成するため、Yスキャナーミラーをビーム照射線に対して垂直に移動させます。ブロックシフトと呼ばれるXスキャナーミラーを移動させ、ここに示されたブロック数分だけ生成されたパターンを繰り返し、長方形のストライプ画像を作成します。不均一サンプルを再び設置し、スキャナーをマスタートリガーとして使用します。カメラをスキャナーと同期させ、ストライプ画像を自動的に取得および保存し、ストライプ画像の繰り返し取得を行います。十分な繰り返し回数、シフト回数、および適切なステップ長を選択して、Xスキャナーミラーを異なる位置に移動させます。2つの連続するストライプ画像間のシフトステップは、2つの連続するビーム幅間の距離をカバーするように設定してください。Xシフトは、指定された励起波長における側方分解能の限界値より小さい値に設定します。例えば、1回のシフトあたりXスキャナーミラーを10ステップ動かし、12回または13回シフトさせることで、最高の空間分解能が得られます。共焦点領域のルートスライドを用いて、共焦点領域の画像が最も鮮明になるまでこれら2つの値を最適化します。従来のCCD画像および算出されたストライプ照明画像に対して、ラインプロファイルツールを使用してください。ラインプロファイルの幅を比較します。本例では、これは回復期の細胞壁からの蛍光信号です。スキャナーの動作に同期させて各生のストライプ画像を取得し、TIFFまたはバイナリファイルなどに個別に保存します。高解像度のストライプ照明画像の二次元行列を生成するには、評価ルーチンで一連の生のストライプ画像を行列として開いてください。深部組織におけるストライプ照明マルチビーム多光子顕微鏡観察を行うには、詳細に既述されている最小最大アルゴリズムまたはフーリエ変換ベースのアルゴリズムのいずれかを使用します。生体内で、異なる組織深さにおけるストライプ画像を経時的に取得し、既述の手法に従って評価することで、胚中心、B細胞、および濾胞樹状細胞の間の動的な相互作用を高解像度3D動画として作成します。有効点広がり関数（PSF）の次元は、顕微鏡の空間分解能に対応します。我々は、mionリンパ節におけるコラーゲン線維の第二高調波発生信号、または515 nanometersで発光する100 nanometerポリスチレンビーズの蛍光信号を取得することで、この三次元関数を測定しました。CCDカメラを用いたフィールド検出T-P-L-S-Mやポイント検出T-P-L-S-Mなどの確立された二光子レーザー走査顕微鏡技術と比較して、我々のマルチビームストライプ照明T-P-L-S-Mを使用しました。これらの測定から、試料表面において、水平方向および軸方向の分解能の両方が回折理論によって予測される期待値に一致することが明らかになります。しかしながら、イメージング深度が増すと、屈折率が大きく変動する媒体を通過する励起光と蛍光の両方の光路長が伸びるため、使用するセットアップに関わらず空間分解能が著しく低下します。イメージング深度に依存せずM-B-S-I-T-P-L-S-Mを用いることで、標準的なT-P-L-S-M手法と比較して、横方向分解能で約20%、軸方向分解能で220%の向上を達成しました。成体マウスの二次リンパ器官内における免疫応答中のB細胞のクローン選択は、記憶B細胞または形質細胞へと分化するための第一段階である。このプロセスにおいて、胚中心内の免疫複合体構造レベルでの濾胞樹状細胞とB細胞の間の非常にダイナミックな相互作用が、中心的な役割を果たしていると考えられている。高解像度の生体内顕微鏡技術を用いることで初めて、この細胞間コミュニケーションと免疫応答への影響を解析することが可能となる。ここでは、濾胞樹状細胞を anti CD 2135 FAB ATO five 90 で標識して示している。M-B-S-I-T-P-L-S-Mにより、ポップラーリンパ節の胚中心において、最大120 micronの深さまで免疫複合体沈着クラスターの次元を生体内で可視化および定量化することが初めて可能となりました。これらの画像は、従来のPMTベースの手法とM-B-S-I-T-P-L-S-Mによって取得された、胚中心における免疫複合体沈着の3D蛍光画像の直接比較を示しています。さらに、免疫複合体沈着と胚中心B細胞との相互作用を高解像度で捉えることができ、増殖、分化、またはアポトーシスに関する生体内機能プローブと組み合わせて解析することが可能になりました。この手順を試みる際は、カメラ検出ベースの手法を用いると、標準的な光電子増倍管ベースの多光子顕微鏡と比較して、撮像速度は約8倍速くなる一方で、最大撮像深さは約25%浅くなることに留意することが重要です。このビデオを視聴することで、顕微鏡の光路調整、ビームラティスのアライメント、スキャンパラメータの算出、および最終的な高解像度画像の算出方法を含め、ストライプ照明法を用いてマルチフォールド顕微鏡をセットアップする方法について十分に理解できるはずです。これは、生体深部組織実験に適用されます。

highly-resolved-intravital-striped-illumination-microscopy-germinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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の細胞内相互作用の可視化と定量化髄膜炎菌</em共焦点イメージングによるα-アクチニン>と人間

このビデオは、共焦点顕微鏡を用いたトランスジェニックマウスのγδ上皮内リンパ球(IEL)の可視化を示しています。外科的処置では、穿孔線を作成し、腸粘膜と絨毛を露出させるために縦方向に切開します。トランスジェニックマウスは、レポータータンパク質をγδ...

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ここでは、2色STEDナノスによってガラス上で要約NK細胞の細胞傷害性免疫シナプスを撮像するためのプロトコルを示す。この方法を用いて、我々は、サブ100nmシナプスタンパク質の分解能と細胞骨格を得た。...

デュアルカラータイム·ゲーティッド誘導放出枯渇（STED）ナノスによる免疫シナプスの可視化

ここでは、免疫学的シナプスを形成するガラス支持脂質二重膜技術と、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡の超解像イメージング技術の組み合わせについて説明します。このプロトコルの目標は、これら 2...

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。...

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

B 細胞受容体に対する抗体、初期段階のモデルをコーティングした coverslips に拡がっている B 細胞で同時にイメージ アクチン構造、微小管と微小管プラス端結合蛋白質に STED...

アクチンおよび誘導放出の枯渇 (STED) 顕微鏡を用いた B 細胞免疫シナプスにおける微小管細胞骨格の可視化

ここでは、光シート顕微鏡を用いた三次元 (3 D) コラーゲン マトリックスに埋め込まれた免疫細胞を可視化するためのプロトコルを提案する.このプロトコルはまた、3 D の細胞の移動を追跡する方法を詳しく説明します。3 D...

人間の免疫細胞の三次元可視化のための光シート顕微鏡

このプロトコルでは、どの自己反応性のリンパ球を運ぶ活性型緑色蛍光タンパク質 (GFP-PA)...

自己免疫の混合キメラ モデルの光活性化によって個々 の自己反応性濾胞を尋問

逆紡糸円盤共焦点顕微鏡によるマウス小腸のインビタルイメージングを用いてGFP標識γΔ...

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

このプロトコルは、免疫学的シナプス形成とその後の分極分泌トラフィックの両方を免疫学的シナプスに向かって画像化する。細胞コンジュゲートは、超抗原パルスラジ細胞(抗原提示細胞として作用する)とユルカトクローン(エフェクターヘルパーTリンパ球として作用する)との間に形成された。...

ヒト免疫シナプスのイメージング

基底膜は、発生中の組織および器官の形態形成に不可欠である。この構造の適切な配置につながるメカニズムをよりよく理解するために、提示されたプロトコルは、共焦点および超解像顕微鏡法を用いて上皮細胞における基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化および特徴付ける方法を記載している。...

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

学ぶ多光子顕微鏡を用いたストライプ照明顕微鏡法で、マウスのリンパ節における免疫応答の高解像度生体内イメージングを実現します。この手法は深部組織での詳細な観察を可能にします。

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

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