Name: 縦MRIが続く乳がんの脳転移のマウスモデルを開発するために、超音波画像誘導心臓内注射 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学ぶ超音波画像誘導心臓内注射による乳がん脳転移マウスモデルの構築法。MDA-MB231/Br-GFP細胞を用いて多発性脳転移を誘導し、9.4T MRIで経時的に観察する非侵襲的モニタリング技術を習得できます。

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私たちは、博士に感謝しています。ダイアンパルミエリおよびNCIのパトリシアSteegの私たちに、MDA-MB231Br細胞を提供するため。私たちは、技術的、合議サポートのために博士はラルフメイソン氏ジェイソンReneauさんとラモナロペスに感謝します。この作品は、DOD IDEA賞W81XWH-08-1から0583までとW81XWH-12-1から0317によって部分的にサポートされていました。 MRI実験は、NIH BTRP＃のP41-RR02584施設、高度なイメージング研究センターで行われた、超音波ガイド下心臓内注射は1S10RR02564801下VisualsonicsのVevoの770を用いて行った。

全ての動物手順は、テキサス大学南西医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認された。 1。 MDA-MB231/Br-GFP細胞の調製<ol><li> 10％FBS、1％グルタミンおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地（親切に博士パルミエおよびSteegの、NCIによって提供される）MDA-MB231/Br-GFP細胞を取り出し、培養物。 </li><li>細胞と培地の色の状態を観察し、2〜3日ごとに培地を交換してください。 </li><li>トリプシン処理およびステップ1.3.1-1.3.5に概説されるように80％のコンフルエンスに達したときに細胞を回収する。 <ol><li>完全に古い培地を除去し、穏やかに細胞を洗浄するために5ミリリットルのPBS（1X）を追加します。皿からPBSを削除します。 </li><li>皿に1.5ミリリットルのトリプシンを追加します。すべての細胞をトリプシンで覆われていることを確認するために静かにお皿を傾けてください。バックセルインキュベーターに料理を入れて、1分間37℃で保管してください。 </li><li>インキュベーターからお皿を取り出し、観察する細胞を確保するために、光学顕微鏡下で細胞が皿から外します。 </li><li>トリプシンの効果を停止する培地3ミリリットルを追加します。遠心管中の細胞の混合物を回収します。 5分間2000rpmで混合を遠心分離する。 </li><li>慎重に培地を除去し、均一になるまで5ミリリットルの無血清培地中で細胞を再懸濁。 </li></ol></li><li>適切な数の細胞をカウントし、100μl量の1.75×10 5細胞の最終濃度で無血清DMEM培地で再懸濁します。 <ol><li> 50μlの細胞混合物を取り、50μlのトリパンブルーを追加。混合した後、10μlの混合物を取り、慎重に細胞計数スライドに追加します。正確な細胞数の推定を確実にするために複数のサンプルを使用してください。 </li><li>細胞計数スライドを1つずつ終了し、細胞計数器で固執すると、自動的にカウントを開始します。すべてのカウント結果の平均を取ると、総細胞数を計算します。 </li><li>再び細胞を遠心分離し、それらを再懸濁ボリュームμL1.75×10 5 cells/100の最終濃度になるように無血清培地の適切なボリューム。 </li></ol></li><li>前心臓内注射に氷上で場所細胞。 </li></ol> 2。超音波画像誘導心臓内注射<ol><li> 6〜8週齢の間の雌ヌードマウス（BALB / C NU / NU）を使用します。 </li><li>イメージング·システムにログインします。トランスデューサー704（40 MHz）を初期化します。 </li><li>新たな研究を開始し、情報を入力します。 </li><li>麻酔（誘導室中の3％isoflurane/100％のO 2）とノーズコーンを介して全体の手順の間に、100％O 2（1 dm 3の/分）にイソフルラン（2％）を有する動物を維持する。まだ引っ込め反射はつま先のピンチで観察されていない場合に麻酔が確認された。 </li><li> 37℃に撮影台の温度を設定する仰臥位での加熱された撮影台に、麻酔したマウスをテープで固定します。 </li><li>イムの前​​に、37℃での超音波ゲルを保つ高齢化。マウスの胸部にゲルを適用します。 </li><li>ホルダーにトランスデューサを取り付けます。希望の撮像深度に達するまでトランスデューサを下げます。左心室は、ランドマークとして上行大動脈（ 図1A）で識別されるまで、ステージを移動します。左心室のクリアな視界が可視化される段階をロックします。 </li><li> 22 Gの針を1ミリリットルのシリンジに細胞混合物100μlを描画します。マウント注射器の注射器を配置し、固定します。 </li><li>マウスの胸に向けて前進注射器を移動して、慎重に針の先端が（マウスに入る前に）撮像視野に入るまでなるので、横に移動します。 </li><li>左心室ダウン目指して針の高さと角度を調整します。 </li><li>超音波イメージングの指導の下で左心室に速やかに皮膚や筋肉層を通ってインターコース空間に注射針を貫通している。 左ventriに針の挿入が成功の指標CLEは、注射器に新鮮な動脈血（暗赤色の静脈血とは対照的にピンク色）の還流である</li><li> （ 図1B）を徐々に細胞混合物を注入する。 </li><li>完了すると、針を撤回変換器を持ち上げ、湿らせたガーゼで超音波ゲルをきれいにし、テープを取り外します。 </li><li>予熱したパッドできれいなケージを準備します。 </li><li>パッドの上に動物を置き、完全に回復するまで動物を観察します。 </li><li>動物の行動2日間、24時間毎に監視します。 </li><li>一般的な条件や実験マウスにおける合併症の神経学的徴候が日常監視されています。 </li></ol> 3。頭蓋内腫瘍発生のMRIモニタリング<ol><li>脳転移の頭蓋内開発を監視するために9.4テスラの磁石を使用してください。 </li><li> 2週間腫瘍移植後のMRIを開始し、最長3週間週1回繰り返します。 </li><li> 3％のイソフルランを動物に落ち着いたし、遺伝子の下でそれらを維持するRAL麻酔（1.5％イソフルラン）。 </li><li>監視および実験を通して、動物の体温および呼吸を一定に保つ。 </li><li>高解像度マルチスライス（1ミリメートルと14スライス厚の隙間）のT 1 -とT 2強調冠状後頭蓋窩に前頭葉までの領域をカバーする画像は、次のパラメータを使用して取得されたT 1強調画像を。複数のスライス（SEMS）エコースピン、TR / TE = 400 msec/20ミリ、マトリックス：X 256 256、平面解像度のFOV 20×20ミリメートル、：X 78 78ミクロン2。 T 2強調画像：複数のスライスエコー高速スピン（FSEMS）シーケンス、TR / TE = 2500 msec/48ミリ、8エコートレイン、マトリックス：256×256、FOV 20×20ミリメートル、平面解像度：78 X 78ミクロン28,9。 腫瘍病変は、T 2強調画像上の正常な脳組織よりも明るく表示されます。 </li><li>腫瘍の大きさを手動enhanのを概説することによってT 2 -重み付け画像について決定されるボランティア8によって書き込まMATLABプログラムを用いて、各画像上での質量の一部をcing。 所与の腫瘍直径の大部分はスライス厚さ（1mm）よりも小さい、腫瘍の大きさは、平面領域ではなく、容積として提示される。 </li></ol> 4。 H＆E染色は、転移の確認<ol><li>担癌脳を解剖、すぐに最後のMRスキャン後のマウスを犠牲にして、OCT媒体でそれを埋め込み、-80℃で凍結させ</li><li>セクションクライオスタットで厚さ10μmの冠状脳標本のシリーズ。 </li><li>脳切片にH＆E染色を行う。 </li></ol>

<ol><li>Schouten, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+brain+metastases+in+a+cohort+of+patients+with+carcinoma+of+the+breast%2C+colon%2C+kidney%2C+and+lung+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma.</a> Cancer. 94, 2698-2705 (2002).</li>
<li>Lin, N. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+metastases+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">CNS metastases in breast cancer.</a> J. Clin. Oncol. 22, 3608-3617 (2004).</li>
<li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).</li>
<li>Lockman, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+blood-tumor+barrier+permeability+determines+drug+efficacy+in+experimental+brain+metastases+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).</li>
<li>Yoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bone-seeking+clone+exhibits+different+biological+properties+from+the+MDA-MB-231+parental+human+breast+cancer+cells+and+a+brain-seeking+clone+in+vivo+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in.</a> 16, 1486-1495 (2001).</li>
<li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).</li>
<li>Percy, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+changing+blood-tumor+barrier+permeability+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+metastasis%3A+a+complementary+magnetic+resonance+imaging+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach.</a> Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+MRI+evaluation+of+intracranial+development+and+vascular+characteristics+of+breast+cancer+brain+metastases+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+near-infrared+optical+imaging+of+2-deoxyglucose+uptake+by+intracranial+glioma+of+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Zhang, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+experimental+brain+metastases+produced+by+human+neoplasms+implanted+into+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice.</a> Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).</li>
<li>Mason, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+oximetry%3A+comparison+of+19F+MR+EPI+and+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).</li>
<li>Gril, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pazopanib+reveals+a+role+for+tumor+cell+B-Raf+in+the+prevention+of+HER2%2B+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

本研究では、この研究におけるすべての動物は、脳転移を発症しない動物の死亡が観察されないように、超音波画像誘導左心室注入は、正確さを保証することを実証した。画像誘導注射の美しさは最終的に左心室に皮膚の針貫通のパスとは従って、厳密な解剖学的ランドマークを必要とする手動の手順とは区別され、画像の下に監視し、調整することができるということである。 脳転移の頭蓋内開発の現在の理解は、主に動物モデル4,10上の組織学的研究に基づいています。しかしながら、組織学的研究は、通常は腫瘍移植後の異なる時点で殺されたマウスの大多数を必要とする。さらに重要なことは、個々の病変の時間的な開発についての情報は組織学的研究から、不足している。 in vivoイメージングでよりEを約束fficiency各動物はそれ自身の制御及び複数の時点となるため、順次7,11調べることができる。高解像度のT 2強調画像（310ミクロンが表示されていると小さく、直径病変）非常に早い段階で多...

脳転移は、成人において最も一般的な頭蓋内悪性腫瘍である。予後はさらに積極的な治療と4〜6ヶ月の生存期間の中央値で、非常に悪い。乳がんは脳転移1〜3の高い罹患率との三大原発性癌の一つです。いくつかの脳指向性乳癌株は、心臓内又は頚動脈内注射後4脳転移を発症することが可能である。左心室への腫瘍細胞の直接注入は、肺毛細血管床を迂回し、従って、内臓転移を最小限に抑えながら、脳転移の形成の発生率を増加させることができる。 MDA-MB231Brラインは、げっ歯類モデル5,6の脳転移を開発するために最も広く使用されているヒト乳癌株の一つである。 他の多くの研究4,7と同様に、我々は我々の以前の研究で、心臓内注射の手動手順を実行した。しかしながら、50％しか成功率は、手動で得られた前臨床試験が失敗した場合、注入し、マウスの割合を繰り返し侵襲的処置で死亡した。ここでは、無胸腺マウスの左心室に脳探索乳癌細胞の注射を確保するために画像誘導の手順の使用を導入している。縦方向の高解像度のMRIは、脳転移の頭蓋開発に追従するために適用される。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ハイクローン</td><td>SH30022.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>メディアテック</td><td>25-051-C1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>自動セルカウンター</td><td>BioRad</td><td>TC10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>イソフルランバ</td><td>クスターインターナショナル株式会社</td><td>1001936060</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>VisualSonics Vevo 770 高解像度イメージングシステム&nbsp;</td><td>株式会社ビジュアルソニックス</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>9.4 T 水平ボア磁石と Varian INOVA Unity システム&nbsp;</td><td>アジレント</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>O.C.Tコンパウンド</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

縦mriが続く乳がんの脳転移のマウスモデルを開発するために、超音波画像誘導心臓内注射

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

乳癌脳転移は、ステージIVで乳癌患者の30％で生じる、高い死亡率と関連している。生存期間の中央値は6ヶ月です。それは、臨床シナリオにおける転移細胞の広がり血行動態を模倣するために適切な動物モデルを有することが重要である。ここでは、無胸腺ヌードマウスの左心室に脳熱帯乳癌細胞の正確な注入を案内する小動物超音波イメージングの使用を導入している。縦方向のMRIは、脳転移の頭蓋内の開始と成長性を評価するために使用されます。超音波ガイド下心臓内注入は、正確な注入とここに高い成功率だけでなく、確実にだけでなく、大幅に我々の以前の手作業に比べて、死亡率を減少させた。 インビボ高解像度MRIは310程度と小さいように、高信号多発性病変の可視化を可能にする3週間のT 2強調画像上の直径で注射後。 FollowはアップMRIは頭蓋内腫瘍の増殖および脳全体にわたって分配する転移の数の増加を明らかにする。

MRI（平面解像度78ミクロン）の高空間分解能で、高信号病変は、直径が310ミクロン（ 図2）のように小さいとして同定することができる。本研究では転移は非常に小さく、壊死や浮腫の開発が最小限であることから、T 2強調画像上の高信号病変は真に腫瘍塊を表していた。 長手MRI研究は、腫瘍成長のインビボで非侵襲的評価を可能にする。 図3に示すように、高解像度MRIを3週間心臓内注射（ 図3A）の後にいくつかの小さな病変を検出することができた。週4日、前回のスキャンすべてに見られた病変は大きくなった。より多くの新たな病変は、T 2強調画像（ 図3B）に登場した。 H＆E染色は、拡散またはクラスタのどちらのタイプの転移性病変（ 図4）を明らかにした。拡大された血管は、多くの場合、nonsprouting血...

乳癌脳転移マウスモデルをMDA-MB231/Br-GFP細胞の超音波画像誘導の心臓内注射で確立される。多焦点頭蓋内転移の発生は、高解像度の9.4 T MRIを用いて長手方向にモニタされた。

縦MRIが続く乳がんの脳転移のマウスモデルを開発するために、超音波画像誘導心臓内注射

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

本手順の全体的な目的は、超音波ガイドを用いて乳がん脳転移マウスモデルを構築し、その後MRIでモニタリングすることです。これは、脳親和性を持つ乳がん細胞を回収し、左心室に注入することで達成されます。その後、超音波ガイドの補助により、頭蓋内腫瘍の発達をモニタリングします。MRIを用いて、H&amp;E染色により転移を確認します。最終的に、画像誘導による正確な注入を行うことで、乳がん脳転移の形成、進展、およびモニタリングの成功率を大幅に向上させることができます。縦断的なMRI観察により、乳がんの形成と進展を非侵襲的にモニタリングすることが可能になります。すべての動物実験の手順は、テキサス大学南西部医学センターの施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。本プロトコルのために、10% FBS、1% グルタミン、および 1% ペニシリン・ストレプトマイシンを含む DMEM 培地で培養した M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P 細胞を用意します。常に細胞の状態を監視し、2～3日ごとに培地を交換してください。80% のコンフルエンスに達したら、トリプシン処理して細胞を回収します。まず、バキュームピペットを用いて古い培地を完全に除去します。次に、5 mLのPBSを加え、すべての細胞がPBSで覆われるまで優しく洗浄します。その後、洗浄液を除去します。次に、1.5 millilitersのtrypsinをディッシュに加えます。ディッシュをゆっくりと傾け、すべての細胞がtrypsinで覆われていることを確認してください。ディッシュを37 °Cの細胞インキュベーターに戻します。1分間待機し、顕微鏡下で細胞を観察します。細胞が丸くなり浮遊していれば、剥離したことになります。3 mLの培地を加えて消化を停止させ、細胞混合液をピペットで遠心管に transfers します。混合物を1,160 Gで5分間遠心分離します。次に、真空ピペットを用いて培地を慎重に除去します。続いて、細胞ペレットが見えなくなり、50 µLの細胞混合液を観察した際に溶液が均一に見えるまで、ピペットを用いて5 mLの無血清培地で細胞を緩やかに再懸濁します。十分に混合した後、トリパンブルーを50 µL加えます。その後、細胞計数用スライド数枚に10 µLずつ分注します。そして、細胞カウンターの値から細胞数をカウントします。全カウント数の平均値を算出し、それを用いてください。次に、より精度の高い細胞懸濁液を作成します。再度遠心分離し、無血清培地100 µLあたり175,000個の細胞となるように再懸濁します。その後、心腔内注射に備えて細胞を氷上で保存します。本プロトコルでは、6〜8週齢の雌のBCヌードマウスを使用してください。イメージングシステムにログインし、トランスデューサを初期化します。40 MHzで7 0 4に設定します。新規スタディを開始し、案内に従って情報を入力してください。次に、マウスを麻酔し、ノーズコーンを介して麻酔薬を投与します。ガイド下注入を行う際、イメージングテーブルの温度を37 °Cに設定し、マウスを仰臥位でテーブルにテープで固定します。超音波用ゲルはイメージング前に37 °Cに保ち、マウスの胸部に塗布します。次に、トランスデューサーをホルダーに装着し、目的のイメージング深度まで下げます。次に、上行大動脈を指標として左心室が特定できるまでステージを移動させ、視野が最も鮮明な位置でステージを固定します。次に、22ゲージの針を装着した1mLシリンジに、冷却した細胞混合液を100 µL吸引します。充填したシリンジをシリンジマウントに固定します。次に、シリンジを胸部の方へ移動させます。マウスに刺入する前に、針先がイメージングの視野に入るまで、慎重に左右に動かして位置を確認します。左心室を標的とするように針の高さと角度を調整し、位置が決まったら、速やかに皮膚と筋肉層を貫通して針を左心室に刺入します。超音波像でガイドしながら、左心室への挿入が成功したかどうかの指標は、鮮やかなピンク色の動脈血がシリンジ内に逆流することです。その後、細胞混合液をゆっくりと注入し、針を抜き、トランスデューサを持ち上げてから、湿らせたガーゼで超音波ジェルを拭き取ります。次に、テープで固定していた動物を離し、予熱したパッドのある清潔なケージに移します。マウスが完全に回復するまで観察し、その後数日間、毎日状態を確認します。プレーン解像度の78 square micronを用いることで、直径310 micronsのMRI高信号病変を同定できます。本研究における転移巣は非常に小さく、壊死および浮腫も最小限であったため、T2強調画像における高信号病変は実際に腫瘍を表していました。大規模な縦断的MRI研究により、腫瘍増殖の非侵襲的な生体内評価が可能になります。高解像度MRIでは、心腔内投与から3週間後に複数の小さな病変が検出され、4週目のスキャンでは、前回のスキャンで確認された病変はすべて増大していました。T2強調画像では、さらに多くの新しい病変が現れました。H&amp;E染色により、びまん性転移病変またはクラスター型転移病変が認められました。腫瘍の周囲にはしばしば拡張した血管が見られ、非出芽性血管新生が起こっていることが示されました。このビデオを視聴することで、マウス心臓の左心室への超音波画像ガイド下針注入法の実施方法について十分に理解できるはずです。

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