縦MRIが続く乳がんの脳転移のマウスモデルを開発するために、超音波画像誘導心臓内注射

本手順の全体的な目的は、超音波ガイドを用いて乳がん脳転移マウスモデルを構築し、その後MRIでモニタリングすることです。これは、脳親和性を持つ乳がん細胞を回収し、左心室に注入することで達成されます。その後、超音波ガイドの補助により、頭蓋内腫瘍の発達をモニタリングします。

MRIを用いて、H&E染色により転移を確認します。最終的に、画像誘導による正確な注入を行うことで、乳がん脳転移の形成、進展、およびモニタリングの成功率を大幅に向上させることができます。縦断的なMRI観察により、乳がんの形成と進展を非侵襲的にモニタリングすることが可能になります。

すべての動物実験の手順は、テキサス大学南西部医学センターの施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。本プロトコルのために、10% FBS、1% グルタミン、および 1% ペニシリン・ストレプトマイシンを含む DMEM 培地で培養した M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P 細胞を用意します。常に細胞の状態を監視し、2～3日ごとに培地を交換してください。80% のコンフルエンスに達したら、トリプシン処理して細胞を回収します。

まず、バキュームピペットを用いて古い培地を完全に除去します。次に、5 mLのPBSを加え、すべての細胞がPBSで覆われるまで優しく洗浄します。その後、洗浄液を除去します。

次に、1.5 millilitersのtrypsinをディッシュに加えます。ディッシュをゆっくりと傾け、すべての細胞がtrypsinで覆われていることを確認してください。ディッシュを37 °Cの細胞インキュベーターに戻します。

1分間待機し、顕微鏡下で細胞を観察します。細胞が丸くなり浮遊していれば、剥離したことになります。3 mLの培地を加えて消化を停止させ、細胞混合液をピペットで遠心管に transfers します。

混合物を1,160 Gで5分間遠心分離します。次に、真空ピペットを用いて培地を慎重に除去します。続いて、細胞ペレットが見えなくなり、50 µLの細胞混合液を観察した際に溶液が均一に見えるまで、ピペットを用いて5 mLの無血清培地で細胞を緩やかに再懸濁します。

十分に混合した後、トリパンブルーを50 µL加えます。その後、細胞計数用スライド数枚に10 µLずつ分注します。そして、細胞カウンターの値から細胞数をカウントします。

全カウント数の平均値を算出し、それを用いてください。次に、より精度の高い細胞懸濁液を作成します。再度遠心分離し、無血清培地100 µLあたり175,000個の細胞となるように再懸濁します。

その後、心腔内注射に備えて細胞を氷上で保存します。本プロトコルでは、6〜8週齢の雌のBCヌードマウスを使用してください。イメージングシステムにログインし、トランスデューサを初期化します。

40 MHzで7 0 4に設定します。新規スタディを開始し、案内に従って情報を入力してください。次に、マウスを麻酔し、ノーズコーンを介して麻酔薬を投与します。

ガイド下注入を行う際、イメージングテーブルの温度を37 °Cに設定し、マウスを仰臥位でテーブルにテープで固定します。超音波用ゲルはイメージング前に37 °Cに保ち、マウスの胸部に塗布します。次に、トランスデューサーをホルダーに装着し、目的のイメージング深度まで下げます。

次に、上行大動脈を指標として左心室が特定できるまでステージを移動させ、視野が最も鮮明な位置でステージを固定します。次に、22ゲージの針を装着した1mLシリンジに、冷却した細胞混合液を100 µL吸引します。充填したシリンジをシリンジマウントに固定します。

次に、シリンジを胸部の方へ移動させます。マウスに刺入する前に、針先がイメージングの視野に入るまで、慎重に左右に動かして位置を確認します。左心室を標的とするように針の高さと角度を調整し、位置が決まったら、速やかに皮膚と筋肉層を貫通して針を左心室に刺入します。

超音波像でガイドしながら、左心室への挿入が成功したかどうかの指標は、鮮やかなピンク色の動脈血がシリンジ内に逆流することです。その後、細胞混合液をゆっくりと注入し、針を抜き、トランスデューサを持ち上げてから、湿らせたガーゼで超音波ジェルを拭き取ります。次に、テープで固定していた動物を離し、予熱したパッドのある清潔なケージに移します。

マウスが完全に回復するまで観察し、その後数日間、毎日状態を確認します。プレーン解像度の78 square micronを用いることで、直径310 micronsのMRI高信号病変を同定できます。本研究における転移巣は非常に小さく、壊死および浮腫も最小限であったため、T2強調画像における高信号病変は実際に腫瘍を表していました。

大規模な縦断的MRI研究により、腫瘍増殖の非侵襲的な生体内評価が可能になります。高解像度MRIでは、心腔内投与から3週間後に複数の小さな病変が検出され、4週目のスキャンでは、前回のスキャンで確認された病変はすべて増大していました。T2強調画像では、さらに多くの新しい病変が現れました。

H&E染色により、びまん性転移病変またはクラスター型転移病変が認められました。腫瘍の周囲にはしばしば拡張した血管が見られ、非出芽性血管新生が起こっていることが示されました。このビデオを視聴することで、マウス心臓の左心室への超音波画像ガイド下針注入法の実施方法について十分に理解できるはずです。