Name: 町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 学ぶ改良型ウェスタンブロット法。Bis-Trisゲル電気泳動と赤外線蛍光イメージングを用いて、タンパク質検出の分解能と感度を向上させ、実験時間を大幅に短縮する高速プロトコルです。

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我々は彼らの支援とサポートのためのマクマホン研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。この研究は、NIH / NCI R01 CA176839-01（MM）と制度研究学問的なキャリア開発賞（JSへIRACDA）からの補助金によって支えられている。

1。細胞培養からの全細胞溶解物の調製<ol><li>氷上で細胞培養皿を置き、5mMのEDTA（5 mMのEDTA/10 CM 2プレートとのPBS 例えば 5ml）で冷PBSを追加します。セルスクレーパーを用いて皿から接着細胞を除去した後、冷たい15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> 4℃で5分間1,000 rpmで（230×g）で低速遠心分離により細胞懸濁液をペレット氷の上に円錐形のチューブをセットし、慎重にペレットを中断することなく、上清を吸引除去する。 </li><li> 5mMのEDTAを含むPBS 1mlでペレットを洗浄し、冷たい1.5ミリリットル遠心チューブに細胞懸濁液を移す。細胞をペレットに10秒間、13,000 rpmで（13226×g）でクイックスピンサスペンション。慎重に氷上でペレットと場所のチューブを中断せずに上清を除去します。 </li><li>で、（ つまり、3×10 6個の細胞のためのRIPA緩衝液の〜150μLを加えペレットサイズに応じて）25〜200μL中でペレットを再懸濁RIPA緩衝液（50mMトリス、150mMのNaCl、0.5mMのEDTA、10mMのNaFを、0.1％SDS、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1％NP-40）2×最終濃度で新たに追加されたプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む。簡単に言えば、各チューブをボルテックスし、氷上で20〜30分のために停止をインキュベートする。注：タンパク質およびそれらの変性界面活性剤（ すなわち、SDS、トリトンX-100、またはNP-40）の強度を可溶化する能力が異なるタンパク質を抽出するために使用できるいくつかの溶解緩衝液が存在する。 RIPA緩衝液は、全細胞溶解物を調製し、タンパク質 - タンパク質相互作用を破壊するために有用である。 </li><li> 4℃で5分間14,000 rpmで（15339×g）で、ポスト核分画、遠心溶解物を作成するには氷の上で核濃縮ペレットと場所のチューブを中断することなく、新しいチューブに上清を移します。注：上清を抽出しながら、核濃縮ペレットを、チューブから切り離すことがあります。核に富んだペレットを集めないようにするには、私が直接ピペットチップを配置粘性の核に富んだペレットNTO、それを処分するために、ピペットでそれを描画します。 </li><li> BCA又はブラッドフォードなどのタンパク質定量アッセイを使用して製造業者の指示に従って、各サンプルのタンパク質濃度を決定する。 </li></ol> 2。サンプルの調製および電気泳動<ol><li>以下に概略次の表に従って各サンプルを準備します。代替として、β-メルカプトエタノールはまた、2.5％の最終濃度で使用することができる。しかし、還元剤は、ゲルをロードする前に、各サンプル時間までに添加されるべきである。ウェルあたりロードされた各調製した試料のわずか20μlのピペット操作のバリエーションの合計容量を占めています。 <table border="1"><tbody><tr><td>試薬</td><td>減少したサンプル</td></tr><tr><td>タンパク質試料</td><td> XμL </td></tr><tr><td> 4X LDSサンプルバッファー</td><td> 6μL </td></tr><tr><td> 500 nMのDTTレッドucingエージェント</td><td> 2.4μL </td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td>最大15.6μL </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 24μL </td></tr></tbody></table></li><li> 10分間、70°Cでの加熱試料。サンプルが加熱している間、（50ミリリットルの20倍のMESまたはMOPSランニングバッファーを加えた950ミリリットルの脱イオン水）をランニングバッファー1X MESまたはMOPSの千ミリリットルを用意。 MESがバッファを実行すると、ランニングバッファーMESが速くMOPS 4よりも実行することができます低いpKaを持つ2〜200 kDaの間のより小さな分子量のタンパク質を解決するのに対し、MOPSランニングバッファーは、14から200 kDaの間の中間サイズのタンパク質を解決します。従って、これら2つのバッファがタンパク質バンド4の分離の違いにつながるスタッキングゲル内のイオンの移動に影響を対比している。取っておくと酸化防止剤の500μlのランニングバッファー1X MESまたはMOPSの200ミリリットルを組み合わせ、最小の上部バッファー商工を埋めるために使用されるI細胞電気泳動装置。 </li><li>サンプルは、氷の上にそれらを配置する前に加熱、クイックスピンサンプルを完了したら。 </li><li>電気泳動用ミニ電池ユニットへのプレキャストBis-Trisゲルの組み立てについては、製造元の指示に従ってください。注：各ゲルは各ゲルの短い（小さい）カセットをバッファコアに向かって内側に面しており、ゲルはレベルであり、しっかりと上部バッファーチャンバーからの漏れを回避するためのバッファコアに押し付けるようなやり方で配向されていることを確認してください。 </li><li> 1X MESや抗酸化剤および1X MESまたはMOPSランニングバッファーを約600ミリリットルとミニセルユニットの下部バッファ商工を含むMOPSランニングバッファー200mlで上部バッファーチャンバーを埋める。ランニング緩衝液の余分200〜300ミリリットル、後で使用するために保存することができる。しかし、緩衝液のpHと品質が変更することができるように、電気泳動の実行中に使用されるバッファを再利用することは推奨されません。 </li><li>ロード各タンパク質SAMP20μlのルの各ウェルに。複数の抗体（ すなわち 2つ以上）を探るために、種々のストリップに膜を区画した場合、それは非常にこれはとなるように各ゲルの最初と最後のウェル中予備染色タンパク質標準の2-5μLをロードすることをお勧めしますタンパク質バンドの画像化に影響を与えることなく、膜の異なる部分を分離するための切断ガイド。 </li><li>最後にスタートし、ゲルあたり70〜80ミリアンペアで110〜125ミリアンペア/ゲルの期待される電流で35分間200 V一定にゲルを実行します。追跡用色素がバッファコアに沿って白金線に移行するときに電気泳動が完了します。 </li></ol> 3。 iBlotドライブロッティングシステムを用いたタンパク質導入<ol><li>完全に（これはパチパチノイズが発生する場合があります）、カセットの結合した側面を破ってミニゲルを分離する。短い（小さい）プレートを捨て、慎重に脱イオン水で容器に長い（マイナス）プレートからゲルを転送し、底部にあるゲルの厚い足の部分を削除します。注：まれに、ゲルは長い短いプレートの代わりに取り付けることができる、プレートスロット付き。この場合は、より長い、溝付きプレートを破棄し、一番下にあり、ゲルの厚い足の部分を削除します。その後、慎重に脱イオン水に短いプレートからゲルを移す。 </li><li>製造業者の指示に従って、アノードとカソード転写スタックを組み立てる。注：両方のニトロセルロースまたはPVDF膜は、タンパク質の高品質かつ効率的な転送を提供し、蛍光検出8と互換性があります。しかし、PVDF膜は、ニトロセルロースよりも高い結合容量（240μgの/ cm 3）と （200μgの個/ cm 3）8を持っています。 </li><li>慎重にこれを転送中にタンパク質バンドの歪みを防ぐことができますようにゲルと膜の間に閉じ込められた気泡や空気を除去。注：膜または変圧トリムしない小胞体これは、アノードとカソードのスタックとの間の直接的な接触を引き起こすとしてゲルサイズに合わせてスタック。 </li><li>正しく転送を組み立てた後、ドライブロッティング装置上にスタック、適切な電圧プログラムを選択します（ つまり、プログラム3：7分20 V）を、転送を開始します。注意：150 kDaのより大きいタンパク質は、よりゆっくりと移動する傾向があり、8月10日分の長い転送時間が必要な場合があります。また、5〜10分間、20％エタノール中のゲルのインキュベーション前は、これらの大きなタンパク質の転写効率を向上させることができます。転送プログラムが完了すると、デバイスは自動的に電流を遮断します。それはすぐに膜を除去し、より良いタンパク質の検出を確実にし、膜を乾燥を避けるためにブロック化手順を続行することをお勧めします。 </li></ol> 4。赤外蛍光タンパク質検出<ol><li> 1時間ブロッキングバッファーオデッセイ（トゥイーン20を追加しないでください）の0.8ミリリットル/ cm 2の最小のブロック膜（S）または4℃で一晩膜（単数または複数）はまた、しかし、これはより高いバックグラウンドを生じ、タンパク質の検出を妨害し得る、無脂肪乾燥ミルクでブロックすることができる。 </li><li> 4℃で一晩、0.1％Tween-20をOdysseyブロッキング緩衝液中の所望の濃度で一次抗体にメンブレン（複数可）をインキュベート二つの異なる抗原が同じブロット上で可視化した二色検出のための二次抗体は、異なる宿主種に由来しなければならず、膜（単数または複数）に同時に添加した。注：前の一次抗体で膜（複数可）をインキュベートし、膜（s）は同じ膜上に複数の抗体（ すなわち 2つ以上）のためにプローブするために、種々の小片に区分され得る。 </li><li>穏やかに振盪しながら、TBS中で10分間メンブレン（S）3X +0.1％のTween-20を洗ってください。 </li><li> Odysse 800 nmのチャネルのために700 nmのチャネルのために1:20,000の希釈で蛍光標識した二次抗体を用いた膜（複数可）をインキュベートし、1:6,000-1:10,000yが（より長い1時間膜（複数可）をインキュベートすると、バックグラウンドを増加させることができる）、30〜60分間、0.1％Tween-20でブロッキングバッファー。光から膜（複数可）を保護します。注：二次抗体が一次抗体のそれぞれと同じ宿主種に由来し、異なる蛍光体で標識される必要がある。 </li><li>穏やかに振盪しながら、TBS中で10分間メンブレン（S）3X +0.1％のTween-20を洗ってください。光から膜（複数可）を保護します。 </li><li>スキャンされ、赤外線イメージングシステムで画像化されるまで、膜（単数または複数）Tween-20で4℃にてずに乾燥又はTBSまたはPBSのいずれかに格納されてもよい。適切に遮光している場合、蛍光シグナルは、数ヶ月間安定したままになります。 </li></ol>

<ol><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li>
<li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iBlot+Dry+Blotting+System%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Technologies+Corporation%22%5BJournal%5D)">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blot+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22LI-COR+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030%5BTitle%5D)+AND+%22LI-COR+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li>
<li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Milk+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li>
<li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルによれば、高品質の定量的なウエスタンブロットを生成する際の重要なステップは以下の通りである：1）タンパク質濃度を測定するステップと、2）試料調製、3）膜をブロッキングし、4）一次抗体の品質および口径。 総タンパク質濃度の測定精度は、赤外蛍光検出の感度は例外的なサンプルのタンパク質濃度で検出されたわずかな違いを増幅するので、タンパク質のバンドを定量化に大きな影響を有することができる。できるだけ1に近い線形回帰線又はR二乗値と標準曲線を生成し、タンパク質濃度を決定する不一致を回避するために（R 2≥150以上）を各試料のタンパク質濃度の正確な計算に重要である。例えば、R 2値は、超純水で新鮮なBSA標準を調製し、慎重に繰り返し、150を下回った場合タンパク質定量アッセイは、R 2の値を増加させるのに役立ち得る。これはサンプルのタンパク質濃度の減少の R 2の値と不正確に寄与することができるペッティングに不整合が発生しますように、それはマルチチャンネルピ ​​ペッタ...

<html>ウエスタンブロッティングの技術は最初の抗体1-3を使用してタンパク質を検出するためのより良い方法を作成するために、1977年と1979年の間に開発されました。この手順では、二次抗体を用いて可視化し、オートラジオグラフィー、UV光、又はペルオキシダーゼ反応生成物3により検出された標的タンパク質とSDS-PAGEゲルからメンブレンへのタンパク質の電気泳動転写を利用した。したがって、これらの同じ基本原理が依然として広く、今日のウエスタンブロットプロトコルで使用される。しかし、この古典的なウェスタンブロッティング技術は、低速の電気泳動の実行時 ​​間、低い解像度と人工タンパク質バンド、タンパク質分解に対する感受性、および限定された感度だけでなく、データ品質4として存在する多くの欠点を行います。したがって、このプロトコルは、より正確な定性および定量的データを生成し、標準的なウェスタンブロット手順に大きな進歩と改善について説明します。 &quot;&gt; SDS-PAGEを用いてタンパク質の広い範囲を分離するためのLaemmliシステムがこのウェスタンブロッティングシステムの人気にもかかわらず。ウェスタンブロッティング5に最も広く使用されているゲルシステムであり、この方法は、バンド歪み、解像度の損失、およびもたらし得るこれは、分離ゲルの高pH（9.5）に起因するタンパク質の脱アミノ化およびアルキル化の結果、ゲルの様々な酸化還元状態による減少ジスルフィド結合の再酸化、およびアスパ-プロリルの切断であるスプリアスバンド4。 Laemmli緩衝液（pH 5.2）、4,6タンパク質を加熱することによるペプチド結合、中性pH（7.0）で動作Lamemmliシステムよりも有意な利点を提供するのBis-Trisゲルシステム、このシステムは、タンパク質安定性、最小限を改善するタンパク質修飾は、その縮小状態でタンパク質を維持する電気泳動中アスパルチル-プロリル切断を防止し、より重要なことに、電気泳動実行時 ​​間tは、さらに35分間4,6,7ある彼のBis-Trisゲルシステムはまた、シャープなバンドは、高解像度化、分離、およびより信頼性の高いデータが得られる増大した感度を生成する4。 ビス-Trisゲルシステムと共に、iBlotドライブロッティングシステムは、著しく7分以内膜上にゲルからのタンパク質の転送時間を減らすために高い電界強度および電流を使用する。この搬送システムは、タンパク質8のより効率的で信頼性の高い転写を生成するドライブロッティング法に基づいている。従来の転写システムにiBlot転送システムの有効性の詳細な比較については、次のWebサイトを参照してください。 <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html .これは、イオンリザーバ8として作用する適切な転写緩衝液を含有するゲルマトリックスから構成され、アノードとカソードのスタックを利用する。転送中に、水の電気分解は、バンド8歪みを引き起こすことなく、より一貫性のタンパク質転写を生じる銅アノードからの酸素の発生を防止するのに役立つ。また、この転写システムはまた、電極8間の距離を減少させることによって転送速度を増加させる。 化学発光ウェスタンブロットのタンパク質検出のための最も一般的かつ伝統的な技法であるが解析し、二色赤外蛍光検出感度が大きく、品質、およびウェスタンブロットデータの精度を向上させることができる。この検出方法は、2つの最適な波長700nmの赤外線レーザー励起を使用しておよび800 nmの最大の信号対雑音比及び最高感度9鮮明な画像データを生成する。従って、2つの標的タンパク質は700 nmおよび800 nmの蛍光検出チャネルを使用して、同じ膜上で同時に可視化することができる。より重要なことには、赤外蛍光の線形性およびダイナミックレンジは強弱両方のタンパク質バンド9の正確な定量分析を可能にする。さらに、このプロトコルは、これらのプロセスの有効性を損なう、より大きな定性的および定量的ウェスタンブロットデータを生成するために赤外蛍光タンパク質検出を利用せずにこの実験の電気泳動および転写回数を減少させることによって、古典的なウェスタンブロッティング技術を超える多大な利点および改善を提供する。

<table><tbody><tr><td>BCAタンパク質アッセイキット</td><td>Thermo Scientific/Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4x NuPAGE LDS Sample Buffer&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x NuPAGEサンプル還元剤&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>20x NuPAGE&reg;MES SDS ランニングバッファー</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>20x NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 抗酸化剤</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock ミニセル&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB4010-01</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Stack, PVDF Mini</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB4010-02</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB3010-01</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Stack, ニトロセルロース Mini</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB3010-02</td><td></td></tr><tr><td>iBlot ゲル転写装置&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB1001</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin</td><td>Sigma</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-BIM (S69)</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Total BIM</td><td>Epitomics</td><td>1036-1</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>Total ERK1/2</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9107</td><td></td></tr><tr><td>オデッセイ ブロッキング バッファ&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW ヤギ抗ウサギIgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680LT ヤギ抗マウスIgG&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68020</td><td></td></tr><tr><td>ウエスタンインキュベーションボックス、ミディアム&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>929-97205</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Classic Imaging System</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Application Software V3.0.30</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

もともと1970年代後半に設立されたウエスタンブロット法はまだ積極的に、今日利用されている。しかし、ウエスタンブロッティングのこの伝統的な方法は、低品質の解像度、スプリアスバンド、感度が低下し、貧困層のタンパク質の完全性を含むいくつかの欠点がある。最近の進歩は、劇的に高い定性的および定量的データを生成するために標準的なウェスタンブロットプロトコルの多くの側面を改善している。ビス - トリスゲルシステム、従来のLaemmliシステムに代わるものは、良好なタンパク質の分離及び解像度を生成し、タンパク質の完全性を維持し、35分の実行時間電気泳動を低減する。また、iBlotドライブロッティングシステムは、飛躍的に多くの場合、長い転送時間でより多くの非効率的であり、従来のタンパク質導入の方法とは対照的である7分、内膜へのタンパク質導入の有効性と速度を向上させます。これらの非常に革新的な改良、タンパク質Dと組み合わせて、化学発光の標準的なウェスタンブロッティング技術と比較して、より高品質、より正確で一貫性のあるデータにおける赤外蛍光イメージング結果を用いてetection。この技術は、同時に異なる蛍光チャネルで可視化された二色近赤外色素を利用して同じ膜上の2つの異なる抗原を検出することができる。さらに、蛍光イメージングの直線性と広いダイナミックレンジは強弱両方のタンパク質バンドの正確な定量が可能になります。したがって、このプロトコルは、大きく、この実験の実行時間を低減しつつ、これらの進歩は著しく、データの質を向上する古典的なウェスタンブロッティング法、カギ改良を記載している。

二色赤外蛍光感度が向上し、鮮明ウェスタンブロット画像を生成するために最高の信号対雑音比と同じ膜上に強弱両方のバンドを検出する。 700 nmおよび800 nmの蛍光チャンネルの両方において可視化二色ウェスタンブロット検出によって生成された典型的な結果を図1および図2に例示されている。 図1の最上段のウェスタンブロットは、ヒト由来の溶解物の二倍連続希釈液の700 nmのチャネル（赤）で800 nmのチャネル（緑）およびβ-アクチンの総ERK1 / 2の同時（オーバーレイ）検出を示すメラノーマ細胞株、WM793を由来。さらに、この膜は、同じブロット上で検査される二つ以上の抗体を可能にするために、所望のタンパク質標的の分子量に基づいて、セクションに切断されている。例えば、 図1で分析膜は、下部ポートをプローブするために、半分に切断した総ERK1 / 2およびβ-アクチンの両方の検出を推論することなく、第三の抗体は、総BIM（700 nmのチャネル赤）と膜のイオン。 図2の最初...

このプロトコルは、ウエスタンブロット分析を行う上での最新の進歩を探る。これらの新規な修飾は、35分間の電気泳動の実行時間を7分乾燥ブロッティング転送システムのBis-Trisゲルシステムを採用して、高解像度、品質、感度、およびウエスタンのデータの精度向上を発生する赤外蛍光タンパク質検出およびイメージング。

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

この手順の全体的な目的は、従来のウェスタンブロッティング法における主要な改善点らを特定し、ウェスタンデータの解像度、品質、感度、および正確性を向上させることです。まず、タンパク質の完全性を維持しつつ、タンパク質の還元とアルキル化に最適な条件を提供するため、リチウムESAL硫酸を含むバッファーを用いてサンプルを調製します。次に、35分で電気泳動が完了するBIS-trisゲルシステムを用いてタンパク質を分離します。次に、EyeBlotドライブロッティングシステムを用いて、7分間でタンパク質をメンブレンに転写します。最終ステップでは、2つの異なる蛍光チャンネルで近赤外線色素を利用した赤外線蛍光イメージングを行い、同一メンブレン上の2つの異なる抗原を同時に可視化してタンパク質を検出します。最終的に、従来のウェスタンブロッティング法にこれらの新しい改良を加えることで、この手法の所要時間を大幅に短縮しつつ、より正確な定性的および定量的データを得ることができます。この手法の既存のウェスタンブロッティング法に対する主な利点は、ウェスタンデータの有効性、一貫性、および感度が向上し、同一のメンブレン上で複数の標的タンパク質の正確な定量が可能になると同時に、手法の実行にかかる実験時間を大幅に短縮できることです。まず、15 mLコニカルチューブと、ほぼコンフルエントな10 cm四方の細胞培養ディッシュを氷上に置きます。次に、セルスクレーパーを用いて、各ディッシュに5 mM EDTAを含む氷冷PBSを5 mL加えます。ディッシュから付着細胞を除去し、細胞懸濁液をあらかじめ冷却しておいた15 mLコニカルチューブに移します。次に、230 ×gの低速遠心分離で5分間、4 °Cにて細胞懸濁液をペレット化します。完了後、コニカルチューブを氷上に置き、細胞ペレットを乱さないように注意しながら上清を吸引除去します。5 mM EDTAを含む冷却したPBS 1 mLでペレットを洗浄し、細胞懸濁液を冷却した1.5 mL遠心チューブに移します。次に、懸濁液を約13,000 Gで10秒間遠心し、細胞をペレット化します。遠心後、ペレットを崩さないように注意して上清を除去し、チューブを氷上に置きます。次に、2倍濃度のプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤をRipa Bufferに添加します。その後、Rippa bufferを用いて、細胞密度が1 mLあたり20 million cellsとなるように細胞を再懸濁します。各チューブを軽くボルテックスし、懸濁液を氷上で20〜30分間インキュベートします。ライセートを約15,000 Gsで5分間遠心分離し、前核画分を調製します。4°Cで、SNATを新しいチューブに移し、そのチューブを氷上に置きます。この時点で、核が濃縮されたペレットは廃棄できます。次に、BCA

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この技術記事では、Invitrogen社から市販されてNuPAGE電気ミニゲルシステムを使用して標準的なウェスタンブロッティング手順を説明します。...

西洋は、Invitrogen NuPage NOVEXビストリスミニゲルを用いたウェスタンブロット

ウエスタンブロット法は、組織ホモジネートまたは抽出物の特定のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用される分析手法です。...

ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

このビデオでは、免疫沈降したライセートの化学発光に基づくウェスタンブロッティングについて説明しています。この技術は、タンパク質のプロセシングと活性化を決定するのに役立ちます。検出される化学発光シグナルは、その活性化中のタンパク質プロセシングのレベルに比例します。...

タンパク質プロセッシングのための化学発光ウェスタンブロットアッセイ

V3ワークフローは、染色フリーゲルを使用したウェスタンブロット手順です。この染色フリー技術により、研究者はタンパク質分離の質を可視化し、転写効率を検証し、最も重要なのは、信頼性の高いローディングコントロールとしてタンパク質の総定量を使用して目的のタンパク質の変化を検証することが可能です。...

ウェスタンブロッティングにおける実用的で便利で信頼性の高い全タンパク質ローディング制御のためのV3染色不要のワークフロー

蛍光を用いたウェスタンブロッティングの進歩により、タンパク質発現の微妙な変化の検出が可能になり、定量分析が可能になりました。ここでは、さまざまな種や組織タイプにわたるさまざまなタンパク質を検出するための堅牢な分析法について説明します。一般的な技術的問題を克服するための戦略も提供されます。...

トラブルシューティングの方法と現代の定量的蛍光ウェスタンブロッティングへのガイド

このメソッドでは、標準化された定量的西部のしみが付くアプローチを使用して異なる発達縦長で種々...

タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

超高速ウェスタンブロッティング技術は、免疫反応促進剤と組み合わせて、環状ドレインおよび補充(CDR)技術を介して抗原抗体結合の運動を改善することによって開発される。...

免疫反応向上技術を用いた超高速ウェスタンブロット

このプロトコルは、解剖されたマウス胚の顔面プロセスまたは培養マウス胚口蓋間葉系細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離し、その後のウェスタンブロッティングを実行してリン酸化タンパク質レベルを評価する方法を提示する。...

リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞からの全細胞タンパク質溶解物の単離

このビデオでは、外科的内リンパ水腫を生成するためにモルモットの内リンパ管を妨害する方法を示しています。...

内リンパ管の閉塞による内リンパ水腫の外科的誘導

細胞集団の細胞周期の位置を決定する、または信号が増殖にどのような影響を与えるか理解する、容易にこのプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって測定することができる。我々は、細胞を染色し、細胞周期内の位置を定量化するための簡単​​な実験的なアプローチを報告する。...

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

学ぶ改良型ウェスタンブロット法。Bis-Trisゲル電気泳動と赤外線蛍光イメージングを用いて、タンパク質検出の分解能と感度を向上させ、実験時間を大幅に短縮する高速プロトコルです。

町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ

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