蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

この実験では、一過性の優性選択に基づくモジュール式かつ迅速な方法により、蛍光標識された組換えEOウイルスを生成します。まず、合成された最小相同領域に囲まれた蛍光タグ、および代謝選択および蛍光選択のマーカーを含む組換えベクターを作成します。この組換えベクターを感染細胞にトランスフェクションし、代謝選択と蛍光を用いて組換えウイルスを増幅します。

次に、代謝選択を除去してマーカーカセットを切除し、遺伝子組換えウイルスを含む細胞を蛍光マーカーで単離します。選定。細胞単層上のウイルスプラークの結果により、蛍光タグ付き遺伝子に特徴的な個々のウイルス粒子を可視化することができます。この手法は、タグに関係なく普遍的に繰り返し使用できる選択法を用いて、複数の遺伝子改変を施した組換えウイルスを作製したいと考えて開発されました。

一過性優性選択の原理は以前に説明しましたが、ゲノム修飾をより柔軟に行うために、より大規模でモジュール的な方法で適用したいと考えていました。この方法の視覚的なデモンストレーションは、組換えウイルスプラークのスクリーニングと単離が難しい場合があるため、非常に重要です。その頻度は低い場合があるため、ウイルスを効率的に回復するには、いくつかの独自の方法が必要です。

そのため、タンパク質のN末端またはC末端に目的のウイルス遺伝子を標識しました。したがって、相同性の150塩基対の長い隣接領域を特定します。次に、150塩基対の左腕と右腕からなるオリゴヌクレオチド配列を設計し、選択した制限部位のペアで区切ります。

また、この領域を最初のペアとは異なる制限サイトの 2 番目のペアで隣接させて、TDS ベクトルへの組み込みを可能にします。合成が完了したら、制限部位を持つオリゴヌクレオチドが目的の挿入部位とフレーム内に収まるように設計されていることを確認します。オリゴヌクレオチドの合成には、左右の腕の間に制限部位が組み込まれていることを確認してください。

選択した蛍光タグのオープンリーディングフレームに隣接するものと一致します。PCRにより、蛍光タグの両側にこれらの同じ制限部位を組み込みます。合成したフラグメントをTDSベクターにクローニングします。

また、左腕と右腕の間の制限部位を使用して、得られた組換えベクターに蛍光タグをクローニングします。相同性の領域。BSC one細胞の単層にワクシニアウイルスおよび無血清培地を感染させます。

感染後1時間。ECCOs修飾イーグル培地トランスフェクトを用いて、組換え試薬、ベクタープラスミド、およびトランスフェクション試薬を3対1の比率で混合した無血清培地で細胞をレスキューします。24時間後、ウシ胎児血清を含まないDMEMで細胞を掻き取り、回収します。

細胞を3回の自由融解サイクルにさらして、開いた細胞を破壊し、次にウイルス粒子を放出して、個々のプラークの適切な分離を取得します。BSC 1細胞の100%コンフルエントセル単層に、ウイルス粒子の調製物の段階希釈液を感染させます。液体10%FBSおよびDMEMに加えて、GPTセレクション、試薬を重ね合わせ、24時間インキュベートします。

液体オーバーレイを吸引し、蛍光顕微鏡を使用してプラークを探します。TDSベクターからのMチェリーのウイルスへの取り込みに対応する拡散性赤色蛍光を示します。標的遺伝子と選択された蛍光タグによっては、タグ遺伝子の局在的な蛍光も同じ赤いプラークで観察されてもよい。

次に、組換えウイルスごとに複数のプラークを選択するには、ピペットチップでこすり、DMEMを含む100マイクロリットルの5%FBSで細胞をeinorチューブに移します。削り取った細胞の凍結融解を3回行います。組換えウイルスを放出する。

凍結融解ウイルスを含むDMEMを単層の細胞に加えます。12ウェルプレートで、増殖培地中のGPT選択試薬で組換えウイルスを増幅します。次に、感染後24時間で成功した増幅をこすり落とし、正常に増幅されたプラークのプラークアッセイを行い、赤色蛍光C two sixを示し、BSC one細胞の単層とよく遊んでください。

組換えウイルスの段階希釈を行い、感染後1時間でFBSフリーDME Mのウイルスの希釈を増やしてウェルに感染させます。液体培地を取り出し、感染後3日で各ウェルに0.5%agrosを完全に最小限の必須培地で覆います。選択した蛍光タグの色と赤の両方の蛍光を示すプラークを選択します。

GPT選択なしでこれらを再度増幅します。びまん性赤色の蛍光を失ったプラークを選択しますが、選択したタグに対応する局在蛍光を保持しています。選択せずにプラーク精製を続けて、MチェリーおよびGPT選択遺伝子を失ったが、選択したタグに対応する局在蛍光を保持している組換えウイルスの純粋なストックを得る。

プラークアッセイを用いて、類似のプラーク表現型のすべてのプラークを対象としたストックの純度を評価します。BSC one細胞の単層でテストウイルスストックを増幅します。感染後24時間後、感染細胞を250マイクロリットルのDMEMに掻き取り、感染細胞を遠心分離します。

スーパーナットを取り出し、細胞ペレットを 500 マイクロリットルの 0.1% SDS に TE バッファーボルテックスで再懸濁して、細胞を溶解します。次に、500マイクロリットルのフェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールを加え、反転させて遠心分離機を混合します。上相を収穫し、抽出を繰り返します。

次に、水層からDNAを沈殿させるために、1ミリリットルの冷却、100%エタノール、50マイクロリットルの酢酸ナトリウムを加えます。反転して混合し、サンプルを摂氏マイナス20度で一晩置きます。遠心分離によりDNAをペレット化した後、全ての液体を取り出し、DNAペレットを風乾して再帰します。

50マイクロリットルのTEバッファーに懸濁します。このゲノムDNAテンプレートを使用して、ウイルス挿入のためのPCRスクリーニングを行います。テキストプロトコルで詳しく説明されているように、複数のタグを持つ組換えウイルスを生成します。

これらの組換えワクシニアウイルスは、ウイルスの構造タンパク質であるA3およびF13を標的とする蛍光マーカーでタグ付けされたタンパク質を発現します。これらはそれぞれウイルスの内側コアと外側のエンベロープの一部です。ウイルス粒子を可視化するために、ビリオン局在タンパク質に対応する遺伝子を選択しました。A threeはvaccinia virionのコアタンパク質であり、F 13はウイルスエンベロープタンパク質です。

蛍光標識されたA 3およびF 13の両方を有する二重タグ付きウイルスも、二重標識ウイルスを用いてリアルタイムの蛍光顕微鏡検査を行うことができることが示されています。この場合、ワクシニアウイルスの内核タンパク質です。3は赤で、外側のエンベロープタンパク質F 13は緑でラベルされています。

ウイルス工場から排出されたウイルス粒子は赤で視覚化され、ラップされたビリオンは赤と緑のチャネルの共局在によって表されます。定量分析を使用して、組換えベクターとワクシニアウイルスゲノムとの間の組換え効率を決定しました。ベクターとワクシニアウイルスゲノムとの相同組換えの効率は、70塩基対の相同性領域で検出できます。

この方法は、複数の蛍光タグや複数の遺伝子欠失を持つウイルスを作成するために使用されています。これらは、ウイルス感染性ライフサイクル、宿主防御システムを破壊するウイルスタンパク質の役割、および宿主シグナル伝達プロセスとの相互作用の研究に採用されています。このビデオを見れば、使用するタグがモジュール式で、目的の組換え体を細心の注意を払って解決し、さまざまな研究状況に適用できる方法を使用して、組換えワクシニアウイルスを生成する方法を十分に理解できるはずです。