蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

この実験では、一過性のドミナント選択に基づくモジュール式で迅速な手法を用いて、蛍光標識された組換えワクシニアウイルスを作製します。まず、合成された最小相同領域に囲まれた蛍光タグと、代謝選択および蛍光選択用のマーカーを含む組換えベクターを作製します。この組換えベクターを感染細胞に導入し、代謝選択と蛍光を用いて組換えウイルスを増幅させます。次に、代謝選択を解除してマーカーカセットを切り出し、蛍光マーカー選択によって組換えウイルスを含む細胞を単離します。細胞単層上のウイルスプラークの結果により、蛍光標識遺伝子の特性を持つ個々のウイルス粒子を可視化することが可能になります。

タグの種類に関わらず、繰り返しかつ普遍的に利用可能な選択法を用いて、複数の遺伝子改変を伴う組換えウイルスを作製したいと考え、本手法を開発しました。一過性ドミナント選択の原理は以前に報告されていますが、ゲノム改変における柔軟性を高めるため、より大規模かつモジュール方式でこれを適用したいと考えました。組換えウイルスのプラークのスクリーニングと単離は困難な場合があるため、本手法を視覚的に実演することは極めて重要です。組換えウイルスの出現頻度は低くなる可能性があるため、ウイルスの効率的な回収には独自の手法が必要となります。

したがって、目的のウイルス遺伝子をタンパク質のN末端またはC末端で標識します。それに合わせて、150 bpの相同 flanking regionを特定します。次に、任意の制限酵素部位のペアで隔てられた、150 bpの左腕および右腕からなるオリゴヌクレオチド配列を設計します。また、合成後にTDSベクターへ組み込めるよう、この領域を、最初のペアとは異なる第2の制限酵素部位のペアで挟みます。次に、制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチドが、目的の挿入部位とフレームが一致するように設計されているかを確認します。オリゴヌクレオチド合成においては、左腕と右腕の間に組み込まれた制限酵素部位が、選択した蛍光タグのオープンリーディングフレームを挟む部位と一致するようにします。PCRを用いて、これらの同一の制限酵素部位を蛍光タグの両端に導入します。合成した断片をTDSベクターにクローニングします。また、左腕と右腕の相同領域の間にある制限酵素部位を用いて、蛍光タグを得られた組み換えベクターにクローニングします。無血清培地にて、BS-C-one細胞の単層にワクシニアウイルスを感染させます。

感染から1時間後、Dulbecco's modified eagle mediumを用いて細胞をレスキューします。血清不含培地中で、組換えベクタープラスミドとトランスフェクション試薬を3:1の比率で混合してトランスフェクションを行います。24時間後、細胞を掻き取り、胎児ウシ血清を含まないDMEM中で回収します。細胞を3回凍結融解させ、細胞を破砕してウイルス粒子を放出させます。次に、個々のプラークを十分に分離させるため、100%コンフルエントなBS-C-one細胞の単層に、ウイルス粒子調製液の段階希釈液を感染させます。10%FBS含有DMEMにGPT選択試薬を加えた液体をオーバーレイし、24時間インキュベートします。

液体オーバーレイを吸引し、蛍光顕微鏡を用いて、TDSベクター由来のM-cherryがウイルスに組み込まれたことに対応する、拡散した赤色蛍光を示すプラークを確認します。標的遺伝子および選択した蛍光タグによっては、同一の赤色プラーク内でタグ遺伝子の局在化した蛍光が観察される場合もあります。

次に、各組換えウイルスについて複数のプラークを選択し、ピペットチップで掻き取り、5% FBS含有DMEM 100 µLを用いて細胞をエッペンドルフチューブに移します。掻き取った細胞を3回凍結融解させ、組換えウイルスを放出させます。

凍結融解させたウイルスを含むDMEMを、12ウェルプレート内の細胞単層に加え、増殖培地中のGPT選択試薬を用いて組換えウイルスを増幅させます。その後、感染から24時間後に、増幅に成功した細胞をスクレイパーで回収します。赤色蛍光を示す、正常に増幅されたプラークのプラークアッセイを行うために、6ウェルプレートにBS-C-one細胞の単層を播種します。

組換えウイルスの段階希釈を行い、FBS不含DMEMを用いて、ウイルスの希釈倍率を段階的に上げて各ウェルに感染させます。感染から1時間後、液体培地を除去し、完全最小必須培地（complete minimal essential medium）に含まれる0.5%アガロースを各ウェルにオーバーレイします。感染から3日後、赤色および選択した蛍光タグの色の両方の蛍光を示すプラークをピックアップします。

GPT選択を行わずに、これらを再度増幅させます。拡散した赤色蛍光を消失し、かつ選択したタグに相当する局在化した蛍光を保持しているプラークを選別してください。M-cherryおよびGPT選択遺伝子を消失し、選択したタグに相当する局在化した蛍光を保持する組換えウイルスの純粋なストックを得るため、選択を行わずにプラーク精製を継続します。

プラークアッセイを用いてストックの純度を評価し、すべてのプラークが同様のプラーク表現型を持つようにします。テスト用のウイルスストックをBS-C-one細胞の単層で増殖させます。感染から24時間後、感染細胞を250 µLのDMEMにスクレイピングして回収します。感染細胞を遠心分離し、上清を除去した後、細胞ペレットをTEバッファー中の0.1% SDS 500 µLに再懸濁します。ボルテックスで細胞を溶解させます。次に、500 µLのフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加え、転倒混和します。遠心分離後、上層を回収し、抽出を繰り返します。

次に、水層からDNAを沈殿させるため、冷却した100%エタノール1 mLと酢酸ナトリウム50 µLを加えます。転倒混和し、サンプルを-20 °Cで一晩静置します。遠心分離によりDNAをペレット化した後、上清をすべて除き、DNAペレットを風乾させ、50 µLのTEバッファーに再懸濁します。このゲノムDNAテンプレートを用いて、ウイルス挿入のPCRスクリーニングを行います。テキストプロトコルに記載されている詳細に従い、複数のタグを持つ組換えウイルスを作製してください。

これらの組み換えワクシニアウイルスは、ウイルスの構造タンパク質であるA3およびF13を標的とした蛍光マーカー標識タンパク質を発現しています。これらはそれぞれ、ウイルスの内部コアと外部エンベロープの一部を構成しています。ウイルス粒子を可視化するために、ビリオンに局在するタンパク質に対応する遺伝子が選択されました。A3はワクシニアビリオンのコアタンパク質であり、F13はウイルスのエンベロープタンパク質です。

蛍光標識されたA3およびF13の両方を持つ二重標識ウイルスも示されています。二重標識ウイルスを用いれば、リアルタイム蛍光顕微鏡観察が可能です。この例では、ワクシニアウイルスの内部コアタンパク質であるA3を赤色で、外殻エンベロープタンパク質であるF13を緑色で標識しています。

ウイルス工場から放出された未包膜のウイルス粒子は赤色で可視化され、包膜を持つビリオンは赤色チャネルと緑色チャネルの共局在によって示されています。組換えベクターとワクシニアウイルスゲノム間の組換え効率を決定するために定量分析が行われました。ベクターとワクシニアウイルスゲノムとの相同組換え効率は、わずか 70 base pair の相同領域で検出可能です。

この手法は、複数の蛍光タグの導入や複数の遺伝子欠損を持つウイルスの作製に使用されてきました。これらは、ウイルスの感染ライフサイクル、ホストの防御システムを覆い隠すウイルス蛋白質の役割、およびホストのシグナル伝達プロセスとの相互作用の研究に利用されています。このビデオを視聴することで、使用するタグをモジュール化でき、目的のリコンビナントを厳密に分取することが可能で、かつ多様な研究コンテキストに適用可能な手法を用いて、組換えワクシニアウイルスを生成する方法について十分に理解することができるはずです。