乳癌の新規トランスジェニックマウスモデル：アデノ-Creを持つ乳管上皮の標的とすることにより、転移性乳癌の開始

次の実験の全体的な目標は、健康な免疫系の存在下で最終的に転移する乳がんのマウスモデルを開発することです。これは、まず、アデノウイルスを発現するクリー族を実験動物の乳管に投与することによって達成されます。その後、乳腺を定期的に触診して腫瘍の進行を監視します。

最終的には、腫瘍の転移と腋窩リンパ節への白血球浸潤は、フローサイトメトリー解析によって評価できます。既存の乳房腫瘍モデルに対するこの技術の主な利点は、成熟した免疫系の存在下で発生する可能性のある腫瘍の正確な開始を可能にし、YFP発現によって追跡できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、導入注入ステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。

針を正しく配置するには、精度と練習が必要です。実験当日は、アデノウイルスクリーの8番目のプラーク形成単位の4×10のEloquaをドライアイス上に保存し、ウイルスを室温で解凍し、滅菌水で十分な3%スクロースと混合して、最終容量を最大10マイクロリットルにします。次に、34マイクロリットルのmemと4マイクロリットルの新たに調製した塩化カルシウムをウイルスに穏やかに混合し、溶液を室温でインキュベートします。

15〜20分後、メディアは曇って見え、アデノウイルス沈殿物の形成を示します。チューブを静かにフリックして、ウイルス粒子が懸濁液全体に均一に分布していることを確認してから、ウイルス粒子を注入するために、3マイクロリットルのウイルスを10マイクロリットルの注射器に引き込みます。次に、麻酔をかけたマウスを、清潔な解剖顕微鏡の照明付きステージに仰向けに置きます。

追加の光源で腹部を照らし、各乳首を囲む小さな白い毛皮のパッチによって左4番目または右9番目の鼠径乳腺を見つけます。次に、滅菌エタノールを染み込ませた綿の先端アプリケーターで乳首をやさしくこすります。次に、細い外科用鉗子で乳首を固定し、軽い力で引き上げます。

角栓を抜くには、鉗子の間の乳首を安定させ、針を先端の間にそっと挿入します。適切な注入深さを確保するために管管を90度の角度でカニューレし、針を管の内腔に挿入した後、針をゆっくりと引き上げ、乳首を針の端に沿って引き上げます。針が適切に配置されたら、シリンジの内容物全体を静かに沈めます。.

液体が追加されると、乳首がわずかに膨らむはずです。注射後、麻酔から回復し始めるまでマウスを加熱パッドに戻します。その後、動物を清潔なケージに戻し、完全な回復が観察されるまで監視します。

注入した記憶腺を 30 日目に触診して、腺の肥大と腫れを評価します。腫瘍の進行を5〜7日ごとに監視します。乳腺の腫れと肥大が観察されたら、腫瘍の成長速度について3〜4日ごとに腫瘍の体積を測定します。

触知可能な腫瘍が現れたら、乳管樹の成功したターゲティングは、乳腺の全マウントを準備することによって視覚化できます。これは、トリップとブルーの注射後に乳腺の全マウントを準備して適切な注射を確認するため、またはアデノウイルスを発現するMチェリーの注射後に適切なウイルス調製と延性上皮細胞の感染を確認するためです。F Fluxed P 53 LSLK RAトランスジェニックマウスで腫瘍を誘導すると、乳腺が肥大して腫れる40日目頃まで最初の腫瘍は明らかになりません。56日目頃から、腫瘍は指数関数的に成長し始めます。

この時点で、腫瘍の体積を3日ごとに測定することが重要です。運動学的研究が望ましい場合、腫瘍の進行にはマウス間の正常な変動性があるため、80日目までに大きな腹部腫瘤が明らかになり、その後、腫瘍が動物の体重の10%を超える場合はマウスを安楽死させる必要があります。フラックスP 53 LSL KRASトランスジェニックマウスの乳房腫瘍に由来する3つの細胞株のCDNA分析は、腫瘍がメソセリンサイトケラチン8、HERの2つの新しいエストロゲン受容体アルファを発現していることを明らかにしました、アルファ、ベータおよびガンマデルタT細胞のヒト乳がん浸潤の細胞微小環境と同様に、骨髄由来の抑制細胞およびマクロファージが腫瘍に観察されます。

腋窩リンパ節に排出される血管系は、腫瘍が成長する前に充血を開始し、最終的には注射が行われた記憶組織全体を包み込みます。鼠径リンパ節と腋窩リンパ節の間の表在性上腹部静脈の明らかな充血も見られます。7〜8週間後、腫瘍細胞のリンパ管浸潤により腋窩リンパ節が肥大します。

腫瘍細胞のリンパ管浸潤および転移は、Flocked P 53 LSLK RAsトランスジェニックマウスとL-S-L-E-Y-F-Pマウスを交配することにより追跡することができる。事前に分薬された切除後、高レベルのYFPと低レベルのYFPの両方を発現する細胞が腫瘍で検出され、それらの転移は排液する腋窩リンパ節に追跡できます。この手法を習得すると、適切に実行すれば、20匹のマウスの実験コホートで2〜3時間で実行できます。

この手順に続いて、追加のロックであるp導入遺伝子を持つマウスを繁殖させることにより、他の腫瘍モデルを開発でき、さまざまながん遺伝子が乳がんの病理、免疫微小環境、転移性浸潤にどのように影響するかなどの質問に答えることができます。