マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

染色体の絵画は、細胞核の組織化や核型の進化を研究するのに役立つ方法です。ここでは、その場での2次元蛍光化および3次元蛍光(FISH)に使用される単一ポリテン染色体から特定の領域を分離および増幅するアプローチ を 示す。

この手順の全体的な目標は、1つのマイクロ解剖されたポリタン染色体アームから十分なDNAアンプリコンを生成し、魚の実験に直接使用することです。これは、まず、マイクロ解剖用に特別に設計されたメンブレンスライド上にポリタン染色体スカッシュを調製することによって達成されます。手順の 2 番目のステップは、レーザー微小解剖によって個々のポリタン染色体アームを分離して捕捉することです。

3番目のステップは、マイクロ解剖サンプルからDNAを単離し、2ラウンドの全ゲノム増幅を使用してDNAを増幅することです。最後のステップは、増幅されたDNAを標識し、魚の実験で使用することです。最終的に、結果から、関心領域の標識された大量の蛍光DNAが得られます。

バッククローンやPCRフラグメントを持つ魚などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、これらの標識プローブで染色体の大部分を蛍光的に塗装できることです。また、染色体塗料は無傷の染色体アームから機械的に分離されているため、配列を知る必要はありません。まず、この場合、新鮮な車の騒音溶液に固定された約5匹の蚊の卵巣から染色体を分離します。

良好な染色体拡散が確認されると、染色体は変性によって平らにされ、続いて低温で一晩インキュベートされます。翌日、染色体を脱水して洗浄し、マイクロダイセクションの準備をします。マイクロダイセクションスコープをエタノールで洗浄し、手袋とチューブをUVで滅菌してください。

次に、テキストプロトコルで提供される二次ビデオに従って染色体をマイクロダイセクションします。倒立チューブに対応するように修正されたコージェンキットを使用してDNAを収集します。これに続いて、カラムを精製し、水に溶出します。

1本の染色体アームの全ゲノム増幅には2つのルートがあります。ley g ルートは、最初は大きな収量を提供しますが、DNA をラベル付けするために NIC 変換が必要です。ゲノムプレックスルートは、複数回の複製と最終結果プローブの直接標識を可能にする利点です。

汚染物質の増幅の可能性が高いため、可能な限り無菌状態を使用してください。ゲノムプレックスルートの場合 まず、シングルセルWGA 4キットで増幅されたDNAの最初のバッチを作製させます。次に、ゲノムクリーンおよびコンセントレータキットを使用してDNAを精製します。

洗浄DNAは、TEバッファーではなく水を使用して溶出することを忘れないでください。第三に、DNAを具現化し、第四に魚の標識を両方のステップで行います。WGA 3 再増幅キットを使用してください。

DNAの標識には、特定の比率のヌクレオチドと標識されたDUTPを組み込んだ特別なDNTP混合物を使用する必要があります。regeキットを実行する際、rootはまず、新たに滅菌した水を使用したシングルセルWGAキットを使用し、最近D2バッファーを調製しました。次に、NIC 変換プロトコルに従って、増幅された DNA をラベル付けします。

ゲル上のDNA断片サイズを必ず確認してください。フラグメントは約200〜500塩基対である必要があります。いずれかの根エタノールを仕上げるには、標識DNAを沈殿させ、サンプルを摂氏4度で10分間遠心分離します。

次に、回収したペレットを風乾し、40マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを加えます。事前に乾燥させたら、カバースリップがカバースリップによって押しつぶされないように、マニキュアの正方形の壁を備えたスライドを準備します。次に、クリストファーのステージ3の半重錐の雌の蚊から新鮮な卵巣を解剖します。

卵巣を150〜250マイクロリットルのバッファー、チューブ内のプラス0.5%digitインのチューブに移します。大きな解剖針を使用して、卵胞膜を破壊します。次に、チューブを5〜10分間ボルテックスして、卵胞をさらに乱します。

大きな卵胞片をこすり落とし、チューブを低速(約500 RPM)で30秒間遠心分離します。上清を新しいチューブに移し、壊れた卵胞を含む元のチューブに100マイクロリットルのバッファーAを追加します。次に、目に見える組織が小さな粒子になるまで、分裂した卵胞で核分離手順を繰り返します。

すべてのスーパーナットを同じチューブに集めます。それらはすべて主に核を含んでいます。次に、スーパーナットの入ったチューブと残った組織が入ったチューブをスピンダウンさせ、セーフガードとして加工します。スーパーナットを廃棄し、200マイクロリットルのバッファーAを0.1%Tritonでチューブに激しく渦巻き、ペレットが壊れるまで加え、その後、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、チューブを10, 000 RPMで5分間遠心分離し、上清を取り除き、PBSに200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加えます。次に、チューブをサーモミキサーで30分間インキュベートし、450 RPMで混合します。5, 000 RPMで5分間のスピンを使用して固定剤を取り外し、その後、スーパーネームを廃棄します。

次に、バッファーAを0.1%Tritonで添加し、チューブを450 RPMの遠心分離機でサーモミキサーで5分間インキュベートし、さらに5分間細胞を洗浄します。5, 000 RPMで、ラベル付けされたプローブを摂氏37度に温める準備をします。細胞がペレット化されたら、スーパーネームを少なくとも20マイクロリットルの標識プローブに置き換えてください。

その集中力について心配する必要はありません。次に、サーモミキサーでDNAを95°Cで450RPMで10分間変性させ、80°Cで15分間変性を持続的に混合しながら続けて行います。次に、温度を摂氏37度に下げ、サンプルを一晩混合し続けます。

翌日、5分間遠心分離して核を回収します。5, 000 RPM 2, 655 Gs.で、SUPERNATを0.1%トリットンを含むバッファーの洗浄液で置き換えます。細胞を室温で約500RPMで攪拌しながら5分間洗浄します。

別の遠心分離機で洗浄液を取り出し、洗浄プロセスをさらに2回繰り返します。3回目の洗浄液を取り除いた後、DPIで核を直接再懸濁し、長時間の抗退色剤の滴に再懸濁します。準備したスライドに気泡を避けながら、核を慎重に移し替えて終了し、カバースリップゲノムプレックスとeeを塗布します。

シングルセルWGAキットは、両方とも蚊の組織に記載されているように使用しました。得られたDNAをゲル電気泳動で比較した。明らかに、収率は大きく異なり、これは分光法によっても確認されました。

魚類は、蚊のポリタン染色体上のマイクロ解剖材料のための5つのプローブを使用して行われました。4つの常染色体アラームは、WGA threeキットを使用して3つのフルオロフォーでラベル付けされました。3つのR染色体は緑色のフルオレセインで標識されています。

3本のL染色体は赤と黄色が混ざり合っています。2つのR染色体は黄色で、2つのL染色体は赤です。X染色体は、ley G材料のNIC翻訳と、ポリタンと有糸分裂染色体アームのe色部分との間の対応を確立するための別の実験を使用してオレンジ色で標識されました。

染色体塗料を間期染色体にハイブリダイズした。2つのRアームは緑色でラベル付けされています。3つのRアームはピンクで、3つのLアームはオレンジでラベル付けされています。

クロマチンはDPI前期染色体により青色に染色され、観察された。X染色体には、次に見た18個のS-R-D-N-AプローブPro中期染色体に対応する赤いラベルがあります。中期染色体も見つかりました。

鮮やかな青色に染色された領域はヘテロクロマチンに対応しており、細胞核内の単一のポリタン染色体アームの3D組織化を視覚化します。ホールマウントフィッシュはスー株で行った。蚊の卵巣看護師細胞の染色体の腕の領域は、ポリタン染色体上にはっきりと見られます。

同様に、明確な染色体腕の領域は、界面の核にはっきりと見られます。この手順に参加する際には、汚染リスクを念頭に置いてすべての手順を実行することが重要です。サンプルを汚染することは非常に容易であり、目的のDNAの増幅収率が低下します。