未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

このマイクロ流体技術は、多重化可能なプラットフォーム上で、血液の1滴から直接ヒト好中球の機能を測定することを目的としています。中央のローディングチャンバーは、全血源として機能し、16の焦点走化性チャンバーから形成される化学療法誘引剤勾配のシンクとしても機能します。赤血球の独自の機械的ろ過により、血液、細胞、生化学成分の自然な状況で好中球の機能を調べることができます。

焦点走化性チャンバーにつながるチャネルとデバイスから出るチャネルとの間の分岐により、移動する好中球の方向性の定量化と変調が可能になります。したがって、結果は、活発に移動する好中球が捕捉された赤血球を容易に通過し、時間の経過とともに数が蓄積する様子を示すことができます。当社のマイクロ流体デバイスのユニークな特徴の1つは、製造とセットアップが非常に簡単であることです。

これらは、微細加工されたウェーハ上にキャストされたPDMSの層で構成され、ガラス底、シングルウェルまたはマルチウェルプレートに接着します。この技術の主な利点は、全血の液滴のみを必要とすることです。このデバイスは、標準のピペットで使用でき、可動部品がなく、チューブや外部シリンジポンプも必要ありません。

この技術の意味は、従来の技術で必要とされるものと比較して、臨床応用にまで及びます。私たちのアプローチは、採血から好中球遊走アッセイまで数分で完了します。新しい赤血球フィルタリングコームは、RBCが好中球の活発な移動をブロックするのを防ぎ、この方法を他のマイクロ流体法とは一線を画しています。

そのためには、化学療法を行う前に血液を採取する必要があります。赤血球とチャネルの機械的ジャミングは、当社の技術を際立たせ、血清や血小板を含む全血の生理学的環境での好中球の試験を可能にします。したがって、テクノロジーは正確で使いやすく、好中球とC自然免疫系が健康と病気に果たす役割についての理解を大幅に前進させることができます。

マスターモールドウェーハを製作して、製造元のファーストパターンの指示に従って移行チャネルを定義します。最初の3ミクロンのエポキシベースのネガティブフォトレジスト層は、次に2番目の50ミクロンの層をパターン化して、セルローディングチャンバーとケモカインチャンバーを定義します。次に、キャストされたポリメチルソーンデバイスは、20グラムのPDMSと2グラムのイニシエーターを5分間激しく混合します。

PDMSをパターン化されたウェーハに慎重に注ぎ、真空中で1時間乾燥させます。次に、PDMSマイクロ流体デバイスを摂氏65度のオーブンで少なくとも3時間焼き、硬化させます。PDMSが正しい温度で焼かれていることを確認するために、温度計で内部オーブンの温度を必ず監視してください。

直径1.5ミリメートルの中央の全血ローディングチャンバーをパンチアウトします。また、直径5.0mmのドーナツ型のデバイスを丸ごと打ち抜きます。粘着テープを使用してドーナツデバイスから粒子を取り除きます。

次に、マルチウェルプレートを脱イオン水ですすぎ、プレートを摂氏60度のオーブンに5分間置いた後、窒素で乾燥させます。酸素血漿を35秒間処理します。次に、ドーナツデバイスと酸素プラズマを追加します。

さらに35秒間再度治療します。デバイスをプレートのウェルに慎重に移し、80°Cのホットプレートで接着したデバイスで10分間焼きます。酸素プラズマ処理後、デバイスは親水性であり、毛細管現象によりデバイス内の小さなチャネルのプライミングを促進することができます。

化学療法誘引液については、5マイクロリットルの10マイクロモルFMLPと5マイクロリットルの1ミリグラム/ミリリットルのフィブロネクチン、および490マイクロリットルのHBSSを混合します。化学療法誘引剤溶液を全血ローディングチャンバーピペットにゆっくりとピペットで入れ、さらに20マイクロリットルの化学療法誘引剤を装置の外側にピペットで入れます。プレートを乾燥剤に15分間置きます。

デバイスに真空を適用して、化学療法誘引剤溶液でデバイスをプライミングします。プレートを乾燥物から取り出し、気泡のサイズを徐々に小さくしてデバイスチャネルの濡れを確認します。次に、全血液ローディングチャンバーとデバイスの外側を徹底的に洗浄して、余分な化学療法誘引剤溶液を取り除きます。

次に、各焦点走化性チャンバーからデバイス中心までの化学療法誘引剤の勾配を生成します。100マイクロリットルのPBSを穴にそっと注入して、デバイスの上部にPBSの液滴が形成されるようにします。プレートを傾け、装置の周囲に1ミリリットルのPBSをピペットで動かして、ウェルの底に集め、液体を吸引し、PBS洗浄を3回繰り返します。

次に、各ウェルに培地を充填してデバイスを浸し、グラジエントが安定するまで15分間待ちます。次に、2マイクロリットルの全血を各全血ローディングチャンバーにゆっくりとピペットで入れます。指刺し採血の場合は、石鹸と水で手を洗ってください。

抗凝固剤の汚れ溶液として皮膚を乾燥させます。0.2%HSAを1ミリリットル、32.4マイクロモルフックを10マイクロリットル加えます。ヘパリン採血チューブに染色し、健康なドナーの指を刺し、最初の一滴の血液を拭き取ります。

抗凝固剤の染色液に50マイクロリットルの血液を集め、穏やかに混合します。バイオチャンバーを摂氏37度、湿度80%、CO25%にセットアップします。すぐに10倍以上の倍率でタイムラプスイメージングを開始し、有意義な統計分析を行い、各サンプル中の少なくとも50人の好中球を手動で追跡します。

焦点走化性チャンバーに入る細胞を経時的にカウントします。次に、画像Jを使用して、WBLCとFCCの間のチャネルの好中球速度を計算します。次に、好中球の方向性を定量化するために、分岐部を通過する細胞の数を数え、焦点走化性チャンバーに向かう細胞の数とデバイスから出る細胞の数との間の比率を計算します。

指向性のない細胞は走化性勾配に従わないため、FCCと出口チャネルに同数移動します。この実験では、FMLP勾配に向けた好中球の蓄積を測定することにより、全血好中球走化性アッセイを検証しました。結果は、赤血球がろ過コームによって捕捉され、好中球が全血から活発に移動できることを確認しています。

全血マイクロ流体デバイスによって形成される安定した線形化学療法誘引剤勾配は、FSE標識デキストランを使用して確認され、蛍光レベルが経時的に測定されました。新しいWBケモタキシスプラットフォームを使用して得られた結果は、すべての血液源からの好中球が一定の速度で移動し、同様の総移動細胞で移動することが明らかになりました。重要なことに、このシステムは好中球の定量を可能にするため、走化性を化学療法と区別します 一度習得すると、この技術は適切に実行されれば10分以内に実行できます。

標準的なクリーンルーム技術、設備、複数の条件を同時にスクリーニングする12または24ウェルプレートに当社のデバイスを組み込むこと。この手法を用いて、好中球の速度と方向性を単一細胞レベルで測定することができます。エンドポイント細胞の一括移動を測定する従来の方法とは異なり、マイクロ流体デバイスを慎重にプライミングし、RBCがデバイスのCOMを超えて押し出されないように、両方のサンプルをゆっくりとロードすることを忘れないでください。

記載されているプロトコルは、一過性の好中球走化性欠損症の測定に特に有用であり、複数の時点にわたって繰り返しサンプリングを可能にしますが、異なるモデル生物からの他の細胞タイプの移動の測定にも適応させることができます。この方法は、外傷患者、大手術後の患者、化学療法を受けている癌患者など、感染症の発生率が高いことに関連するさまざまな状態の患者における好中球機能の一時的な変化に関する洞察を提供することができます。