Name: 未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぼう、未処理の全血から好中球の走化性を測定するマイクロ流体アッセイ。PDMSデバイスを用いて赤血球を機械的に濾過し、FMLP勾配下で好中球の移動速度と方向性を定量化する方法です。

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1。マイクロ流体デバイスの作製<ol><li>標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して、クラス千クリーンルーム内でマスターモールドウェハを作製。パターン製造業者の指示に従って、移行チャネルを定義するための第3μmの薄いエポキシベースのネガ型フォトレジスト層を形成する。パターンセルローディングおよびケモカイン室を定義する第50μmの厚さの層。 </li><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）デバイスをキャストするようにパターン化ウェハを使用しています。激しく大きなプラスチック秤量トレイのプラスチックフォークを用いて5分間、開始剤（2g）を用いてPDMS（20g）に混合する。 </li><li>慎重に、金型上に、PDMSを注ぐ。 </li><li> 1時間真空乾燥器にあけ、PDMS金型を配置することによって、PDMSを脱気。 </li><li>焼くと65℃に設定したオーブンで、少なくとも3時間、PDMSマイクロ流体デバイスを治す</li><li> 1.5ミリメートルの先端径とパンチャーを使用して中央WBLCsを打ち抜く。 </li><li>穿刺を用いて全ドーナツ型のデバイスをパンチアウト5.0ミリメートルの先端径と彼女。 </li><li>粘着テープを使用したドーナツデバイスから粒子を除去する。 </li><li>脱イオン水で12ウェルプレートを洗い流してから窒素で乾燥。 5分間60℃のオーブンにプレートを置きます。 </li><li>酸素プラズマは、二回の12ウェルプレートを治療する;一回だけでは35秒してから、再度、別の35秒間のドーナツデバイスと。 </li><li>慎重にピンセットを用いてプレートのウェル内のデバイスを配置します。 </li><li> 10分間80℃に設定したホットプレート上に結合したデバイスとのベークプレート。 </li></ol> 2。マイクロ流体アッセイの準備<ol><li>直ちに酸素プラズマ処理後の素数マイクロ流体デバイスは、デバイスは、親水性及び毛細管効果がある場合、デバイスの小さなチャネルのプライミングを促進することができる。 </li><li> 5μLフィブロネクチン[原液を1 mg / mlの]と490μlのHBSSで5μLのfMLP [原液を10μm]を混合して化学誘引ソリューションを作成します。 </li><li>ゆっくりとピペット＆＃160; WBLCに化学誘引物質溶液、ゲルローディングチップ（ 図1A）を使用して。ピペット装置の外部の周りの化学誘引物質の追加の20μL。 </li><li> 15分間デシケーター中でプレートを置きます。装置に真空を適用することにより、溶液を装置及びPDMSを通って拡散される空気のサイドチャネルに注入される。 </li><li>デシケーターからプレートを取り外し、顕微鏡下でデバイスチャネルの濡れ性を確認。化学誘引物質溶液がチャンバに入ると、気泡が小さくなるように見る。気泡は、真空処理後のデバイス内に存在してはならない。 </li><li>徹底的に余分な化学誘引物質溶液を除去するための装置のWBLCと外側を洗ってください。このステップは、デバイスセンターに焦点走化性チャンバー（FCCの）のそれぞれから誘引物質の勾配を発生させる。 <ol><li>シリンジに30Gの鈍針の先端を追加し、PBSで1 mLの注射器を埋める。優しく、シリンジの針の先端を挿入ドーナツ穴の中心。そっと穴に100μlのPBSをプッシュするようにデバイス上部のPBS形の滴。 </li><li>傾斜プレートピペット装置の周りのPBS 1mlの液体がウェルの底に集まるようにする。吸引除去新鮮な緩衝液を用いて3倍の合計のために液体を繰り返しプロセス（代わりにバッファの使用メディア分離好中球がメディアにロードされる場合）9。 </li></ol></li><li>デバイスの上部に液体の下に沈むまで、メディアと各ウェルを埋める。デバイスは、勾配が安定するまで15分間放置します。実験結果と有限要素シミュレーションから理論的なデータは、これらのデバイス内の勾配は小分子（ 例えば 、fMLPで）のために、より大きな分子量（ 例えば 、IL-8）のためのいくつかの日まで24時間まで安定であることを示している。 </li><li>ゲルローディングチップを使用して、徐々に各々の全血LOAに2血液の液（または単離された好中球）をピペット丁室（WBLC）（ 図1A）。 </li></ol> 3。サンプルの調製毛細血管血液からヒト好中球<ol><li>無免疫抑制剤である健康なボランティアの指を刺すから毛細管血を収集します。すべての患者のサンプルは、書面によるインフォームドコンセントを得て、MGHとシュライナー治験審査会によって承認された手順を経て行った。 <ol><li>指穿刺採血のために、水と石鹸で手を洗い、皮膚を乾燥させます。採血管（1.65 USP/50μlの血液）をヘパリンに1ミリリットルのHBSS +0.2％HSAおよび10μlのヘキスト染色（32.4μM）を添加することによりanti-coagulant/stainストック溶液を準備します。優しく、SurgiLance安全ランセット（2.2 mmの深さ、22）を用いた指を刺し血液の最初の一滴を払拭し、株式抗凝固剤およびヘキスト蛍光染色溶液（10μl）を含むエッペンドルフチュー​​ブ内の血液の50μLを収集し、混ぜる。 </li></ol></li&gt; <li>核蛍光染色を可能にするために10分間の血とヘキスト染色をインキュベートする。採血の1時間以内にサンプルを実行します。 </li></ol>静脈血から、ヒト好中球<ol start="3"><li> 33 USPヘパリンを含む試験管に末梢静脈血の10ミリリットルを描画します。 </li><li>前述したように、メディアとヘキスト染色に静脈血50μlを加える。核蛍光染色を可能にするために10分間の血とヘキスト染色をインキュベートする。採血の1時間以内にサンプルを実行します。 </li></ol>全血からの好中球の分離 - ポジティブコントロール<ol start="5"><li>好中球を分離ヘタスターチを用いて10ミリリットル静脈全血サンプルから好中球を単離するために、無菌技術を使用する（6％w / v）の製造業者のプロトコールに従ってネガティブ選択磁気ビーズ単離キット、続いて密度勾配。 </li><li> concentrで好中球の最終的な分量を再懸濁1X HBSS +0.2％ヒト血清アルブミン/μL4000細胞のATION。実験を実行する準備が整うまで、37℃で細胞を維持する。 </li></ol>好中球走化性測定用4。顕微鏡と画像解析<ol><li> 5％、37℃、80％の湿度、およびCO 2へのバイオチャンバーの温度を設定します。 </li><li>顕微鏡（10倍以上の倍率）でタイムラプスイメージングを使用して、すぐに撮像立。 </li></ol> 5。統計解析<ol><li>手動で各試料中の少なくとも50の好中球を追跡します。 </li><li>時間をかけて、FCCに入る細胞（ 図2）を数える。 </li><li> ImageJの（NIH）（ 図2）を使用してWBLCおよびFCC間のチャネルにおける好中球の速度を計算します。 </li><li>分岐部を通過する細胞の数を計数し、終了番目FCC細胞に向かって回す細胞の数との比を計算することによって好中球の指向性を定量化する電子装置。方向性のないセルは、走化性勾配に従うため、FCCおよび出口チャネル（ 図2）に向けて同数に移行されません。 </li></ol>

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<li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li>
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</ol>

開示する特別の利害関係はありません。

本研究では、血液の小滴（2μL）から好中球の走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォームを開発しました。積極的に好中球の移行からのRBCのオンチップ·機械的ろ過は、好中球を活性化することにより、成果物を導入する傾向があるような密度が10の勾配などの煩雑な細胞分離方法は、ポジティブ選択11、または負の選択12の必要性を回避する。 RBCの機械的ろ過は、好中球の遊走をプロービングするための他のマイクロ流体チップから私たちの技術を区別します。例えば、我々の研究室13からの先行研究ビーブらの前に走化性アッセイに全血サンプルからの好中球を分離するためのチップ上に8利用セレクチン、。セレクチン表面上の分離した後、好中球遊走は、緩衝液中に発生した。これらの条件下では、好中球走化性に対する血清の影響を除去した。また、セレクチンが知られている特定の受容体を係合することにより細胞を活性化するので、 インビトロ走化性測定値に変更することができる。私たちのデバイス内の赤血球ろ過コームによる機械...

<html>好中球の人身売買は、アテローム性動脈硬化症1、細菌感染症や敗血症2を含む多くの炎症状態の進行と解像度を決定する上で重要な役割を果たしており、傷害3を焼く。健康と病気の状態への主要な貢献のために、好中球数は、多くの場合、臨床および研究実験室で検討標準的な血液分析の一部である。しかし、ほとんどのユビキタス試験の一つであるにも関わらず、感染症や敗血症の診断における好中球数の値が頻繁に4を疑問視されている。例えば、熱傷患者における好中球の1の研究では、好中球数及び好中球遊走機能は相関しないことを明らかにした。好中球が単独で数えることを意味して免疫状態3の正確な指標ではありません。測定することはより困難であるが、好中球の機能的能力は、広範囲の条件でより価値として提案されている。 tは &quot;&gt;重要なのは、好中球の欠陥の多くは一過性であり、恒久的な遺伝的欠陥によってトリガされず、大部分は最近まで、診療所で見過ごされてきた区別は。火傷の文脈では、好中球遊走はもちろん中に監視することができた炎症状態または感染3の指標として、患者の治療が、彼 ​​らは大量の血液を必要とするため、現在の研究室（Boydenチャンバー、ダン室、マイクロピペットアッセイ）で使用される従来の移動アッセイは、臨床現場に翻訳することができず、面倒で時間のかかる好中球の単離技術（ 表1）。好中球の単離のために必要な血液の量は、一つのサンプルのみを可能にし、多くの場合、偶数のプーリングを必要とするため、これらのアッセイはまた、マウスなどの実験小動物における好中球走化性の過渡的変化を監視するために使用することができない単一のアッセイのための複数の動物から血液が、例えば、関係する研究では、M複数の時点にわたるultiple条件や治療は、潜在的に、現在の走化性アッセイを用いて、マウスの数千を必要とする可能性があります。これは、損傷、感染症との関連で、免疫機能の複雑な力学を理解したり、多くの場合、マウスモデル5で研究を燃やすために行うことができる基本的な生物学的研究を制限します。 最小限の血液量を必要としながら、迅速なロバストである好中球機能アッセイの必要性に対処するために、我々は、全血の小滴から直接好中球走化性を測定するマイクロ流体デバイスを開発した。これは、血清6および7を含む血小板を全血には多くの要因が、好中球機能に影響を与えることが知られている。なお、全血のマイクロ流体アッセイはin vitroアッセイで8走化性における変化を測定するとき、好中球のインビボでの微小環境を維持するために、試料の処理を最小限に抑えることが有益である。このアプローチわずか数分（ 表1）に、従来の技術を用いて時間で好中球遊走アッセイに採血からの時間を低減する。全血のマイクロ流体プラットフォームは、実験期間のための安定した直線的誘引物質勾配を生成し、可動部品がなく、外部の圧力源（ すなわちシリンジポンプ）を必要としない。全血のマイクロ流体デバイスの設計における重要な特徴は、機械装置の移動路に入るのRBCをフィルタリングする赤血球（RBC）を濾過コムの組み込みである。このろ過櫛の右ターンはおそらく赤血球で詰まることになるサイズ排除濾過の必要性を防ぐため、WBに積極的に移行し、好中球に到達する化学誘引物質勾配を遮断する。 12または24ウェルプレート中の全血のマイクロ流体装置の組み込みは、ヒトまたはマウスの好中球走化性siを複数のメディエーターのスクリーニングを容易にする同時進行。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Device Fabrication</td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184 1.1 lb. Kit</td><td></td></tr><tr><td>標準スライドガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>125495</td><td>1 X 3 インチ</td></tr><tr><td>ガラス底板</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td></td></tr><tr><td>ハリスユニコア 先端径5.0mm</td><td>テッド・ペラ社</td><td>15081</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm</td><td>Ted Pella, Inc. (株)</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microfluidic Assay Preparation and Analysis</td></tr><tr><td>Gel-loading pipet tip</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-139</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Fisher Scientfic</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Blunt tip needle, 30 G &frac12; in.</td><td>ブリコメディカルサプライ</td><td>BN3005</td><td></td></tr><tr><td>バキュテイナー、ヘパリン</td><td>ベクトンディキンソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td>シグマアルブリッチ</td><td>A5843-5GHBSS</td>フィブロネクチンシグマアルドリッチF0895-1MGfMLP<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>シグマアルドリッチ</td><td>F3506-10MG</td><td>の最終濃度0.2%</td></tr><tr><td>SurgiLance 安全ランセット 深さ 2.2 mm 22 G</td><td></td><td>SLN240</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht stain</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Positive Control</td></tr><tr><td>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ヒト好中球濃縮キット</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>プラズマアッシャー</td><td>マーチ インスツルメンツ</td><td>P-250</td><td></td></tr><tr><td>リンドバーグ/ブルー M オーブン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>13-258-30C</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼精密ピンセット</td><td>テクニ ツール</td><td>758TW458</td><td></td></tr><tr><td>ベルアート サイエンスウェア 耐薬品性真空デシケーター</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>データプレート デジタル ホットプレート</td><td>Alpha Multiservices</td><td>PMC 720</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TiE倒立顕微鏡</td><td>Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td><td></td><td></td>MEA53100</tr><tr><td>CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd 対物レンズ</td><td>ニコン - マイクロビデオインスツルメンツ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRH20101 Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon</td><td>ニコン - Micro Video Instruments Inc.</td><td>500-L200NI2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI/Hoechst/AMCA 狭帯域 32 mm エキサイタ - 25 mm エミッタ</td><td>クロマ - Micro Video Instruments Inc.</td><td>31013v2</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R 2000 冷却 CCD カメラ 1,600 x 1,200 ピクセル</td><td>Qimaging - Micro Video Instruments Inc.</td><td>RET-2000R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

好中球は、感染および血液中のそれらの数に対する保護において重要な役割を果たして頻繁に診療所で測定される。低好中球数は感染症の高いリスクについて警告サインであるが、血液中の高い好中球数は、通常、進行中の感染症の指標である。その機能を達成するために、好中球はまた、感染症が発生する組織内に、彼らの人生の大半を費やし、血液から効果的に移動できるようにする必要がある。その結果、移行する好中球の能力の欠陥は、好中球は、血液中の適切な数で存在する場合にも、感染症のリスクを高めることができます。しかし、診療所での好中球の遊走能を測定することは、時間がかかり、困難な作業であり、多量の血液、及び専門的な知識が必要になります。これらの制限に対処するために、我々はまわり、未処理の血液の一滴を必要とする好中球遊走のためのロバストなマイクロ流体アッセイを設計した好中球の分離の必要性を通気し、簡単な顕微鏡で定量化することは容易である。このアッセイでは、好中球は、化学誘引物質源に向かって、小さなチャネルを通して、血液の液滴から直接移行します。同じチャネルを介して赤血球の粒状流れを防止するために、我々は、選択的に赤血球の進行をブロックすることになり直角と機械的にフィルタを実装した。我々は、指穿刺および静脈血から採取された血液の液滴からの好中球遊走を比較することによりアッセイを検証した。我々はまた、精製された好中球のサンプルから好中球の遊走これらの全血（WB）のソースを比較し、3ソース間の一貫性の速度と方向性を見つけた。このマイクロ流体プラットフォームは、健康と病気における好中球機能の理解を進めるために役立つクリニックや研究環境で、人間の好中球遊走の研究が可能になります。

全血（WB）好中球走化性アッセイは、fMLPの勾配（ 映画S1）に向かう好中球の蓄積を測定することにより確認した。結果は、好中球（ブルー）が積極的に全血（ 図3Aと動画S1）から移動することができますが赤血球を濾過コームにトラップされていることを確認。全血のマイクロ流体装置によって形成された安定な化学誘引物質線形勾配（緑色）は、FITC-標識デキストラン（ 図3Aの挿入図）を用いて確認し、経時的な蛍光のレベルを測定した。これらのデバイスで生成さ勾配が小さい分子のための24時間までの、より大きな分子量のために週まで安定していた。洗浄プロトコルの効率はWBLCで無信号がFCCにローカライズされた蛍光信号を画像化する、またはデバイスを囲むことにより確認した。デバイスは、次の異なるBLから好中球遊走の差を評価するために使用されたOOD源。 小説のWB走化性プラットフォームを使用して得られた結果は、静脈、WBからのWBの指穿刺液滴からの好中球、または静脈血か...

このプロトコルは、堅牢で再現性の全血の1滴からヒト好中球走化性を測定するように設計分析について詳しく説明します。このアプローチは、好中球の分離のための必要性を回避し、アッセイ準備時間のほんの数分を要する。サンプル量が限られているマイクロ流体チップは、乳幼児や小さな哺乳類では時間の経過とともに好中球走化性の反復測定を可能にします。

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

このマイクロ流体技術は、マルチプレックス化可能なプラットフォーム上で、1滴の血液からヒト好中球の機能を直接測定することを目的としています。中央のローディングチャンバーは全血ソースとして機能すると同時に、16個の焦点化学走性チャンバーから形成される化学誘引物質勾配のシンクとしても機能します。赤血球の独自の機械的ろ過により、血液、細胞、および生化学的成分という自然なコンテクストにおける好中球の機能のプローブ解析が可能になります。焦点となる化学走性チャンバーへ続くチャネルと、デバイスから出るチャネルとの分岐により、遊走する好中球の方向性の定量化および調節が可能になります。これにより、能動的に遊走する好中球が、捕捉された赤血球を容易に通り抜け、時間とともに数が増加して蓄積することを実証できます。当社のマイクロ流体デバイスのユニークな特徴の一つは、製造とセットアップが非常に簡単であることです。これらは、マイクロファブリケーションされたウェハー上にキャストされたPDMS層で構成されており、それをガラス底のシングルまたはマルチウェルプレートに接合して使用します。この手法の主な利点は、全血をわずか一滴しか必要としないことです。これらのデバイスは標準的なピペットで使用でき、可動部品がなく、チューブや外部シリンジポンプも必要ありません。本手法の意義は、従来の技術で必要とされていたプロセスと比較して、臨床応用への展開に広がっています。我々のアプローチでは、採血から好中球遊走アッセイまでの時間を数分に短縮しています。新規の赤血球ろ過コームが、赤血球による好中球の能動的な遊走の阻害を防ぐことで、本手法を他のマイクロ流体的手法と差別化しています。そのためには、化学走化性アッセイを行う前に血液を除去する必要があります。赤血球とチャネルによる機械的なジャミングが当社の技術の特徴であり、血清や血小板を含む全血という生理的環境下で好中球の試験を行うことを可能にします。したがって、本技術は精密で使いやすく、健康および疾患における好中球と自然免疫系の役割に関する我々の理解を大幅に前進させることができます。製造元First patternの指示に従い、移行チャネルを定義するためのマスターモールドウェハーを作製します。まず3 µmのエポキシ系ネガ型フォトレジスト層を形成し、次に50 µmの第2層をパターニングして、細胞ロード室およびケモカイン室を定義します。次にポリジメチルシロキサン（PDMS）デバイスを鋳造するため、20 gのPDMSと2 gの開始剤を5分間激しく混合します。パターン形成されたウェハーの上にPDMSを慎重に注ぎ、真空デシケーター内で1時間脱気します。その後、65 °CのオーブンでPDMSマイクロ流体デバイスを少なくとも3時間焼き付け、硬化させます。PDMSが適切な温度で焼き付けられていることを確認するため、必ず温度計でオーブンの内部温度を監視してください。直径1.5 mmの全血充填用中央チャンバーをパンチで打ち抜きます。また、直径5.0 mmのドーナツ型デバイス全体を打ち抜きます。粘着テープを用いて、ドーナツ型デバイスから粒子を除去します。次に、マルチウェルプレートを脱イオン水で洗浄し、60 °Cのオーブンに5分間入れて乾燥させた後、窒素で乾燥させます。酸素プラズマ処理を35秒間行います。その後、ドーナツデバイスを加え、さらに酸素プラズマ処理を行います。さらに35秒間処理します。デバイスをプレートのウェルに慎重に移し、接合したデバイスを80 °Cのホットプレートで10分間加熱します。酸素プラズマ処理後、デバイスは親水性となり、毛細管現象によってデバイス内の微小チャネルへのプライミングが促進されます。化学誘引物質溶液を調製するため、10 µMのFMLP 5 µLと1 mg/mLのフィブロネクチン 5 µL、およびHBSS 490 µLを混合します。化学誘引物質溶液を全血ロードチャンバーピペットにゆっくりとピペットで注入し、さらに化学誘引物質 20 µLをデバイスの外周に加えます。プレートをデシケーターに入れ、15分間静置します。デバイスに真空をかけ、化学誘引物質溶液でプライミングを行います。デシケーターからプレートを取り出し、気泡の大きさが徐々に減少することで、デバイスチャネルが濡れたことを確認します。その後、過剰な化学誘引物質溶液を取り除くため、全血ロードチャンバーとデバイスの外側を十分に洗浄します。次に、各焦点化学走性チャンバーからデバイスの中心に向かって化学誘引物質の濃度勾配を形成させます。PBS 100 µLを孔に緩やかに注入し、デバイスの上にPBSの液滴を形成させます。プレートを傾け、デバイスの周囲にPBS 1 mLを滴下してウェルの底に集め、その液体を吸引します。このPBSによる洗浄を3回繰り返してください。次に、各ウェルに培地を満たしてデバイスを浸し、勾配が安定するまで15分間待ちます。その後、各全血ロードチャンバーに全血2 µLをゆっくりとピペットで分注します。指先穿刺による採血を行う場合は、石鹸と水で手を洗ってください。抗凝固染色の溶液として皮膚を乾燥させます。0.2%HSAを1 mL、32.4 µMのhooksを10 µL加えます。ヘパリン血球採集管で染色し、健康なドナーの指を穿刺して、最初の一滴の血液を拭き取ります。50 µLの血液を抗凝固染色液に採取し、緩やかに混合します。バイオチャンバーを37 °C、湿度80%、5% CO2に設定します。直ちにタイムラプスイメージングを開始し、10倍以上の倍率で撮影します。有意義な統計解析を行うため、各サンプルで少なくとも50個の好中球を手動でトラッキングしてください。焦点化学走性チャンバーに進入する細胞数を経時的にカウントします。次に、Image Jを用いて、WBLCとFCCの間のチャネルにおける好中球の速度を算出します。さらに、好中球の方向性を定量化するため、分岐点を通過する細胞数をカウントし、焦点化学走性チャンバーに向かう細胞数とデバイス外へ流出する細胞数の比率を算出します。方向性を持たない細胞は化学走性の勾配に従わないため、FCCと出口チャネルに向かって同数だけ移動します。本実験では、FMLP勾配に対する好中球の蓄積量を測定することにより、全血好中球化学走性アッセイを検証しました。その結果、赤血球はろ過コームによって捕捉される一方で、好中球は全血から能動的に移動できることが確認されました。全血マイクロ流体デバイスによって形成された安定した線形化学誘引物質勾配は、FSE標識デキストランを用いて確認され、蛍光レベルの時間経過に伴う測定が行われました。この新規WB化学走性プラットフォームを用いて得られた結果から、あらゆる血液源由来の好中球が、一貫した速度および同様の総遊走細胞数で遊走することが明らかになりました。重要な点として、本システムでは好中球の定量が可能であるため、化学走性と化学運動性を区別することができます。習熟すれば、適切に実施することでこの手法を10分以内に完了させることが可能です。標準的なクリーンルームの手法および設備を用いて、我々のデバイスを12ウェルまたは24ウェルプレートに組み込むことで、複数の条件を同時にスクリーニングすることが可能です。この手法を用いることにより、単一細胞レベルで好中球の速度と方向性を測定することができます。バルクでのエンドポイント細胞遊走を測定する従来の手法とは異なり、マイクロ流体デバイスを注意深くプライミングし、赤血球がデバイスの入口を通り越して押し出されないよう、両方のサンプルをゆっくりとロードしてください。本プロトコルは、特に一過性の好中球走化性欠損を測定する際に有用であり、複数のタイムポイントで繰り返しサンプリングを行うことが可能です。また、異なるモデル生物における他の細胞種の遊走測定への応用も可能です。本手法は、外傷患者、大手術後の患者、化学療法を受けているがん患者など、感染症の発症率が高まる様々な病態にある患者における、好中球機能の一時的な変化に関する知見を提供します。

microfluidic-platform-for-measuring-neutrophil-chemotaxis-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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学ぼう、未処理の全血から好中球の走化性を測定するマイクロ流体アッセイ。PDMSデバイスを用いて赤血球を機械的に濾過し、FMLP勾配下で好中球の移動速度と方向性を定量化する方法です。

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

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