検査

この手順の全体的な目的は、Drosophila melanogasterの嗅覚をテストするためのシンプルなY迷路アッセイを提供することです。まず、ハエを16から18時間飢餓状態にすることで、揮発性刺激のある新しい環境を探索する意欲を高めます。次に、溶媒に溶かした酢酸などの臭源を染み込ませたフィルターペーパーと、溶媒のみのフィルターペーパーを配置したY迷路のセットアップを組み立てます。

第3のステップは、ハエを迅速かつ慎重にローディングバイアルに導入することです。数時間後、最終ステップとして、迷路内におけるハエの位置をスコア判定します。最終的に、Y迷路で得られたデータから、誘引物質に対する反応を示すことができます。

この手法のアイデアは、ショウジョウバエの嗅覚応答をテストするための、簡便かつ安価な方法を検討していた際に得られたものです。他の選択肢と比較したこの技術の利点は、ハエが過剰なストレスを受けていないか判断できる点にあります。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程学生であるMegan Simonが行います。本プロトコルのために、安定し強固な行動表現型を持つアイソジェニックなハエ系統を用意してください。そのようなストックであれば、嗅覚テストのリファレンスコントロールとして使用可能です。実験に使用する各遺伝子系統については、リファレンス系統に5世代にわたってバッククロスさせてください。

各戻し交雑について、単一の実験系統の雌を数匹の同遺伝子系統の雄とペアリングさせます。嗅覚実験では、ドロソフィラを抗生物質添加の標準コーンフラワー培地を用い、12h/12hの明暗サイクル、25 °Cの条件下で維持してください。

実験は常に25°Cで、ドロソフィラ（ショウジョウバエ）には見えない遠赤色スペクトルの光の下で実施してください。また、翌朝にアッセイを行う前に、実験間の室内の完全な換気が可能である必要があります。一日の終わりに、10〜20匹ずつの実験系統のコホートを、濡れタオルで湿度を確保したガラスバイアルに移してください。

ハエは16～18時間以内にテストする必要があります。さもなければ、翌日には脱水や飢餓により死亡する可能性があります。Y字迷路を組み立てます。まず、カットしたピペットチップを付けたフォームコネクターを使用して、Y字型コネクターを2本のガラスバイアルに接続します。これにより導管が形成され、そのテーパー形状によって一方通行の通路となります。

Y字管の3本目の分枝は、ピペットチップの大部分で作られたローディングチューブに接続されており、ローディングバイアルから迷路の選択点まで通路となっています。各テーパートンネルの先にはガラスバイアルがあり、そのうちの1つににおい物質をロードする必要があります。これらは、28 mm四方のティッシュペーパーに浸透させた40 µLのボルスとして準備します。

どちらに匂い物質が含まれているかをランダムに交互に変更して試験を行います。ショウジョウバエを短時間氷上で冷却し、動きを緩やかにします。LED電球による遠赤色光の下、25 °Cの環境で、ショウジョウバエの集団をロード用バイアルに静かに投入し、Y字迷路に試験個体をロードします。

ガス麻酔は使用しないでください。ショウジョウバエをロード用バイアルに迅速かつ慎重に移動させることが極めて重要です。Y字型マスの中で他の個体が拡散する前に、個体が速やかに覚醒する必要があるため、この工程が本実験において最も困難なステップとなります。

最大数のハエがどちらか一方のガラスバイアルに移動できるよう、ハエに24時間迷路を探索させます。各チューブに存在するハエの数を用いて嗅覚指数を算出します。最大10匹のハエの行動から得られたこの値に対して、標準的な統計手法を適用してください。

10群のショウジョウバエで一貫した結果が得られない場合は、20群で試験を行うことができます。迷路の構成部品を洗浄するには、分解した状態でRBS 35 MDに一晩浸します。その後、水道水ですすぎ、最後にDI waterですすいでから自然乾燥させます。

臭気物質に対する標準的な反応には、Y迷路を用いた試験における誘引、無関心、または忌避が含まれます。例えば、ショウジョウバエは10%酢酸を強く忌避しますが、10%フェニル酢酸は忌避しません。

この手順を行う際は、この嗅覚アッセイがショウジョウバエにとって人工的な環境であることを念頭に置くことが重要です。本手順を手法として用いた後、チームメイト充填アリーナや内部アッセイのような方法で、ショウジョウバエの嗅覚応答および異なる条件を検証することができます。このビデオを視聴することで、SWアッセイを用いてDrosophila melanogasterの嗅覚応答を簡便にテストする方法について、十分な理解が得られるはずです。