Name: における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識ショウジョウバエアンテナ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 学ぶショウジョウバエ触角のホールマウント免疫標識法。Drosophilaの嗅覚受容ニューロンを可視化し、ORN多様化の分子メカニズムを解明する神経科学的手法です。

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この研究は、私立大学の戦略研究財団と私たちは、ビデオクリップを編集する大竹徳仁に感謝したいと思い、HT用の日本学術振興会若手Bの許諾のための文部科学省支援プログラムによってサポートされていました。

1。アップルのプレートを準備します<ol><li> 12.5グラム寒天を混ぜ、125ミリリットル100パーセント市販のリンゴジュース、12.5グラムのグルコース、および375ミリリットルのH 2 O 1〜2分間マイクロ波混合物を3センチ細胞培養皿に注ぐ。 4℃で保存する</li></ol> 2。遺伝的交雑<ol><li>以下の代表的な遺伝的交雑を使用します。 </li></ol> Or49a-mCD8 :: GFP / CYO X 1118ワット 3。切開および染色プロトコール<ol><li>ハエを麻酔した後、ピンセットを用いて保持することにより、垂直フライ頭を切った。 </li><li>慎重にリンゴの板の上にアンテナ収納部を配置。 </li><li>細かい解剖ハサミを使用して、アンテナの3番目のセグメントをカットします。 </li><li>ガラス底培養皿の中央に固定溶液（0.1％PBST（0.1％トリトンX-100を有するPBS）中4％パラホルムアルデヒド）の90μLを置く。 </li><li>やさしく解剖しantennを転送定着液に直接鋭い針でAE。必要に応じて、物理的に針を用いて溶液中にアンテナを沈める。 </li><li>室温（RT）で40分間インキュベートする。同じ料理でそれらを保ち、0.4％PBST（0.4％トリトンX-100を含むPBS）で各3回10分でアンテナを洗う。 PBST溶液を除去し、追加するために、黄色のヒントを参考にしてください。たびに洗浄溶液の90μlを使用する。 注：免疫組織化学の間にシェーカーに料理を置かないでください。皿に液を除去または追加する前に、針を用いて皿の中央にすべてのアンテナを持って、慎重に皿の端からソリューションを追加または削除します。 </li><li>室温で20分間、0.1％PBST中5％正常ウマ血清を90μlのアンテナを遮断する。 </li><li>ブロッキング溶液を除去した後、前述のように加湿容器中で4℃で48時間、5％ウマ血清を含有する0.1％PBST中の90μlの一次抗体とインキュベートアンテナ<s&gt; 8まで。 </li><li> 0.4％PBST中10分6Xアンテナを洗う。 </li><li> 4℃で48時間、5％ウマ血清を含む0.1％のPBST中の二次抗体を90μlのアンテナをインキュベート0.4％PBSTを使用して洗浄6X 10分。 </li><li>アンテナをマウントするには、培養皿から可能な限りPBSTを削除し、徐々にアンテナにグリセロールの2種の異なる濃度をご紹介します。最初の1〜2分間皿に40％グリセロールを加える;その後、これを削除し、80％グリセロールを追加します。 </li><li>慎重に黄色のチップを用いて培養皿から（80％グリセロールを含む）のアンテナを抽出し、スライド上に配置します。そっと上にカバースリップを置き、マニキュアでカバーガラスの端をシールします。アンテナは現在、蛍光顕微鏡で画像化される準備ができている。 </li></ol>

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<li>Clyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+of+individual+sensilla+on+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna.</a> Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).</li>
<li>Vosshall, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96, 725-736 (1999).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は説明しショウジョウバエのアンテナの解剖は、簡単で実験室環境で実行するのは簡単です。成功した切開を確保するためには、微細なエッジのはさみを利用することが不可欠である。解剖アンテナ免疫染色が、抗体溶液の蒸発を回避するために、水分で満たされた容器でそれらをインキュベートすることが重要である。解剖アンテナは、溶液中に浮遊する傾向がある。定着時にPBS中の0.1％トリトンを使用してステップを遮断することは、溶液中、アンテナの水没を促進し、より良い染色を確実にするために。 「ガラス底培養皿」を使用した免疫染色時のアンテナの損失を低減し、各実験に用いた抗体溶液の少量（90μl）を確保することができる。 神経細胞のクラスの多様化は、神経新生の中心的な機能です。この生理学的なプロセスは、嗅覚受容ニューロンの大規模な配列を利用して嗅覚系、（ORN）に例示されているクラス。嗅覚受容体の発現と軸索を標的とORN類の多種多様な世代が高次脳機能センターに匂い分子からの情報を伝送するために必要な神経細胞の多様性を生成することが重要です。私たちの全体のアンテナはORNの多様化の基礎となる分...

嗅覚系は臭気分子の巨大な様々な区別するために、その後、高次脳センターに得られた情報を送信するために使用される。この入力は、正確にそのような摂食及び相手1-6のような基本的な動物の行動を制御するために使用される。各嗅覚ニューロンタイプが臭いの特定のセットに関連付けられているように、嗅覚受容ニューロン（ORN）Sの多様化は、適切な嗅覚システム機能7に不可欠である。 ショウジョウバエの遺伝学はORNの開発と生理機能8月16日に関連する分子機構が関与する単一細胞レベルの調査を行うために私達を可能にします。 ショウジョウバエの触角の全マウント免疫染色は、より詳細に嗅覚受容ニューロンの多様化に関わる分子機構（ORN）S 7を理解することができました。ここに我々はACに簡単な方法の包括的な説明を提供これをhieve。

<table><tbody><tr><td>Stemi DV4 解剖顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底培養皿&nbsp;</td><td>MatTek株式会社</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗ELAV</td><td>Developmental Studies ハイブリドーマバンク</td><td>7E8A10</td><td>希釈率 1:200</td></tr><tr><td>マウス抗GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>希釈率 1:400</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>711-225-152</td><td>希釈1:200</td></tr><tr><td>ロバ抗ラットIgG</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>712-165-150</td><td>希釈率 1:200</td></tr></tbody></table>

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

付臭剤の分子は、正確かつ協調的にそれらの標的受容体に結合する。各受容体は、特定の信号を認識し、脳にその情報を中継します。このように、嗅覚情報が知覚や行動、メリットの調査の両方を修正すること、脳へ転送する方法を決定する。興味深いことに、細胞のシグナル伝達および転写因子が嗅覚受容ニューロンの多様化に関与しているという新たな証拠がある。ここでは、in vivoでの嗅覚受容ニューロン組織をアッセイする免疫学的標識法をマウント堅牢全体を提供する。この方法を用いて、抗ELAV抗体、既知の汎神経マーカー及びOr49a-mCD8 :: GFP、特に抗GFP抗体を用いたNBAのニューロンに発現し嗅覚受容ニューロンを持つすべての嗅覚受容ニューロンを同定した。

解剖と固定の両方を迅速に行われることを確保することは、このプロトコルで成功を達成する上で重要な要素です。細かいハサミや鉗子を使用しても、非常に重要です。免疫染色後、蛍光ラベルされたアンテナは、共焦点顕微鏡下で調べた。私たちは通常、20倍レンズを使用して1μm以下のセクションを取る。我々はNBAのをOr49a-mCD8 :: GFPを使用して7 ORN類を標識して、野生型のアンテナではNBAのORN類の数を数えた。 mCD8-GFPレポーターは、細胞膜に局在しているので、式は、図GFPを発現OR49a ORN類の2呈する細胞膜に見られる。図2に抗GFP抗体と抗ELAVを使用してNBAのORN類式は汎神経マーカーとして使用されたを示しています。アンテナ毎のNBAのORN類の平均数は、20（n = 8）になる。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51245/51245fig1highres.jpg" wid...

ここでは、ショウジョウバエのアンテナの全マウント免疫染色のプロセスについて説明し、これにより、嗅覚受容体ニューロン(ORN)の多様化に関与する分子メカニズムをよりよく理解することができます。

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

本実験の全体的な目的は、触角のホールマウント染色を用いて嗅覚受容ニューロンを可視化することです。まず、ハエを麻酔し、頭部を垂直に切断します。次に、解剖したハエの頭部をアップルプレート上に配置します。次に、触角の第3節を切断し、免疫組織化学染色を行うためにガラス底培養皿に移します。スライドガラスに触角を固定した後、共焦点顕微鏡を用いて、多様な種類の嗅覚受容体ニューロンを可視化することができます。私たちは嗅覚系についての研究を行っています。嗅覚系は、多種多様な分子を識別するために利用されています。この系に存在する広範囲かつ個別の嗅覚ニューロンにより、標的受容体から脳内のニューロンへと、正確かつ協調的な情報の伝達が可能になります。本日は、これらの嗅覚受容体ニューロンの多様性を検出するための、触角のホールマウント染色について解説します。ホールマウントおよび触角染色の成功を確実にするため、プロトコルを開始する直前に固定液を新しく調製することが極めて重要です。ハエを麻酔し、ピンセットで体を固定して、ハエの頭部を垂直に切断します。次に、切り出した触角を慎重にアップルプレート上に配置します。微細解剖用ハサミを用いて、触角の第3節を切断します。ディッシュの中央に固定液 90 µLを滴下します。鋭い針を用いて、切断した触角を固定液へ慎重に直接移します。次に、固定を完了させるため、室温で40分間静置します。洗浄液を除去しながら、PBSTで10分間×3回の洗浄を触角に行います。まず、針を用いてすべての触角をディッシュの中央に集めます。その後、ディッシュの側面から溶液を取り除きます。インキュベーション中の攪拌は不要です。染色の準備として、最後のPBST洗浄液を取り除き、0.1% PBSTに調製した5%馬血清90 µLをチャンバーに満たして、固定した触角をブロッキングします。その後、ブロッキング溶液を、5%馬血清の混合液で希釈した一次抗体に置換します。PBSTにおいて、使用する一次抗体は、400倍に希釈したマウスanti-GFPおよび200倍に希釈したラットanti-eofであり、触角試料の乾燥を防ぎます。培養皿の蓋に湿らせたティッシュを置き、パラフィルムで密封します。その後、培養皿を湿らせたティッシュを入れたプラスチック容器に入れます。触角を一次抗体とともに4℃で48時間インキュベートします。その後、PBSTで1回10分間、計6回洗浄し、未結合の一次抗体を除去します。これは、前述の固定液除去の手順と同様です。PBSTで1時間洗浄した後、PBSTで希釈した5%馬血清混合液で希釈した二次抗体溶液を加えます。本例では、二次抗体として抗ウサギIgGおよび抗ラットIgGを使用します。ここからは、光退色を防ぐために容器をアルミホイルで覆います。次に、抗原を二次抗体中で4°Cで48時間インキュベー

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は生きているの触角葉で匂い誘発カルシウム応答を測定し、分析するための確立された技術を記述する...

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

このようなニューロンの樹状突起のような複雑な細胞の形状は、開発中に達成されるかを理解するために、それは正確にアッセイの微小管の組織にできることが重要です。ここでは、樹状突起分枝のニューロン感覚樹状突起の微小管の組織、気管、筋肉を調べるために堅牢な免疫標識法を説明し、他の...

免疫組織学的な感覚ニューロンの樹状突起における微小管の標識、気管、との筋肉ショウジョウバエ幼虫の体壁

このビデオは、突然変異したショウジョウバエの脳のキノコ体の表現型欠損を視覚化するための詳細な免疫染色プロトコルを示しています。このプロトコルには、キノコ体の適切な形態学的および機能的発達を促進する軸索誘導に関与するタンパク質であるFas2に対する抗体を使用することが含まれます。...

免疫染色によるショウジョウバエ脳のキノコ体ニューロンの可視化

我々は、中枢神経系における単一ニューロンを標識するための技術（CNS）の提示...

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

嗅覚ニューロンの繊毛はシグナル伝達カスケードのタンパク質を含んでいますが、その分布の詳細な空間分析は凍結切片では困難です。ここでは、毛様体タンパク質のホールマウントラベリングとエンフェイスビジュアリゼーションのための最適化されたアプローチについて説明します。...

マウスの主嗅覚系における繊毛のホールマウントのラベリング

このプロトコールの全体的な目標は、長鎖クチクラフェロモンに応答するショウジョウバエの嗅覚受容体ニューロンからの単一感覚記録のための低揮発性の付臭剤を提示する方法を示すことである。...

からの電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;低揮発性の臭気物質に対するトリコイドセンシラ

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

細胞は異なる形態を表示し、様々 な彼らの隣人との相互作用を確立します。このプロトコルでは、単一細胞の形態を明らかにする、老舗の Gal4/UA...

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

ここでは、ステージし、解剖ショウジョウバエ種から嗅覚の組織を開発するためのプロトコルを提案する.解剖組織は、免疫組織化学または上皮内などの生体内解析だけでなく、定量的 RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) や RNA 配列 (RNAseq)...

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

このプロトコルは、嗅覚回路アセンブリの研究のためのアンテナ -...

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

本記事では、試薬を節約し、少数の想像椎間板を取り扱いやすくする効率的な幻想椎間板解剖および抗体染色プロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエ・メラノガスターからの眼触角および翼の想像円板の小規模解剖および抗体染色

学ぶショウジョウバエ触角のホールマウント免疫標識法。Drosophilaの嗅覚受容ニューロンを可視化し、ORN多様化の分子メカニズムを解明する神経科学的手法です。

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識

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