連結可能な蛍光プローブによる実験脳卒中における細胞死の貪食クリアランスを評価する

本手順の全体的な目的は、脳卒中において細胞死骸を除去する活性化した食細胞を選択的に標識することです。これは、まずTiteベースの信号増幅反応に必要なコンポーネントを調製し、次に切片を調製することで達成されます。

次に、vaccinia酵素、トポイソメラーゼ、および反応性蛍光プローブを用いて標識反応を行います。最終ステップは、IDEに基づいた蛍光信号の増幅です。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、焦点性脳虚血の組織切片における死細胞の貪食能による除去を評価します。

食細胞による死細胞の除去は、虚血後の脳の回復において重要な役割を果たします。本手法では、死細胞を能動的に除去している食細胞のみを標識することで、このプロセスの効率を判定します。この手法は虚血脳への知見を提供しますが、他の臓器や組織における虚血性損傷の研究にも適用可能です。

FAによる死細胞の酸性除去が重要となる場合についてです。IDEシグナル増幅またはTSAステップは標識の最終段階で行われますが、この反応の準備には1時間以上かかることがあります。したがって、先にTSA試薬を調製しておく方が効率的です。

最初のステップは、TSA標識キットに含まれるtyrom試薬ファイルに300 µLのDMSOを加え、fluoro four TYROMストック溶液を作製することです。次に、ブロッキング試薬を完全に溶解させるために、TNT洗浄バッファーを調製します。TNBブロッキングバッファーを作製する際は、溶液を撹拌しながら少量ずつゆっくりと加え、徐々に55 °Cまで加熱してください。

継続的に攪拌すると、溶液は乳白色になります。分注して使用する前に室温に戻し、長期保存する場合は-20°Cで保存してください。本手順では、ホルマリン固定組織から切り出した厚さ5µmの切片を標本に載せ、あらかじめスライドを準備しておきます。まず、切片をキシレンで15分間処理し、一連のエタノール洗浄によって切片を再水和させた後、水で2回洗浄します。

次に、ストックソリューションをPBSで希釈し、50 µg/mLのproteinase K作動液を調製します。本実験で最も困難な点は、proteinase Kによる消化の最適時間を決定することであり、組織のサイズや種類に応じて、成功を確実にするために消化時間を短くしたり長くしたりしたコントロールが必要になる場合があります。適切な量のproteinase K作動液を切片に加え、23 °Cで15分間インキュベートします。

インキュベーション後、切片を蒸留水で5分間ずつ2回洗浄します。切片を浸漬させている間に、活性化プローブを含む標識ミックスを調製します。活性化プローブ溶液を調製するには、オリゴヌクレオチドに1 M Tris-HClとキット付属のワクシニアトポイソメラーゼを加え、ピペッティングで穏やかに混ぜ合わせた後、プローブを活性化させるために室温で15分間インキュベートします。

2回目の洗浄期間の後、切片を容器から取り出し、残った水を吸引除去します。準備が整ったら、事前に調製した活性プローブ溶液を適用して被覆します。切片をスライドに載せ、23 °Cで15分間インキュベートします。

インキュベーション後、スライドを水に浸してカバーガラスを慎重に除去します。スライドを水で3回、各5分間洗浄します。最後の洗浄後、組織切片にTNBブロッキング緩衝液をかけ、加湿チャンバー内で室温にて30分間インキュベートします。

この間に、ストリプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（S-A-HRP）をTNBブロッキング緩衝液を用いて1:100に希釈して調製します。スライドを取り出し、TNBブロッキング緩衝液を吸い取ります。S-A-HRP溶液を添加する際は、組織切片全体を覆うのに十分な量の試薬を使用してください。

カバーガラスを被せた後、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、室温のTNT洗浄バッファーで5分間ずつ3回洗浄します。使用直前に、1×増幅希釈液を用いて、fluorophore stockを1:50に希釈して調製します。この溶液をスライドに滴下し、組織切片全体を完全に覆ってください。

溶液は再利用できないため、未使用分は廃棄してください。スライドを室温で3〜10分間インキュベートします。蛍光を確認してください。

構造物の兆候が最初に見えるまで、顕微鏡の倍率を上げます。速やかに洗浄ステップへ進んでください。スライドを5分間ずつ3回洗浄します。

室温で撹拌しながらTNT洗浄バッファーで洗浄します。洗浄後、DPIを含む抗退色溶液を加え、カバーガラスをかけます。蛍光顕微鏡で結果を観察してください。

これらの画像は、PHA酸性クリアランスの2つの例を示しています。核染色であるdappyが青色蛍光で示され、liable vac topoプローブが緑色蛍光で示されています。これらの画像に提示された事象の図には、食細胞の核と、消化のさまざまな段階にある取り込まれた細胞外核が示されています。習得すれば、適切に実施することで約3時間でこの手法を完了させることができます。

このビデオを視聴することで、組織切片における生存蛍光プローブの使用方法を習得できます。また、虚血脳において死細胞を除去し、活性化したミクログリアを選択的に標識する方法を学ぶことができます。