連結可能な蛍光プローブによる実験脳卒中における細胞死の貪食クリアランスを評価する

この手順の全体的な目標は、脳卒中の細胞死体を一掃する活性食細胞を選択的に標識することです。これは、まずTiteベースのシグナル増幅反応用のコンポーネントを準備することによって達成されます。2番目のステップは、セクションを準備することです。

次に、酵素ワクシニア、トポイソメラーゼ、およびリテント蛍光プローブを用いて標識反応を行います。最後のステップは、IDEベースの蛍光シグナル増強です。最終的に、蛍光顕微鏡法は、限局性脳虚血の組織切片における死細胞の食作用クリアランスを評価するために使用されます。

食細胞による死細胞のクリアランスは、虚血後の脳の回復に重要な役割を果たします。提示された方法は、死細胞を積極的に除去するpegoサイズのみをラベル付けすることにより、このプロセスの効率を決定します。この方法は虚血性脳への洞察を提供しますが、他の臓器や組織の虚血性損傷の研究にも使用できます。

死細胞のFA酸性クリアランスが重要な場合。IDE信号の増幅またはTSAステップはラベリングの最終段階で発生しますが、この反応の準備には1時間以上かかる場合があります。したがって、TSA試薬を最初に作成する方が便利です。

最初のステップは、TSAラベリングキットに含まれるTYROM試薬ファイルに、300マイクロリットルのDMSOでフルオロ4TYROMストック溶液を作成することです。次に、ブロッキング試薬を完全に溶解するためにTNT洗浄バッファーを調製します。TNBブロッキングバッファーを作るときは、溶液を55°Cまで徐々に加熱しながら、少しずつゆっくりと加えます。

連続攪拌では、溶液は乳白色に見え、アリコートを使用する前に室温に持って来て、この手順のための長期使用のために摂氏マイナス20度で保存する必要があります、スライドは5マイクロメートルの厚さのセクションをマウントすることによって事前に準備されます。ホルマリン固定組織から切り取ります。まず、切片をキシレンで15分間処理し、一連のエタノール洗浄で切片を再水和し、続いて水で2回洗浄します。

次に、PBSでストック溶液を1ミリリットルあたり50マイクログラムに希釈することにより、プロテイナーゼKワーキングソリューションを作成します。この実験の最も難しい部分は、組織のサイズと種類によっては、成功を確実にするために短い消化時間と長い消化時間の両方が必要になる可能性のあるプロテイナーゼK消化制御の理想的な時間を決定することです。適切な量のタンパク質ACE Kワーキング溶液を切片に加え、摂氏23度で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、切片を蒸留水でそれぞれ5分間ずつ2回洗浄します。切片を浸漬している間に、活性プローブを含む標識混合物を準備します。活性プローブ溶液を調製するには、オリゴヌクレオチドをキットに付属の水1モルトリス、HCL、およびピペッティングで穏やかに混合したワクシニアトポイソメラーゼと組み合わせ、室温で15分間インキュベートしてプローブを活性化させます。

2回目の洗浄期間の後、瓶から切片を取り出し、残りの水を吸引します。準備ができたら、前に準備したアクティブプローブ溶液をカバーに塗布します。切片を滑り込ませ、摂氏23度で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、スライドを水に浸してカバースリップを静かに取り除きます。スライドを水で3回、それぞれ5分間洗います。最後の洗浄後、組織切片をTNBブロッキングバッファーで覆い、スライドを加湿チャンバー内で室温で30分間インキュベートします。

この間に、剥離したペルオキシダーゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートを1〜100希釈液で調製します。S-A-H-R-PをTNBブロッキングバッファーに入れ、スライドを取り出してTNBブロッキングバッファーを吸引します。S-A-H-R-P溶液を塗布する前に、組織切片全体を覆うのに十分な試薬を使用してください。

蓋をしたら、スライドを室温で30分間インキュベートしますインキュベーション後、スライドをそれぞれ5分間ずつ3回洗浄します。室温のTNT洗浄バッファーで、使用直前に1倍増幅希釈液中の1〜50希釈のフルオロ4 TY IDEストックを調製します。溶液をスライドにピペットで移し、組織切片を完全に覆います。

溶液は再利用できないため、残っている未使用部分は廃棄してください。スライドを室温で3〜10分間インキュベートします。蛍光を監視します。

この時点で構造の最初のヒントが見えるまで、顕微鏡下で増やします。すぐに洗浄ステップに進みます。スライドを3回、それぞれ5分間洗います。

TNTでは、室温で攪拌しながら緩衝液を洗浄します。洗濯後、DPI入りの退色防止液を加え、スリップを覆います。蛍光顕微鏡で結果を観察します。

これらの画像は、PHA酸性クリアランスの2つの例を示しています。核の汚れは青色の蛍光で示され、責任のあるvacトポプローブは緑色の蛍光で示されていますこれらの画像に示されているイベントの蛍光図は、消化のさまざまな段階で食細胞とチックが巻き込まれた余分な核を示しています。このテクニックは、一度マスターすれば、きちんと行えば約3時間でできるようになります。

このビデオを見れば、組織切片における責任ある蛍光プローブの使用方法がわかります。また、虚血性脳の死細胞を除去する活性ideを選択的に標識することもできます。