Name: ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmRNA関連のアイソレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T17:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: 学ぶ酵母ミトコンドリア関連mRNAアイソレーション法。差遠心分離で翻訳中のmRNAとリボソームを単一調製で分離し、局在翻訳メカニズムを解明します。

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私たちは、博士に感謝します。 Erezさんエリヤフ、ダニエル·メラメド、Ophry松やドロンラパポートこのプロトコルの確立中助けとコメント。この作品は、ISF（承認番号が1193年から1109年）によって資金を供給される。

1。ミトコンドリア精製細胞のペレットを計量。おおよそ0.6グラムを100mlの細胞から得られる。 <ol><li> 30で600 = 1-1.5にOD酵母細胞100〜150ミリリットルの成長 ミトコンドリアを濃縮するために、このようなガラクトースベースの成長培地として非発酵増殖培地上℃、、。 </li><li>室温で5分間3000×gで遠心分離細胞、上清を捨てる。 </li><li>再び蒸留水と遠心でペレットを洗浄。上清を捨てる。 </li><li>細胞の0.5グラム当たり1ミリリットルのDTTバッファーでペレットを再懸濁します。それにより、加水分解性を向上させる、細胞壁内のジスルフィド結合を破壊するために、還元剤で細胞を処理することが重要である。 </li><li> 30℃で10分間、細胞をインキュベート 穏やかに振盪しながら℃で。一方、細胞の1グラム当たり6ミリグラムザイモリアーゼを比較検討し、ザイモリアーゼバッファに一時停止。 </li><li> 5分A用3000×gで遠心分離細胞Tの室温、上清を捨てる。 </li><li>細胞の0.15グラム当たり1ミリリットルザイモリアーゼバッファーでペレットを再懸濁します。ボルテックスを行います。 </li><li>水990μLでの細胞の10μlアリコートのOD 600を測定します。 </li><li> β-1、3 - グルカン結合のグルコースポリマーを加水分解し、フェロプラストを生成する細胞にザイモリアーゼ（ステップ1.5）を追加します。この工程から、スフェロプラストは、溶解を避けるために等張溶液中に維持されるべきである。 </li><li>穏やかに振とうしながら30℃（ザイモリアーゼの最適活性のための）で15分間細胞をインキュベートします。細胞壁の加水分解およびフェロプラストの発生を確認するには、水を990μlの細胞を10μlを混ぜる。スフェロプラストは、浸透圧の差に溶解するために期待され、OD 600は、少なくとも、ステップ1.9で決定された値未満の10倍されるべきである。そうでない場合は、さらに15分間ザイモリアーゼとのインキュベーションを続ける。 </li><li>室温で5分間、3,000×gで遠心分離細胞。慎重にDISカード上清を、ペレットとして不安定になることがあります。 </li><li>ザイモリアーゼBufferでフェロプラストを洗浄し、上清を捨てる。 </li><li> 100ミリリットルの回復培地でフェロプラストを懸濁します。三角フラスコにフェロプラストを移し、30℃で1時間インキュベート 振とうしながら、Cを°。ザイモリアーゼ治療翻訳中に逮捕され、mRNAの局在が（ 図1B）破壊されたため、この回復手順が必要です。 </li><li>予備冷却50ミリリットルコニカルチューブに0.1 mg / mlのCHXおよび転送フェロプラストを追加します。 CHXの添加は、mRNAとリボソーム協会を凍結することが重要です。このように、ミトコンドリアとリボソーム依存mRNAの関連付けが維持されている。 </li><li>遠心機は、4℃で5分間3000×gでフェロプラスト、上清を捨てる。 </li><li>冷たいマンニトール緩衝液で2回洗浄します。 </li><li> 4ミリリットル冷たいマンニトールBufferでフェロプラストを再懸濁し、タイトなフィットを搭載した15ミリリットルの容量のダウンスホモジナイザーに転送乳棒。優しく15ストロークでフェロプラストを破り、13ミリリットルチューブに溶解液を移す。 </li><li>核および破壊されていない細胞をペレット化し、4℃で6分間1500×gで溶解液を遠心分離する。 </li><li>慎重に新しいチューブに上清を移す。未分画サンプル（「合計」サンプル）として確保サンプルの1ミリリットル（25％）を設定します。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。 「合計」のサンプルの残りからの沈殿物のRNA（プロトコル3、RNAの沈殿を参照してください）​​。 </li><li> 4時10分、10,000×gで上清を遠心分離 ミトコンドリアをペレット化°C。 </li><li>新しいチューブに上清（〜3ミリリットル）を転送し、氷の上に保管してください。これは、「細胞質」画分である。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。 「細胞質」は、試料の残りからの沈殿物のRNA（Protのを参照してください。ocol 3、RNA沈殿）。 </li><li> 4℃で10分間万×gで再び3ミリリットルマンニトールバッファと遠心でペレットを洗浄</li><li> 3ミリリットルマンニトールバッファーでペレットを再懸濁します。このサンプルでは、ミトコンドリアが含まれ、「ミトコンドリア」画分と呼ぶ。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。 </li></ol> 2。 RNA抽出<ol><li> 8 MグアニジンHClおよび100％エタノールの2容積の各サンプル1ボリュームに追加。渦と-20℃で少なくとも2時間インキュベート ℃、 </li><li> 4で20分間万×gで遠心分離サンプル ℃、上清を捨てる。ペレットが不安定になる可能性があるため注意が必要です。 </li><li> 70％エタノールでペレットを洗浄。 </li><li> RNaseフリー水400mlでペレットを再懸濁し、新しいエッペンドルフチュー​​ブに試料を移す。 </li><li> 3 Mナトリウムacetatの0.1容量を追加することで、再びRNAを沈殿E pHは5.2〜100％エタノール2容量の。渦と-20℃で少なくとも2時間インキュベート ℃、 </li><li> 4℃で20分間、20,000×gで遠心分離サンプル上清を捨て、70％エタノールで洗浄する。 </li><li>空気がペレットを乾燥し、RNaseフリー水で懸濁します。 -80で保存RNAサンプル ℃、試料は、ノーザン分析19またはマイクロアレイ分析18（プロトコル3を参照）のために使用することができる。 </li></ol> 3。マイクロアレイ解析のためのRNAの準備<ol><li> RNaseフリー水650ミリリットルと歩調2.2からmRNAを懸濁します。 </li><li>積極的にクロロホルム（5:1、pHは4.7）とボルテックス：残留DNAまたはタンパク質を除去するために、等しい酸性フェノールの量（650ミリリットル）を追加します。 2分間最大速度で遠心分離する。 </li><li>新しいチューブに上相（水相）の500ミリリットルを転送します。それは、DNAが含まれているように、相間を取ることは避けてください。また、逆転写反応を阻害することができるフェノール、服用に注意してください。&lt;/李&gt; <li> RNAサンプルは、逆転写酵素の強力な阻害剤であるヘパリンの有意な量を含有する。このように、RT-PCRまたはマイクロアレイ標識のためにそれを除去する必要がある。塩化リチウム沈殿によりヘパリンを除去します。2 Mの最終濃度に塩化リチウムを追加し、-20℃で一晩サンプルをインキュベート ℃、 </li><li> 4でサンプルを解凍 ℃〜4℃で20分間、20,000×gで遠心</li><li>慎重に上清を廃棄し、80％エタノールでペレットを洗浄。ステップ3.5で説明したように再び遠心します。 </li><li>上清を捨て、空気乾燥およびRNaseフリー水150ミリリットル中にペレットを再懸濁します。 </li><li>任意の残留のLiClを除去するために、3 M酢酸ナトリウムpHが5.3体積の0.1〜100％エタノールを3倍量で再び沈殿させる。 -20でインキュベートする 少なくとも2時間、Cと°。 </li><li> 4で20分間最高速度で遠心 ℃、 80％エタノール、空気乾燥で慎重に透明なペレットを洗浄。 </li><li>再懸濁を25mlのRNaseフリー水を用いてペレット化し、-80℃で試料を維持 ℃、 </li><li> 18,20で説明したRNA標識およびハイブリダイゼーションのための手順に従ってください。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

画像内の科学技術の進歩は、mRNAの局在を研究するため、高解像度のツールが得られていた。今日、人はミリ秒時間スケール23-26においても単一のmRNA分子の動きを測定することができる。しかし、上述のものなどの従来の生化学的アプローチもまた、有益であり、いくつかの場合に好適である。生化学的隔離はmRNAおよびタンパク質の大きなレパートリーの精製を可能にし、従って、ゲノムワイドな研究のために好ましい。単離において、一方はDNAマイクロアレイ又はRNA-seqの18,27のいずれかによって、何千もの遺伝子の特徴付けを可能にするのに十分なmRNAレベルを得ることができる。並行して、一方がタンパク質を単離ミトコンドリア28上プロテオームを特徴付けるためにプロテオーム解析を実行することができる。生化学的分画は、他の細胞小器官、特にER 29からミトコンドリアを分離するように適合させることができる。これは、細胞の種類によっては有利であり得る高い空間的な重なりあったERおよびミトコンドリアの間で顕微鏡的局在解析を妨害する。生化学分画の重要な利点は、多くの異なるサンプ...

真核細胞は、特定の機能を有する個別のコンパートメントで構成されています。その機能を実現するためには、各区画には、その活性に必須であるタンパク質の固有のセットが含まれています。これらのタンパク質は、そのコンパートメントにアプローチを通して可能なメカニズムは、ローカライズ、翻訳、1,2である。このプロセスにおいて、タンパク質は、そこに配置されるリボソームおよびmRNAにより目的地に合成される。ローカライズされた翻訳の可能性の利点の中で、タンパク質のターゲティングの効率を増加したタンパク質シャペロンの必要性が減少し、サイト固有の制御機構を可能にしています。また、ローカライズされたmRNAおよびリボソームは、一般的な翻訳が阻害される細胞ストレス、例に翻訳機構の人里離れた貯水池することができます。 ミトコンドリアは、近年ではローカライズされた翻訳を研究するための中心的なモデルとなりました。ほとんどのミトコンドリアタンパク質は、核内に符号化された細胞質ゾルに翻訳され、および細胞小器官にインポート。証拠の様々な線は、これらのタンパク質の多くは局所変換プロセスを介して産生されることを示している。最初に、電子顕微鏡および生化学的分画研究は、ミトコンドリア3-5に関連したリボソームを検出しました。その後、共翻訳的に6,7にのみインポートすることが判明した特定のmRNA上の仕事によってin vivoで裏付けられ、これらの研究。ミトコンドリアでのmRNAの関連のゲノムワイドな研究では、mRNAのかなりの部分がミトコンドリア近傍8月10日に局在していることを明らかにした。これらのmRNAの一部はさらに、FISH又はMタグ9,11などのインビボ蛍光法によって特徴付けした。この関連の直接的な解釈は、これらのmRNAは、ローカライズされた翻訳のための鋳型として作用するということです。 これらのmRNAは、ミトコンドリアに接近するメカニズムは不明である。非コード領域（最もsignificantlyの3 &#39;のUTR）はミトコンドリア12 mRNAの会合に関与することが示された。これらのドメインは、それらの輸送​​を媒介するRNA結合タンパク質に対する結合部位として機能する可能性がある。酵母での研究では、タンパク質のPUMファミリーのメンバー（Puf3）はミトコンドリア8,13とmRNAの関連付けをサポートしていることを明らかにした。他の家族の機能に基づいておりPuf3、もっともらしい役割は、mRNAは、ルート 14 途中である間の翻訳を抑制することである。従って、mRNAは、非コード領域と相互作用するRNA結合タンパク質によって、非翻訳状態で輸送することができる。あるいは、作業の大きな体は、タンパク質が合成されている間輸送が生じることを示唆している。特に、翻訳阻害剤は、mRNAの会合8,13に影響を与えることが示された。さらに、このようなAUGをミトコンドリア標的化配列（MTS）またはORF領域として翻訳された特徴は、局在8,11,15を補助することが示された。 HSP70ファミリータンパク質のCHミトコンドリア外膜上aperoneおよびタンパク質受容体はさらに符号化されたタンパク質の機能は、mRNAの局在16にとって重要であることを示唆し、mRNAの関連付けをサポートすることが示された。これは、リボソームタンパク質はミトコンドリア新興17へのmRNA-リボソーム-タンパク質複合体を標的化するための認識要素として機能するモデルと一致する。 ミトコンドリアの近くの局在化、翻訳電子顕微鏡（リボソームを可視化するため）3、FISH 9、（特定のmRNAを検出するための）緑色RNA 11と、生化学的分画（RNAおよびリボソームの両方を検出する）10,18を含む様々な方法によって研究された。前者の方法は、インビボでの局在を検出し、トランスポート·ダイナミクスの可視化を可能にすることができるが、後者は単一の実験で多数の異なるmRNAの検出を可能にする。さらに、生化学的分画コードまたは非コードドメインの文献である必要はありませんteredは、したがって、それらの特定の役割を評価することができる。生化学的分画は正常に多くの異なる細胞区画の単離のために、長年にわたって使用されている。そのプリンシパルと制限は十分に確立され、人は簡単に様々な目的のために既存のプロトコルを変更することができます。必要な器具類は、したがって、それは通常、細胞内局在を研究するための選択の第一の方法で、多くのラボで標準です。私たちは、リボソームがミトコンドリアに関連しているながら、mRNAの単離のために最適化されたプロトコルを記述します。このプロトコルは、したがって、ミトコンドリアの近くに局在し、翻訳に関与する因子を研究するために最適である。

<table><tbody><tr><td>酵母エキス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラクトー</td><td></td><td></td>ス オート<td>クレーブしないでください ガラクトー</td></tr>ス <tr><td>成長培地</td><td></td><td></td><td>ミトコンドリアの濃縮には、ガラクトースベースの成長培地 滅菌 1% 酵母エキス、2% バクトペプトン、2% ガラクトース</td></tr><tr><td>0.1 M Tris-HCl、pH 9.4</td> <td>などの非発酵性炭素源を使用する必要があります</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM Tris-HCl、pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM DTT バッファー</td><td></td><td></td><td>0.1 M TrisHCl pH 9.4、10 mM ジチオスレイトール(DTT)。毎回新鮮に</td></tr><tr><td>1.2 M ソルビトール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 mM K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &#956;mフィルター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ザイモリアーゼバッファー</td><td></td><td></td><td>1.2 M ソルビトール、4 mM KH2PO4、16 mM K2HPO4.このバッファをフィルタリングします (0.2 &#956;m)および将来の使用のために室温で保管</td></tr>します <tr><td>チモリアーゼ20T</td><td></td><td></td><td>20,000 U / g</td></tr><tr><td>回復培地</td><td></td><td></td><td>ガラクトースベースの増殖培地に1 Mソルビトール</td></tr><tr><td>0.1 mg / mlシクロヘキシミド(CHX)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.6 Mマンニトール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM MgAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mg/mL ヘパリン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM フェニルメタンスルホニルフッ化物 (PMSF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マンニトール緩衝液</td><td></td><td></td><td>0.6 M マンニトール、30 mM Tris-HCl pH7.6、5 mM MgAc、100 mM KCl. 新たに追加:0.5 mg/mL ヘパリン、0.1 mg/ml CHX、1 mM (PMSF)。このバッファーをろ過し、氷冷</td></tr>した <tr><td>8 M グアニジニウム-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% および 70% エタノール (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>3 M 酢酸ナトリウム、pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>10 M LiCl ストック溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>250 mM Tris HCl、pH 6.8</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&#946;-メルカプトエタノール</td>ブロモフェノール<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブルー4x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSB</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris HCl pH 6.8、8% SDS、40%グリセロール、20% &#946;-メルカプトエタノール、および0.02%ブロモフェノールブルー</td></tr><tr><td>15mlの容量のホモジナイザー タイトフィット乳棒</td><td></td><td></td><td></td>を装備</tr></tbody></table>

ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmrna関連のアイソレーション

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

ミトコンドリアタンパク質の大部分は核内にエンコードされ、細胞小器官にインポートされる必要がある。タンパク質はミトコンドリアの近くに合成されている間、輸入が発生することがあります。この可能性のサポートは、ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAは、多くのミトコンドリア付近に局在することが示された最近の研究に由来する。一緒に外膜とのリボソーム協会の以前のデモで、これらの結果は、局所的な翻訳プロセスを示唆している。このような局所的な変換は、輸入の効率を向上させる独自の規制部位を提供し、異所性発現の例を最小にすることができる。多様な方法には​​、局所的な翻訳を媒介する因子および要素を特徴付けるために使用されてきた。これらの中で標準差動遠心分離によって細胞下分画である。このプロトコルは、単一の手順でのmRNA、リボソームとタンパク質の単離できるという利点がある。これらは、次いで、種々の分子と両性によって特徴付けることができるochemical方法。さらに、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクス法は、それによってゲノムワイドな洞察を可能にし、得られた材料に適用することができる。そのような研究のためのモデル生物としての酵母の使用は、速度、費用および単純性の利点を有する。さらに、高度な遺伝学的ツールおよび使用可能な削除株が候補因子の検証を容易にします。

このプロトコルは、細胞質ゾルの構成要素からミトコンドリアを含む画分を分離することができます。その成功をテストする最良の方法は、別の単離段階からサ ​​ンプルにノーザン分析およびウエスタン分析（ 図1）を実行することです。アイソレーション特性のための3つのパラメータは、これらの分析に由来する。まず、サンプル中のRNAまたはタンパク質が無傷であるかどうか - これらは分析において明瞭なバンドとして検出されます。分解イベントは付加的な、より短いバンドまたはスメアの出現を誘導する。第二に、入力（ すなわち合計）からの信号と、各ステップからの信号を比較する準備中に紛失に関する重要な情報を提供しています。重度の損失は、合計した信号の相対量の間に有意な差として観察されるであろう。最後に、そして最も重要な、ミトコンドリア及び細胞質ゾル成分との間の分離の品質を決定することができる。そのままmitochondriの分離唯一のミトコンドリア画分中ではなく、細胞質画分（ 図1A）中のミトコンドリア転写転写産物のシグナルになります。さらに、ミトコンドリア関連しているタンパク質は...

ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAの多くはミトコンドリア外膜に関連している。私たちは、それに関連するmRNAおよびリボソームと酵母ミトコンドリアの分離を目的とした細胞下分画の手順が記載されている。このプロトコルは、mRNAの局在化およびミトコンドリア付近の局所的な翻訳の機構を明らかにするために、多様な条件下で増殖させた細胞に適用することができる。

ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmRNA関連のアイソレーション

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

この手順の全体的な目的は、翻訳中のmRNAに関連するミトコンドリアを単離することです。まず、ミトコンドリアを濃縮させる条件下で培養した酵母細胞を回収します。次に、シクロヘキシミドの存在下で細胞を緩やかに溶解させます。次に、分画遠心法によりミトコンドリアを可溶性成分から分離します。最終ステップは、ミトコンドリアおよびコントロール試料からRNAを抽出することです。最終的に、ノーザン分析を用いて、ミトコンドリア関連RNAの純度と品質を検証します。この手法の主な利点は、1回の調製で多くの種類のRNAを単離できることです。したがって、比較解析が可能になります。この方法は、細胞内標的化やオルガネラの機能など、細胞生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手順では、非発酵性増殖培地にて30 °CでOD 600が1から1.5に達するまで培養した100から150 mLの酵母細胞からミトコンドリアを精製します。細胞を室温で3000 ×gで5分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを二回蒸留水で洗浄して、再度遠心分離します。上清を捨てた後、細胞ペレットの重量を量ります。通常、100 millilitersの細胞から約0.6 gramsが得られます。細胞0.5 gramsにつき1 milliliterのDTT緩衝液を用いて、ペレットを再懸濁します。細胞壁内のジスルフィド結合を切断し、加水分解効率を向上させるために、還元剤で細胞を処理することが重要です。細胞を30 °Cで10分間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。次に、室温で3000 ×gにて5分間、細胞を遠心分離します。上清を捨て、ペレットを再懸濁します。細胞0.15 gに対してxmal liaseバッファー1 mLを加え、ボルテックスしないでください。細胞の10 µL分注液を990 µLの水に加え、OD 600を測定してその値を記録します。 freshly prepared xmal liaseを細胞に加え、β-1,3-グルカン結合部位でグルコースポリマーを加水分解し、スフェロプラストを生成させます。ここから先は、溶血（ライシス）を避けるため、Sphero plastを等張液中で保持してください。細胞を30 °Cで15分間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。細胞壁の加水分解およびスフェロプラストの生成を確認するために、細胞10 µLを水990 µLと混合し、OD 600を測定します。スフェロプラストは浸透圧差により溶血することが期待されるため、OD 600はxmal liase添加前に測定した値の少なくとも10分の1以下になるはずです。そうならない場合は、xmal liaseを用いてさらに15分間インキュベートを継続してください。PlastのPHEを100 mLの回復培地で再懸濁し、Plast球体をHelen Meyer Flaskに移します。30 °Cで1時間、振盪しながらインキュベートします。XYs処理中に翻訳が停止し、mRNAの局在が乱れるため、この回復ステップが必要です。1時間後、0.1 mg/mLのシクロヘキシミジンを添加し、スフェロプラストをあらかじめ冷却した50 mLコニカルチューブに移します。シクロヘキシミジンの添加は、リボソームとmRNAの結合を固定するために重要です。これにより、リボソーム依存的なミトコンドリアへのmRNA結合が維持されます。遠心分離機を用い、4 °Cで3000 ×gで5分間、プラス球体を遠心分離します。上清を捨て、冷マンニトール緩衝液で2回洗浄します。4 mLの冷マンニトール緩衝液でプラズ球を懸濁し、その懸濁液を密閉性の高いペッスルを備えた容量15 mLのダウンホモジナイザーに移します。15回穏やかにストロークしてプラズ球を破砕し、溶出液を13 mLチューブに移します。溶出液を4°Cで1,500 ×gにて6分間遠心分離します。核と未破砕細胞をペレットにするためです。上清を慎重に新しいチューブに回収します。サンプルの1 mLまたは25%を、分画前または全細胞サンプルとして取り分けておきます。このサンプルの 50 µL を新しいチューブに移し、15 µL の 4 XLSB を加えます。ウェスタンブロット解析に備え、サンプルの残量からは、ノーザン解析およびマイクロアレイ解析用の RNA を沈殿させます。上清を 10,000 ×g で遠心分離します。4°Cで10分間、遠心分離を行います。ミトコンドリアをペレット化するため、上清を新しいチューブに移し、氷上で保持します。これが細胞質画分となります。このサンプルの50 µLを新しいチューブに移し、15 µLのfour XLSBを加えます。ウェスタンブロット解析用に、細胞質サンプルの残りの部分は、ノーザン解析およびマイクロアレイ解析のためにRNAを沈殿させます。ペレットを3 mLのマンニトール緩衝液で洗浄し、再び10,000 ×gで遠心分離します。4 °Cで10分間、重力による沈殿を行います。その後、3 mLのマンニトール緩衝液でペレットを再懸濁します。このサンプルにはミトコンドリアが含まれており、ミトコンドリア画分と呼ばれます。このサンプル50 µLを新しいチューブに移し、ウェスタンブロット解析用にfour XLSBを15 µL加えます。この手順を開始するには、各サンプルに8 M guanidinium HClを1量、100% ethanolを2量加え、ボルテックス後、-20 °Cで少なくとも2時間インキュベートします。サンプルを4 °Cで10,000 ×g、20分間遠心分離します。上清を捨てます。ペレットが剥がれやすいため注意してください。70%エタノールでペレットを洗浄した後、400 µLのRNaseフリー水でペレットを懸濁し、サンプルを新しいエ平型チューブ（Eppendorfチューブ）に移します。0.1容量の3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）と2容量の100%エタノールを加え、再びRNAを沈殿させる。ボルテックスして、-20 °Cで少なくとも2時間インキュベートする。サンプルを4 °C、20,000 ×gで20分間遠心分離する。上清を捨て、70% ethanolで洗浄します。ペレットを風乾させ、RNase free waterで再懸濁し、RNAサンプルを-80 °Cで保存します。その後、サンプルをノーザンブロット解析またはマイクロアレイ解析に使用することができます。マイクロアレイ解析用にRNAを調製するには、まず、グアニジンHClおよびエタノール沈殿によって得られた各mRNAペレットを650 µLのRNaseフリー水で再懸濁し、スクリューキャップ付き遠心チューブに移します。次に、650 µLの酸性フェノール・クロロホルムを加え、激しくボルテックスした後、最大速度で2分間遠心分離します。上層の水相 500 µL を新しいチューブに回収します。DNAが含まれているため、界面を吸い込まないように注意してください。また、逆転写反応を阻害する可能性があるため、フェノールが混入しないよう十分注意してください。塩化リチウム沈殿法を用いて、RNAサンプルからヘパリンを除去します。塩化リチウムを最終濃度 2 M になるように加え、サンプルを -20 °C で一晩インキュベートします。翌日、サンプルを 4 °C で融解し、20,000 ×g で遠心分離します。4 °Cで20分間、重力沈殿させます。上清を慎重に除き、ペレットを80%エタノールで洗浄して遠心分離します。再度上清を除いて風乾させ、150 µLのRNaseフリー水にペレットを再懸濁します。残留した塩化リチウム沈殿を除去するため、0.1容量の3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.3）と3容量の100%エタノールを加え、-20 °Cで少なくとも2時間インキュベートします。4°Cで20分間、最高速度で遠心分離します。透明なペレットを80% ethanolで慎重に洗浄し、風乾させます。最後に、ペレットを25 µLのRNase free waterで再懸濁し、サンプルを-80°Cで保存します。ミトコンドリア含有画分を細胞質成分から分離する本プロトコルの成功は、異なる単離ステップのサンプルに対してノーザン解析およびウェスタン解析を行うことで最適に検証できます。この例では、分画前（または全画分）、細胞質画分、およびミトコンドリア画分のサンプルを用いました。ノーザン解析は、mRNAであるCOBに対して行われました。これはミトコンドリア内で転写されるCO1 mRNAであり、ミトコンドリアに輸送されるタンパク質をコードしています。ACT1は細胞質アクチンタンパク質をコードするmRNAであり、SEC61は小胞体局在タンパク質をコードするmRNAです。下パネルはノーザンブロット膜のメチレンブルー染色であり、25 Sおよび18 Sの2つの顕著なRNAバンドが検出されています。COBはミトコンドリア内部で転写されるため、そのシグナルはミトコンドリアのみで検出されるはずです。本研究で観察された通りです。細胞質画分にCOBが現れた場合は、調製中にミトコンドリアの溶解が起こったことを示します。ACO oneはミトコンドリアに輸送されるタンパク質をコードしており、主にミトコンドリア画分に検出されます。一方、CT oneは細胞質タンパク質をコードしているため、主に細胞質画分に検出されます。ミトコンドリア画分にSEC 61が存在することは、この画分に小胞体成分が含まれていることを示しています。RNAのシグナルが両方の分画に現れていることから、リボソームの存在が示された。以下のタンパク質についてウェスタン分析を行った：ミトコンドリア外膜タンパク質であるPOR1、細胞質タンパク質であるHxa1、K1a、CUE1、およびERタンパク質およびリボソームタンパク質であるRPL39。予想通り、POR1のシグナルはミトコンドリア分画でのみ検出された。もし細胞質画分にPOR1シグナルが検出された場合、調製中にミトコンドリア成分が解離したことを示唆することになります。また、予想通り、hxK1は細胞質画分でのみ検出されました。ミトコンドリア画分における強いCUE1シグナルは、相当量の小胞体（ER）関連物質がミトコンドリア画分に共単離されていることを示しています。これは、小胞体（ER）とミトコンドリアの間に知られている物理的な接触の結果である可能性があります。RPL 39のシグナルが両方の分画に現れており、ここでも両分画にリボソームが存在することが確認されました。手順から回収ステップを除外すると、M分画からリボソームが消失し、これがミトコンドリアへのmRNAの結合に影響を及ぼします。ミトコンドリア成分と細胞質成分の分離品質を確認することに加えて、サンプル中のRNAまたはタンパク質が完全であること、およびサンプル調製中にRNAまたはタンパク質の深刻な喪失がないことを確認することが重要です。ここに示す解析において、無傷のRNAおよびタンパク質は個別のバンドとして検出されるはずです。ミトコンドリアに輸送されるタンパク質をコードするc CCPのmRNAにおいて、さらに短いバンドやスミアが出現した場合は分解を示しています。深刻な損失があれば、全量と相対的なシグナル量との間に顕著な差が生じますが、総合的に見てそのような現象は観察されませんでした。これらの結果は、本プロトコルがmRNA、リボソーム、およびタンパク質を単一の手順で単離するための有効な手法であることを検証するものです。この手順に続いて、RNA-Seqやプロテオーム解析などのゲノムワイドな手法を実施することで、オルガネラ機能の重要な特徴や特異的な特徴を特定することが可能です。このビデオを視聴することで、ミトコンドリアに関連するRNAを単離する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmRNA関連のアイソレーション

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