ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmRNA関連のアイソレーション

この手順の全体的な目的は、翻訳中のmRNAに関連するミトコンドリアを単離することです。まず、ミトコンドリアを濃縮させる条件下で培養した酵母細胞を回収します。次に、シクロヘキシミドの存在下で細胞を緩やかに溶解させます。

次に、分画遠心法によりミトコンドリアを可溶性成分から分離します。最終ステップは、ミトコンドリアおよびコントロール試料からRNAを抽出することです。最終的に、ノーザン分析を用いて、ミトコンドリア関連RNAの純度と品質を検証します。

この手法の主な利点は、1回の調製で多くの種類のRNAを単離できることです。したがって、比較解析が可能になります。この方法は、細胞内標的化やオルガネラの機能など、細胞生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

本手順では、非発酵性増殖培地にて30 °CでOD 600が1から1.5に達するまで培養した100から150 mLの酵母細胞からミトコンドリアを精製します。細胞を室温で3000 ×gで5分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを二回蒸留水で洗浄して、再度遠心分離します。

上清を捨てた後、細胞ペレットの重量を量ります。通常、100 millilitersの細胞から約0.6 gramsが得られます。細胞0.5 gramsにつき1 milliliterのDTT緩衝液を用いて、ペレットを再懸濁します。

細胞壁内のジスルフィド結合を切断し、加水分解効率を向上させるために、還元剤で細胞を処理することが重要です。細胞を30 °Cで10分間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。次に、室温で3000 ×gにて5分間、細胞を遠心分離します。上清を捨て、ペレットを再懸濁します。

細胞0.15 gに対してxmal liaseバッファー1 mLを加え、ボルテックスしないでください。細胞の10 µL分注液を990 µLの水に加え、OD 600を測定してその値を記録します。 freshly prepared xmal liaseを細胞に加え、β-1,3-グルカン結合部位でグルコースポリマーを加水分解し、スフェロプラストを生成させます。

ここから先は、溶血（ライシス）を避けるため、Sphero plastを等張液中で保持してください。細胞を30 °Cで15分間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。細胞壁の加水分解およびスフェロプラストの生成を確認するために、細胞10 µLを水990 µLと混合し、OD 600を測定します。スフェロプラストは浸透圧差により溶血することが期待されるため、OD 600はxmal liase添加前に測定した値の少なくとも10分の1以下になるはずです。そうならない場合は、xmal liaseを用いてさらに15分間インキュベートを継続してください。

PlastのPHEを100 mLの回復培地で再懸濁し、Plast球体をHelen Meyer Flaskに移します。30 °Cで1時間、振盪しながらインキュベートします。XYs処理中に翻訳が停止し、mRNAの局在が乱れるため、この回復ステップが必要です。

1時間後、0.1 mg/mLのシクロヘキシミジンを添加し、スフェロプラストをあらかじめ冷却した50 mLコニカルチューブに移します。シクロヘキシミジンの添加は、リボソームとmRNAの結合を固定するために重要です。これにより、リボソーム依存的なミトコンドリアへのmRNA結合が維持されます。

遠心分離機を用い、4 °Cで3000 ×gで5分間、プラス球体を遠心分離します。上清を捨て、冷マンニトール緩衝液で2回洗浄します。

4 mLの冷マンニトール緩衝液でプラズ球を懸濁し、その懸濁液を密閉性の高いペッスルを備えた容量15 mLのダウンホモジナイザーに移します。15回穏やかにストロークしてプラズ球を破砕し、溶出液を13 mLチューブに移します。溶出液を4°Cで1,500 ×gにて6分間遠心分離します。

核と未破砕細胞をペレットにするためです。上清を慎重に新しいチューブに回収します。サンプルの1 mLまたは25%を、分画前または全細胞サンプルとして取り分けておきます。

このサンプルの 50 µL を新しいチューブに移し、15 µL の 4 XLSB を加えます。ウェスタンブロット解析に備え、サンプルの残量からは、ノーザン解析およびマイクロアレイ解析用の RNA を沈殿させます。上清を 10,000 ×g で遠心分離します。

4°Cで10分間、遠心分離を行います。ミトコンドリアをペレット化するため、上清を新しいチューブに移し、氷上で保持します。これが細胞質画分となります。

このサンプルの50 µLを新しいチューブに移し、15 µLのfour XLSBを加えます。ウェスタンブロット解析用に、細胞質サンプルの残りの部分は、ノーザン解析およびマイクロアレイ解析のためにRNAを沈殿させます。ペレットを3 mLのマンニトール緩衝液で洗浄し、再び10,000 ×gで遠心分離します。

4 °Cで10分間、重力による沈殿を行います。その後、3 mLのマンニトール緩衝液でペレットを再懸濁します。このサンプルにはミトコンドリアが含まれており、ミトコンドリア画分と呼ばれます。

このサンプル50 µLを新しいチューブに移し、ウェスタンブロット解析用にfour XLSBを15 µL加えます。この手順を開始するには、各サンプルに8 M guanidinium HClを1量、100% ethanolを2量加え、ボルテックス後、-20 °Cで少なくとも2時間インキュベートします。サンプルを4 °Cで10,000 ×g、20分間遠心分離します。

上清を捨てます。ペレットが剥がれやすいため注意してください。70%エタノールでペレットを洗浄した後、400 µLのRNaseフリー水でペレットを懸濁し、サンプルを新しいエ平型チューブ（Eppendorfチューブ）に移します。

0.1容量の3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）と2容量の100%エタノールを加え、再びRNAを沈殿させる。ボルテックスして、-20 °Cで少なくとも2時間インキュベートする。サンプルを4 °C、20,000 ×gで20分間遠心分離する。

上清を捨て、70% ethanolで洗浄します。ペレットを風乾させ、RNase free waterで再懸濁し、RNAサンプルを-80 °Cで保存します。

その後、サンプルをノーザンブロット解析またはマイクロアレイ解析に使用することができます。マイクロアレイ解析用にRNAを調製するには、まず、グアニジンHClおよびエタノール沈殿によって得られた各mRNAペレットを650 µLのRNaseフリー水で再懸濁し、スクリューキャップ付き遠心チューブに移します。次に、650 µLの酸性フェノール・クロロホルムを加え、激しくボルテックスした後、最大速度で2分間遠心分離します。

上層の水相 500 µL を新しいチューブに回収します。DNAが含まれているため、界面を吸い込まないように注意してください。また、逆転写反応を阻害する可能性があるため、フェノールが混入しないよう十分注意してください。

塩化リチウム沈殿法を用いて、RNAサンプルからヘパリンを除去します。塩化リチウムを最終濃度 2 M になるように加え、サンプルを -20 °C で一晩インキュベートします。翌日、サンプルを 4 °C で融解し、20,000 ×g で遠心分離します。

4 °Cで20分間、重力沈殿させます。上清を慎重に除き、ペレットを80%エタノールで洗浄して遠心分離します。再度上清を除いて風乾させ、150 µLのRNaseフリー水にペレットを再懸濁します。残留した塩化リチウム沈殿を除去するため、0.1容量の3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.3）と3容量の100%エタノールを加え、-20 °Cで少なくとも2時間インキュベートします。

4°Cで20分間、最高速度で遠心分離します。透明なペレットを80% ethanolで慎重に洗浄し、風乾させます。最後に、ペレットを25 µLのRNase free waterで再懸濁し、サンプルを-80°Cで保存します。

ミトコンドリア含有画分を細胞質成分から分離する本プロトコルの成功は、異なる単離ステップのサンプルに対してノーザン解析およびウェスタン解析を行うことで最適に検証できます。この例では、分画前（または全画分）、細胞質画分、およびミトコンドリア画分のサンプルを用いました。ノーザン解析は、mRNAであるCOBに対して行われました。

これはミトコンドリア内で転写されるCO1 mRNAであり、ミトコンドリアに輸送されるタンパク質をコードしています。ACT1は細胞質アクチンタンパク質をコードするmRNAであり、SEC61は小胞体局在タンパク質をコードするmRNAです。下パネルはノーザンブロット膜のメチレンブルー染色であり、25 Sおよび18 Sの2つの顕著なRNAバンドが検出されています。

COBはミトコンドリア内部で転写されるため、そのシグナルはミトコンドリアのみで検出されるはずです。本研究で観察された通りです。細胞質画分にCOBが現れた場合は、調製中にミトコンドリアの溶解が起こったことを示します。

ACO oneはミトコンドリアに輸送されるタンパク質をコードしており、主にミトコンドリア画分に検出されます。一方、CT oneは細胞質タンパク質をコードしているため、主に細胞質画分に検出されます。ミトコンドリア画分にSEC 61が存在することは、この画分に小胞体成分が含まれていることを示しています。

RNAのシグナルが両方の分画に現れていることから、リボソームの存在が示された。以下のタンパク質についてウェスタン分析を行った：ミトコンドリア外膜タンパク質であるPOR1、細胞質タンパク質であるHxa1、K1a、CUE1、およびERタンパク質およびリボソームタンパク質であるRPL39。予想通り、POR1のシグナルはミトコンドリア分画でのみ検出された。

もし細胞質画分にPOR1シグナルが検出された場合、調製中にミトコンドリア成分が解離したことを示唆することになります。また、予想通り、hxK1は細胞質画分でのみ検出されました。ミトコンドリア画分における強いCUE1シグナルは、相当量の小胞体（ER）関連物質がミトコンドリア画分に共単離されていることを示しています。

これは、小胞体（ER）とミトコンドリアの間に知られている物理的な接触の結果である可能性があります。RPL 39のシグナルが両方の分画に現れており、ここでも両分画にリボソームが存在することが確認されました。手順から回収ステップを除外すると、M分画からリボソームが消失し、これがミトコンドリアへのmRNAの結合に影響を及ぼします。ミトコンドリア成分と細胞質成分の分離品質を確認することに加えて、サンプル中のRNAまたはタンパク質が完全であること、およびサンプル調製中にRNAまたはタンパク質の深刻な喪失がないことを確認することが重要です。

ここに示す解析において、無傷のRNAおよびタンパク質は個別のバンドとして検出されるはずです。ミトコンドリアに輸送されるタンパク質をコードするc CCPのmRNAにおいて、さらに短いバンドやスミアが出現した場合は分解を示しています。深刻な損失があれば、全量と相対的なシグナル量との間に顕著な差が生じますが、総合的に見てそのような現象は観察されませんでした。

これらの結果は、本プロトコルがmRNA、リボソーム、およびタンパク質を単一の手順で単離するための有効な手法であることを検証するものです。この手順に続いて、RNA-Seqやプロテオーム解析などのゲノムワイドな手法を実施することで、オルガネラ機能の重要な特徴や特異的な特徴を特定することが可能です。このビデオを視聴することで、ミトコンドリアに関連するRNAを単離する方法について十分に理解できるはずです。