Name: ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG 35〜55）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぶ実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘導法をC57BL/6マウスで行う方法。MOG 35-55ペプチドとCFAを用いた免疫化により、多発性硬化症の病態を模倣し、神経免疫学研究や創薬ターゲット探索に活用できます。

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この作品は、臨床研究のための学際センター（IZKF）ミュンスター（シード3月12日、SB）によってサポートされていました。

マウス実験のために1。一般的なコメント<ol><li>マウスを用いた実験はすべて、それぞれの制度的動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われるべきである。 </li><li>病原体を含まない条件下でマウスを維持し、食物および水を自由にアクセスできるようにすることを可能。注：疾患に対する感受性が、年齢や性別に応じて変動することができますので、それは実験群の年齢と性別をマッチさせたマウスを使用することが重要です。 </li><li> MOG 35-55ペプチドが抗原またはペプチドなしnonencephalitogenic PBSのいずれかにより置換される選択された実験条件に依存して、偽免疫化対照群と考えることができる。 </li><li> （下記参照）の前に、実験を開始する方法論的側面を考慮してください。我々は、EAEスコアリングのための1つまたは2つの盲目の観察者が関与することをお勧めします。 </li></ol> MOG 35〜55エマルションの2。準備<ol><li> MOの1:1の比率の200μLG 35〜55ペプチド溶液と、CFAは、各マウスに注入する必要があります。準備と注入しながら粘性エマルジョンの一部の損失がある。したがって、必要な量の1.5〜2倍を用意。 MOG 35〜55ペプチド溶液とCFAの両方の必要な金額の2によるエマルジ ​​ョン除算の総容量を計算します。 </li><li> 2 mg / mlの終濃度までのddH 2 O中で凍結乾燥したMOG 35-55を希釈する。私たちは通常、マウスあたり200μgのMOG 35〜55ペプチドを使用しています。この量は、ストック溶液100μlに含まれています。ペプチド溶液は-20℃で保存する必要があります</li><li>乳鉢に乾燥さ結核菌H37RA（100 mg）を1バイアルのコンテンツを配置。 <ol><li>薄い粉末を得、乳鉢と乳棒で粉砕した。 </li><li> 4℃で保存することができる10 mg / mlのCFAのストック溶液を得るために不完全フロイントアジュバントを10ml追加</li><li>予防接種の前に、CFAの原液ウィットを希釈2 mg / mlの最終濃度をH IFA。粒子状物質を再懸濁し、実験の準備中の粘性溶液の一部の体積損失を検討するために、各使用前に完全に混合する。 </li><li> 1ミリグラムの最終濃度個/ mlに達するまで、MOG 35-55ペプチド溶液と1:1で混合する。 注意：熱殺菌結核菌は、自然免疫応答を刺激する。吸入、経口摂取、皮膚や目への接触を避ける。 </li></ol></li><li>氷上で予冷ソリューションを提供しています。 <ol><li> 2 mg / mlのCFAおよび2 mg / mlの2 2ミリリットル注射器にMOG 35〜55の溶液の1ミリリットルの1ミリリットルを策定。免疫した動物の数に応じて必要な注射器の個数を計算する。 注意：厳密には肉芽腫を引き起こしたり、自己免疫反応を誘発する可能性があるアジュバントの準備中にステッチを避ける。 </li><li> MOG 35〜55溶液と、CFAのための20のGカニューレ27のGカニューレを使用してください。気泡を回避し、時に両方の注射器を接続HREEウェイバルブ。 </li><li>他に1シリンジからエマルジョンを送信し、優れた乳化は重要なステップであるように、少なくとも10分間完全に混合。乳化をサポートするために、3ウェイバルブを近閉じます。解決策は、相の分離なしに、白い硬い粘性である必要があります。 </li><li>エマルジョンは、免疫の前に数日間保存することができる。彼らは安定しているかどうかを観察するために乳剤を調製した後、少なくとも30分待ってください。予防接種の前に、2つのシリンジの1に溶液を描き、27 Gのカニューレを接続してください。 </li></ol></li></ol>百日咳毒素の3。準備<ol><li>百日咳毒素の異なる量は、投与経路（ 例えば、静脈内または腹腔内）に依存文献に見出すことができる。当研究室では、2日後に免疫の日に腹腔内に200μlのPBSで百日咳毒素400ngのを使用しています。注意：百日咳毒素は、多くの生物学的効果を持っている。吸入、経口摂取、皮膚や目への接触を避ける。 </li><li> 100μg/ mlの保存溶液を500μlののddH 2 Oに百日咳毒素50μgのを再構成。 4℃で保存する</li><li> PBSで1:50に希釈する。 200μlのは今のPBS 400 ngのが含まれています。注射器の必要量を用意し、それぞれの針ハブのための〜100μLの追加の過剰量を考慮してください。 </li></ol> 4。動物免疫<ol><li>必要な短期的な安楽死のための具体的な基準のための制度的動物管理使用委員会を参照してください。このようなケタミン/キシラジン注射またはhalothanなどの他のプロトコルも可能かもしれないが、我々の研究室では、イソフルランとの短い麻酔後を使用しています。麻酔を待って、麻酔のレベルを評価するために前足つま先のピンチを使用しています。 </li><li>予防接種は、動物のためのストレスを最小限に抑えるために、最適な予防接種を確実にするために経験のある方が行っていることを確認してください。 </li><li>抗100μlのを注入各後側腹部に2つの異なるサイトにGEN / CFAエマルジョン皮下。皮膚の下の球根質量フォームは実験を通して持続するべきであることを確認してください。 </li><li> intraperitonelly百日咳毒素の200μLを注入。 </li><li>個々のマウスは簡単にテールベースにカラーマーキングするなど 、日々の評価のために識別することができることを確認します。 </li><li>免疫後2日目の百日咳毒素の第二の用量を投与する。 </li></ol> 5。EAEの監視<ol><li>体重および臨床スコアが毎日評価する必要があります。 EAEの発症は、典型的には、疾患活動性の指標として使用することができる体重減少と相関する。制度上の動物の世話を参照して、個々のマウスは実験から取り出さなければならない場合の基準を事前に定義するための委員会を使用してください。体重減少が20初期体重の％以上際に重篤な臨床徴候は（EAE 7または悪化スコア）を超える場合に発生するときに考慮すべきである。再を参照してください許可された最大のスコアのためのそれぞれの制度的動物管理使用委員会のspectiveガイドライン。 </li><li>マウスがEAEの臨床症状を有する場合には、水ボトルがまだ到達することができ、その食品がケージの床に載置されることを保証することが重要である。 </li><li>別のスコアリングの症状を使用することができる。私たちの研究室では、0〜10のスケールが設定される。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> グレード </td><td> 臨床症状 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 0 </td><td>臨床徴候ん</td><td>マウスは尾の基部に保持されていれば定常歩容、尾部が移動して上げることができ、尾部は丸い物体を包み込む</td></tr><tr><td> 1 </td><td>部分的にぐったりテール</td><td>通常の歩行、尾の先端が垂下</td></tr><tr><td> 2 </td><td>麻痺テール</td><td>通常の歩行、尾の垂下</td></tr><tr><td> 3 </td><td>後肢の麻痺、非協調運動</TD&gt; <td>まとまりのない歩行、尾がリンプ、後肢をつまんへの対応</td></tr><tr><td> 4 </td><td>一つの後肢が麻痺</td><td> 1後肢のドラッグと非協調歩行、尾がリンプ、1後肢ピンチに応答しません</td></tr><tr><td> 5 </td><td>両方の後肢が麻痺し</td><td>ドラッグ両方の後肢に非協調歩行、尾がリンプ、両方の後肢のピンチに応答しません。 </td></tr><tr><td> 6 </td><td>後肢が麻痺し、前肢の弱点</td><td>前肢と非協調歩行をつまん後に身体、前肢反射を引くのに苦労し、尾はリンプ</td></tr><tr><td> 7 </td><td>後肢は1前肢が麻痺し、麻痺し</td><td>マウスは尾がリンプ、1前肢がつま先のピンチに応答し、移動することはできません</td></tr><tr><td> 8 </td><td>後肢の両方前肢が麻痺し、麻痺し</td><td>マウスは尾がリンプ、両方の前肢はつま先のピンチに反応しない、移動することはできません</td></tr><tr><td> 9 </td&gt; <td>瀕死の</td><td>動かない、変更された呼吸</td></tr><tr><td> 10 </td><td>死</td><td></td></tr></tbody></table>表1。臨床スコアリングシステム。

<ol><li>McFarland, H. F., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+a+complicated+picture+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity.</a> Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).</li>
<li>Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+world+is+not+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the world is not enough.</a> Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).</li>
<li>vander Star, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo models of multiple sclerosis.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).</li>
<li>Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of multiple sclerosis.</a> Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).</li>
<li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TASK1+channel+inhibitor+A293+shows+efficacy+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).</li>
<li>Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men%3A+experimental+autoimmune+encephalitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis.</a> Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).</li>
<li>Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAE%3A+an+immunologist%27s+magic+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">EAE: an immunologist's magic eye.</a> Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).</li>
<li>Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pertussis+toxin+modulates+the+immune+response+to+neuroantigens+injected+in+incomplete+Freund%27s+adjuvant%3A+induction+of+Th1+cells+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+presence+of+high+frequencies+of+Th2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells.</a> J. Immunol. 169, 117-125 (2002).</li>
</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

能動免疫プロトコルと異なるEAEモデルの多数は、過去数十年にわたって説明してきた。ラットモデルが広く、最近まで使用されてきたが、マウスは現在、EAE研究のための最も人気のあるモデル生物である。この開発は、利用可能なトランスジェニックマウスの広範かつ増え続けるレパートリーにとりわけある。 MOG 35-55ペプチドを用いたC57BL / 6マウスの免疫化は、最も広く分布EAEモデルの一つであり、信頼性の高い複製可能かつ十分に使い動物モデルとして考えることができる。他のEAEモデルは、より具体的な実験の質問のために使用されているが、多くの神経免疫学研究室では、MOG 35〜55誘発性EAEは、選択したモデルとして確立されている。 考慮すべき重要な点は、EAE実験は方法論的に正しいが行われていることを確認するための実験設定を計画しています。内部妥当性については、疾患症状の盲目採点を強くお勧めします。 Experimentalグループがあるべき年齢に、体重、および性別をマッチさせたマウスを無作為に処置群に割り当てる必要があります。実験は、常に動物福祉の規制を遵守して実施されるべきである。 EAEの研究は、多くの場合、パワー不足であると考慮した統計タイプIIのエラーを取るこ​​とはありません。したがって、実験前に、サンプルサイズの計算は行われるべきである。必要なグループサイズは、予想される効果の大きさに依存します。統計分析のための専門家の相談は、EAE実験を開始する前に考慮されるかもしれません。 プロトコルのいくつかの制限を念頭に置いておく必要がある。最も重要なことは、aEAEデータの解釈は、アジュバントおよび免疫学的反応の両方に付加的な影響を有する百日咳毒素を用いて免疫化モードによって損なわれる。また、MOG 35-55 EAEモデルは、CD4 + T細胞は免疫応答を駆動し、主に示すことを考慮すべきである。 CD8 + T細胞およびB細胞がプレーこれらの細胞型に対処する際にあまり顕著な役割や代替プロトコルが考慮されるべきである。予想される疾患経過は、急性単相および自己限定です。あるいは、再発寛解型疾​​患経過は、また別のEAEモデルにおいて達成することができる。プロトコルの追加の重要な制限は、MSの病態生理の免疫学的構成要素に向けて一定のバイアスである。最後の年の間に、MSは、強力な神経変性成分を有していることが次第に明らかになってきた。オリゴデンドロサイトとニューロンの死は神経障害の進行性の蓄積になる。これは、EAEモデルは、自己免疫性炎症の神経変性メカニズムに関する実験質問への回答が、完全に適していないかもしれないことを考慮に入れなければならない。中枢神経系の病理学を中心とした代替動物モデルが考えられるかもしれない-末梢免疫系の関与なしに有毒な脱髄を損なうキュプリゾンモデルEG。 記載されたプロトコルは、基本的な神経免疫実験モデルとして考えること及び他の用途のために修飾することができる。上述の実験手順を容易に、例えば 、治療を評価するために特に適している再発寛解型EAEの疾患経過のためのPLP 139-151ペプチドおよびSJLマウスを使用して（タンパク質のマウス系統または種類および量を変えることによって、他のEAEプロトコルに適用することができる再発への影響）。記載されたプロトコルはまた、養子移入実験（パッシブEAE）のために使用することができる。上述したように、このモデルでは、C57BL / 6マウスを、MOG 35-55ペプチドおよびCFAで免疫化する。対照的に、百日咳毒素は不要である。 7-15日後、脾臓またはリンパ節を単離し、免疫細胞を、MOG 35-55ペプチドおよびC57BL/6seマウスの新しいグループに移す前に、種々のサイトカインを用いてインビトロで再刺激されている。これらのレシピエントマウスは、数日前にCLAS時よりもEAEを開発sical予防接種。 インビトロ条件下で特異的な免疫学的な質問のために変化させることができる（ 例えば 、偏光T H 1またはT H 17細胞へ）。 時々、低い疾病の発生または弱い症状が実験的挑戦であるかもしれません。トラブルシューティングのためのいくつかの推奨事項は次のとおりです。 - 疾患の重症度は、ペプチド/マウスの異なる量を変化させることができる。 - 最適なCFAの濃度は1〜5 mg / mlのとは異なる場合があります。実験を確立するときに、CFAの滴定を考えてみましょう。できるだけ多くの規制は2 mg / mlのを超えて、CFAの濃度を禁止許可CFA濃度について、それぞれの施設内動物のケアと使用委員会のそれぞれのガイドラインを参照してください。 - 種々の方法は、エマルジョンを調製するために記載されている。貧しい乳化possibとして考えた場合、例えば、1時間または超音波処理のためのボルテックスのような別の方法が考えられるかもしれないル·エラーソース。 - 年齢、性別、年の季節や動物施設内の環境条件は、EAE感受性に影響を与える重要な要因である。これは、条件が独立した実験間で同等であることを確実にすべきである。 上述したように、上記プロトコルは、養子EAE実験のための出発点として使用することができる。このモデルは、（野生型レシピエントマウスに脳炎ノックアウト細胞を転送することによって）、遺伝的表現型の末梢およびCNS効果を分離するための転写および細胞の表現型などの特定の免疫学的な質問のために特に適している十分に特徴づけることができる。最後の年の間に、EAE研究の最新の開発は、T細胞受容体トランスジェニックマウスである。これらのマウスは、アジュバント接種の問題を回避し、外部の影響を受けることなく自然にEAE症状を開発しています。しかし、このモデルはbreediのために動物を大量に必要とする十分なグループサイズを確保することngの。ノックアウトマウスの評価は前aEAEとは対照的に、EAE実験に交配を必要とします。各マウスが別の日に病気の症状が発展するにつれ、新規物質の評価はかなり複雑になる可能性があります。そのため、神経免疫ための古典aEAEの値は比類のないままになります。

多発性硬化症（MS）は、中枢神経系の慢性脱髄性炎症性疾患であることを特徴とする異種および蓄積臨床症状におけるオリゴデンドロサイトおよびニューロンの破壊をもたらす。 MSは、中枢神経系（CNS）の原型の自己免疫疾患と考えられている動物モデルは、その複雑な病因を解明するために開発されている。さらに、現在の治療は、部分的にしか有効であり、神経変性成分が、おそらく将来の治療的アプローチ1,2の大きな課題である間、主に疾患の炎症期を対象としています。 疾患の正確な病因は未だ不明であるが、CNSにおける軸索のミエリン鞘上のエピトープに対する自己免疫反応は、疾患の発症を誘発すると想定されます。免疫系の遺伝的脆弱性と環境要因（ 例えば感染症、ビタミンD）の調節不全があると考えられているMSの病態生理学的メカニズムの中心的な側面に影響を与える。 動物モデルの3つの異なるタイプが現在、MSの病理学的なパターンの探索のために確立されています。タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）のようなウイルスのモデル、クプリゾンのような有毒物質により誘発されたモデル、および実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）3の最後に異なる変形、 4。彼らはすべてのMSの機能を模倣するが、彼らは適応免疫系の関与のような基本的な病理学的特徴で途方も異なっている。それは神経炎症経路を調査するために特に有効であり、多くの場合、新たな治療戦略の5,6の有効性のための「証拠の原則」のモデルとして役立つように、EAEは、最も一般的な動物モデルである。 EAEは、多くの異なる動物（ 例えばマウス、ラット、ミニブタ、モルモット、ニワトリ、又は霊長類）において誘導することができる。しかし、マウスは、少なくとも部分的に起因する最も広く使用の種となっている洗練されたトランスジェニックやノックアウトマウス7のレパートリーを拡大する。 EAEの病態生理は、脳特異的抗原に対する免疫系の反応に基づいている。この反応は、MS患者において観察されるものと同等の神経学的および病理学的特徴で、その結果、構造体を担持する抗原の炎症および破壊を誘導する。 3つの異なるアプローチに区別することができます。積極的に誘導されるEAE（aEAE;能動免疫）、受動的にEAE（pEAE、免疫動物から脳炎誘発細胞の転写）自己免疫の研究を可能にする、より最近では、自発的なEAEマウスモデル（SEAE）外因性の操作をすることなくメカニズム。最も簡単な誘導可能なモデルは、高速かつ堅牢な結果に得たマウスでaEAEです。このモデルは、フィールド8での多くの研究者によって神経免疫動物モデルの「ゴールドスタンダード」として考えられている。 aEAE誘導のため、動物予防接種の日に百日咳毒素を腹腔内投与に伴う選ばれた抗原および完全フロイントアジュバント（CFA）からなるエマルジョンの皮下注射で免疫し、2日後にされている。その結果、ミエリン特異的Tリンパ球は末梢で活性化され、血液脳関門を横切ってCNS内に移動される。 CNSに入ると、T細胞は、後続の炎症カスケード、単球またはマクロファージ、最終的には、脱髄および軸索細胞死9のような他の細胞の関与が生じる局所浸潤性および抗原提示細胞によって再活性化される。免疫化プロトコールおよびマウス系統との組み合わせに応じて（ 例えば、C57BL / 6、SJL / J、Biozzi）および抗原（ 例えば、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（PLP））、疾患コー​​スは、急性、慢性進行性または再発寛解型疾​​患経過を取ることができます。 35〜55ペプチド10、病気の最大値を有するC57BL / 6マウスの免疫のためのプロトコルを記述次の10から20日間の。単独MOG 35-55ペプチドの免疫原性は、疾患を誘発するのに十分でないように、このようなCFAなどのアジュバントが必要である。これは、CFAの成分は、これらの分子の食作用およびサイトカインの分泌を誘導する単核食細胞を活性化することが想定される。これは抗原の存在およびリンパ系へのこれらのより効率的な輸送の延長をもたらす。 EAE誘導は、特に調節することが示唆されている百日咳毒素（PT）の適用によって促進される血液脳関門および免疫学的応答性自体は11。疾患誘導した後、特別なケアは、病気の症状のためのマウスの日々の評価のために注意する必要があります。

<table><tbody><tr><td>雌のC57BL/6マウス、生後10-12週、~20 g 重量</td><td>e.g. Jackson Laboratory, Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)</td><td>e.g. Pepceuticals Ltd</td><td></td><td>-20 &deg;C</td></tr><tr><td>不完全なフロイント'アジュバント(IFA)</td><td>e.g. Sigma-Aldrich Co.</td><td>F5506</td><td>4°Cで保管。C</td></tr><tr><td>シリンジ、1 ml、針に26 G 3/8入り&nbsp;</td><td>例えば ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー</td><td></td><td></td>309625</tr><tr><td>シリンジ、2 ml</td><td>e.g. B. Braun</td><td>7389</td><td></td></tr><tr><td>ニードル、25 G 5/8 インチおよび 30 G 1/2 インチ&nbsp;</td><td>e.g. Becton Dickinson & Co.,</td><td>305122, 305106</td><td></td></tr><tr><td>三方弁</td><td>e.g. B. Braun</td><td>16494 C</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素、緩衝液中で凍結乾燥</td><td>Enzo Life Sciences Inc.</td><td>BML-G100</td><td>4°Cで保管。C</td></tr><tr><td>M. tuberculosis H37 RA</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>4 °で保存;ハ</td></tr></tbody></table>

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（mog<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）c57bl / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（eae）誘発

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

多発性硬化症は強力な神経変性成分を有する中枢神経系の慢性神経炎症性脱髄疾患である。この疾患の正確な病因はまだ不明であるが、自己反応性Tリンパ球は、その病態生理学において中心的な役割を果たしていると考えられている。 MSの治療は、これまで部分的にしか有効であり、研究努力は、病気の病態生理に関する我々の知識を拡大し、新たな治療戦略の開発を続けています。実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、MSが、多くの臨床的および病態生理学的な機能を共有するための最も一般的な動物モデルである。人間、MSの異なる、臨床免疫学的および組織学的な側面を反映して、EAEモデルの幅広い多様性があります。マウスでは、積極的に誘導されるEAEは、堅牢で複製可能な結果を​​最も簡単な誘導可能なモデルです。それは、自己免疫neuroiによって挑戦トラ​​ンスジェニックマウスを用いて、薬物の又は特定の遺伝子の影響を調査するために特に適しているnflammation。したがって、マウスは、CNSホモジネートもしくはミエリンタンパク質のペプチドで免疫化する。によるこれらのペプチドの低免疫原性のために、強力なアジュバントが使用される。 EAE感受性と表現型は、選択された抗原および齧歯類株に依存します。 C57BL / 6マウスは、トランスジェニックマウスの構築のための一般的に使用される菌株であり、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）に特に反応する。免疫原性エピトープのMOG 35〜55は、免疫前および百日咳毒素に完全フロイントアジュバント（CFA）に懸濁されている予防接種の日に適用され、2日後にされている。マウスは、免疫後9月14日日以内に弛緩性麻痺の昇順で &quot;古典的な&quot;自己限定単相性EAEを開発しています。マウスを、25〜50日間の臨床スコアリングシステムを用いて毎日評価する。 EAEを有する動物だけでなく、このモデルの潜在的なアプリケーションと限界のケア取るための特別な考慮が議論されている。

免疫化後、マウス体重の変化および臨床症状について毎日評価されなければならない。疾患の発症は、通常、EAE症状が表示されている1〜2日前に開始可能性があり軽量化と相関している。 EAEの臨床症状は通常、一日9と14免疫後の間で始まる。病変は、主にC57BL / 6マウスにおけるMOG-EAEにおける脊髄に局在化されると、それらは、典型的には、吻側尾側のパターンで主に運動の症状を発症する。 EAE症状（スコア6）で免疫したマウスの代表的な画像が図1Aに示されている。いくつかの非定型EAE症状はまた、 表1に示した古典のEAEスコアの中に反映されていない軸回転可能に転がり、猫背の外観や過敏症などの発生する可能性がある。運動症状がこのモデルの主な特徴であるように、このスコアは私たちを与えるん疾患の重症度を示す目安。異なる監視システム（ 例えばスコア0 -別の赤字を評価する5または0-6）、より複雑な複合スコアも発表されている。それぞれの制度的動物管理使用委員会によると、実験から取り出されなければならない重篤な症状で、そのマウスに注意してください。マウスは、次の10〜20日以上の症状の一般部分的な回復を示しています。代表的な疾患経過は、 図1Bに示されている。結果パラメータを評価するために重要であるEAEの間の異なる時点がある。頻繁に見つけることができるいくつかの典型的なアッセイは、非常に簡単に説明する。疾患最大で、マウスは、in vitroでの MOG 35-55ペプチド（MOGリコールアッセイ）を用いて単離された免疫細胞の再刺激後のサイトカイン産生または増殖を評価することができる。免疫細胞はまた、EAEの症状を有するマウスからの脳及び脊髄から単離され、さらに処 ​​理され、フローサイトメトリーにより、例えばすることができる。脊髄切片の組織学的分析は、疾患mで行うことができる病変の負荷と脱髄のためaximum、後で神経変性および神経細胞死のためのマーカーを指している間は、対象となる可能性があります。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1.jpg" width="600px" /> 図1。代表EAE結果。 30日間の免疫後のEAE症状を免疫したC57BL / 6マウスのA.代表画像（EAEが6得点）。B.代表の疾患経過。データは、平均値と平均値の標準誤差として示されている（N = 5）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド35-55（MOG 35-55）で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

本手順の全体的な目的は、多発性硬化症の臨床的および病態生理学的特徴を模倣した実験的自己免疫性脳脊髄炎の動物モデルを誘導することである。まず、抗原、アジュバント、および百日咳毒素を調製する。次に、抗原とCFAのエマルションを皮下注射し、百日咳毒素を腹腔内注射する。2日後、マウスに百日咳毒素を再び腹腔内投与します。その後、動物の体重を測定し、臨床スコアを毎日評価します。最終的に、免疫から9日から14日の間に、通常、実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床徴候が観察されます。rizoneなどの毒性物質や、EIEの異なる変異体を用いる既存のプロトコルに対する本手法の主な利点は、既存の手法はいずれもMSの特徴を模倣しているものの、獲得免疫系の関与など、根底にある病理学的特徴が大幅に異なる点にあります。一般的に、この手法に不慣れな者は、免疫処置のハンドリングが困難であるため苦労することになります。動物へのストレスを軽減し、処置後の最適な免疫誘導を確実にすることが不可欠です。このモデルは、神経免疫学分野の研究者がノックアウト動物の特性を解析する道を切り開きました。新たな分子標的の同定や、有望な候補薬の試験を行うため、ペプチド溶液を調製します。まず、凍結乾燥したMOG 35-55ペプチドを二回蒸留水で希釈し、最終濃度を2 mg/mLにします。マウス1匹あたり100 µLの溶液が必要であり、調製中に一部が損失することを考慮してください。したがって、必要量の1.5倍から2倍の溶液を調製してください。ペプチド溶液は-20°Cで保存します。完全フロイントアジュバント（CFA）を作製するには、乾燥させたmycobacterium tuberculosis H37Raを100 mg乳鉢に入れ、乳棒で研磨して微粉末にします。次に、不完全フロイントアジュバント（IFA）を10 mL加え、10 mg/mLのCFAストック溶液を作成します。CFAストックは、免疫当日に使用するまで4 °Cで保存可能です。CFAストック溶液を不完全フロイントアジュバントで希釈して最終濃度を2 mg/mLにし、粒子状の物質を再懸濁させるために十分に混合した後、氷上に置きます。MOG 35 to 55ペプチド溶液のアリコートを解凍後、氷上に置きます。2 mLシリンジと27ゲージのカニューレを用いて、CFAを1 mL吸引します。次に、2 mLのシリンジ（2本目のもの）と20Gのカニューレを使用して、MOG 35〜55溶液を1 mL採取します。気泡を除去し、3方活栓で両方のシリンジを接続します。3方活栓をほぼ閉じた状態で、エマルションを一方のシリンジからもう一方へ、そしてまた戻すという操作を繰り返し、少なくとも10分間十分に混合します。完了後、溶液は白く硬い粘性状となり、相分離が起きていないはずです。ここで、免疫前の乳化液を少なくとも30分から数日間静置させます。使用前に、乳化状態が維持されていることを確認してください。免疫当日に、溶液を2本のシリンジのうちの1本に吸い取り、27ゲージのカニューレを接続します。50 µgの百日咳毒素を500 µLの二回蒸留水で再構成します。100 µg/mLのストック溶液とするため、使用時までストック溶液を4 °Cで保存してください。免疫日の当日、百日咳毒素ストック溶液を1:50に希釈します。PBSを用いて、百日咳毒素 400 ngを含む希釈百日咳溶液 200 µLを注入用のシリンジに準備し、さらに針のハブの死腔分として 100 µLを追加で吸い上げます。イソフルランでマウスを麻酔した後、足指をつまんで麻酔深度を確認します。抗原CFAエマルジョン 100 µLを、各後肢の側腹部の2か所に皮下注射します。注入後、皮膚の下に球状の塊が形成され、それが実験期間を通じて維持される必要があります。次に、200 µLの百日咳毒素を含む調製済みシリンジを腹腔内に注入します。日々の評価のために、個々のマウスを容易に識別できるようにしてください。例えば、尾の付け根への色付けによって行います。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

特定のマウス系統では、ミエリン塩基性タンパク質で実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の誘導に抵抗することができます。ここで説明するには、無反応を逆にし、いくつかの典型的なEAE耐性マウスの汚れに麻痺性疾患を引き起こす単純な予防接種プロトコルです。...

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

このビデオは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質と不活性化結核菌の組み合わせを注入することにより、マウスモデルで実験的な自己免疫性脳脊髄炎を誘発する方法を示しています。このモデルにより、研究者は疾患のメカニズムを研究し、治療的介入をテストすることができます。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このビデオは、ミエリン由来のペプチドにアジュバントを注入して自己反応性T細胞を活性化し、脳に移動することにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発する方法を示しています。百日咳毒素は、血液脳関門の透過性を高めるために投与され、これらのT細胞や他の免疫細胞が脳に入ることを可能にします。これらの免疫細胞は脱髄を引き起こし、神経伝達の障害とEAEの発症につながります。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の生成

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。...

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

私たちは、マウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を含む融合タンパク質を大量に生成し精製するための基本的な実験装置のみを使用した簡単なプロトコルを記述します。このタンパク質は、T細胞とB細胞の両方によって引き起こされる実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために使用できます。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのシンプルで効率的な生産とマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の精製

矢状面における歩行の運動学的分析には、運動の実行方法に関する非常に正確な情報が得られます。マウスの自己免疫を介した脱髄を受けるため歩行障害を識別するためにこれらの技術の応用について述べる。これらのメソッドは、障害者の歩行の特徴他のマウス...

MOG35 55 を受ける c57bl/6 マウスの矢状面運動歩行解析による実験的自己免疫性脳脊髄炎

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症の最も広く使用されているマウスモデルの1つです。現在のプロトコルでは、雌雄のC57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドを免疫し、主に尾と四肢の上行麻痺を引き起こします。ここでは、EAEの誘導と評価のプロトコルについて説明します。...

両性における多発性硬化症のモデル化:MOG35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の動物モデルであり、ヒトの疾患と強力な体液性自己免疫応答を共有しています。ここでは、EAE免疫マウスの血清中の自己抗体を定量するためのシンプルで柔軟なELISAプロトコルを報告します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するマウスにおける自己反応性抗体の定量化

学ぶ実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘導法をC57BL/6マウスで行う方法。MOG 35-55ペプチドとCFAを用いた免疫化により、多発性硬化症の病態を模倣し、神経免疫学研究や創薬ターゲット探索に活用できます。

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG

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