Name: 迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 学ぶ PhenoRipperプラットフォームを用いた蛍光顕微鏡画像の迅速解析法。細胞シード、自動撮影、ブロック型識別により表現型プロファイルを生成し、クラスターグラムで複雑な表現型の比較を可能にする。

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私たちは、アダム·コスターで親切なフィードバックや議論のためのAltschulerと呉ラボの他のすべてのメンバーに感謝。この研究は、米国国立衛生研究所によってサポートされていましたR01 GM085442とCA133253（SJA）、R01 GM081549（LFW）、CPRIT RP10900（LFW）、およびウェルチ財団、I-1619（SJA）とI-1644（LFW）を付与します。

1。準備サンプルとイメージング<ol><li>細胞培養<ol><li>日常の文化を分割し、20から70までパーセントコンフルエンスで維持する。実験前に、ある日、（材料の表を参照して、ダルベッコ改変イーグル培地）、DMEMでHeLa細胞を成長させ、10％FBS（ウシ胎児血清）および1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。 </li><li>実験の日に、分割細胞は、培養（約50％コンフルエント）に成長している。 </li><li>数秒間トリプシン/ EDTA（エチレンジアミン四酢酸）の約2ミリリットルに公開、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄。過剰トリプシン/ EDTAを吸引し、約3分間RTでフード内トリプシン/ EDTAの薄膜を浴びた細胞を維持する。 </li><li>機械的に二度振盪フラスコ、血清添加培地で細胞を剥離。細胞を計数し、メディアの5000 cells/50μlに希釈し、すぐにうまく自動液体処理ロボット（唯一の30を使用して384ウェルガラスボトムプレートに50μL/ウェルプレートプレートのS）は、ここで使用されている。 </li><li>ウェル5内のエッジ効果を最小にするために室温で30分間プレートをインキュベートする。一晩37℃/ 5％CO 2インキュベーター中でRTインキュベーション、場所プレートた。 </li><li>各薬剤は、二重にアッセイする。プレートは、既にメディアを含む上の対応するウェルへの薬物の25を添加する。 </li><li> 24時間後の薬物治療におけるPBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液でプレートを固定する。 </li></ol></li><li>染色 ここで使用された具体的な一次抗体、蛍光標識二次抗体および他の蛍光汚れ、材料の表に示します。 <ol><li>透過処理3分間TBS中の0.2％トリトンX-100溶液（トリス緩衝食塩水）で細胞を固定し、TBST（トリス緩衝食塩水+ Tween 20）で3回洗浄した。ブロッキングのためTBST中5％BSA（ウシ血清アルブミン）溶液を加える。 </li><li>室温で2時間プレートをインキュベートし、その後、TBSTで3回洗浄する。 </li><li>一次抗体dilutを作るTBST中の5％BSA中のイオン（材料の表を参照）、/ウェル10μlを加える。室温で2時間プレートをインキュベートした後、TBSTで3回洗う。 </li><li> TBST中二次抗体dilutionin 5％BSAを作る（材料の表を参照）、/ウェル10μlを加える。 </li><li>室温で2時間暗所に静置し、その後、TBSTで二回洗う。 </li><li> PBSに（材料の表を参照）ヘキストおよびファロイジンのための希釈液を調製し、同様に10μL/を追加します。 </li><li> RTで30分間、暗所でプレートをインキュベートする。 </li><li>後の2 TBST洗浄、4℃のCO / Nの箔とストア内のカバープレート</li></ol></li><li>イメージング 1x1のカメラのビニングで20X対物レンズを用いた落射蛍光顕微鏡を用いて画像を取得する。 480イメージ（X3チャンネル）の合計、各ウェルのための16の画像を取得。 </li></ol> 2。画像を分析するダウンロードしphenoripper.orgからPhenoRipperをインストールし、IMAの分析を開始しPhenoRipperを起動GES。 PhenoRipperは現在、TIFF、PNG、およびJPEGとMATLABでサポートされているすべての他のフォーマットを（顕微鏡のソフトウェアは、通常のTIFFにエクスポートをサポート）をサポートしています。 2.1データのロード<ol><li>標準的な名前付け/組織規則は、ローディングイメージと関連付けるメタデータにすることができる顕微鏡画像、存在しない（このような治療のタイプなどすなわち実験注釈を、よく数など）のワークフローの中で最も困難な部分。提示された方法（後述）のいずれかを選択します。 <ol><li> PhenoLoader：必要に応じてファイル名および/ ​​またはディレクトリ構造（ 例えば 、B16 HeLa_Drug5-DAPI.pngイメージがよく、B16からのものであることを示している可能性があり、グループのイメージに十分な情報が含まれている場合に、データをロードし、半自動的に、このオプションを選択し、細胞を処理し、この命名規則と、うまくA1または薬物5で処理されたからすべての画像を簡単にグループ化することができる） - IDが5であり、画像は、核のDAPI染色を捕獲薬剤と。ウィザードの意志画像群とメタデータを関連付けると、次のようにマーカーを定義するためのステップバイUserステップをガイド。 <ol><li> PhenoLoaderウィンドウにアクセスするには、「ファイル構造」をクリックします。 </li><li>画像データセットを含むディレクトリを選択して「ルートディレクトリを定義」をクリックします。次に、解析（オプション、空のままにすることができます）のために使用されていないファイル（使用されていないファイル）をフィルタリングします。 </li><li>実験に使用したバイオマーカーを指定し、画像とそれらを関連付けるための「マーカーの定義」をクリックします。具体的には、一意のバイオマーカーを特定し、ファイル名の一部を選択して、画像ファイルをクリックしてください。最後に、各バイオマーカーの名前を入力します。 </li><li>各画像に情報を関連付けるために「メタデータを定義する」をクリックします。具体的には、画像ファイルをクリックして[画像情報（よく名の例： &quot;B16&quot;）を特定し、ファイル名の一部を選択します。ウィンドウには、グループ名（ 例： &quot;を求め我LL &quot;）の名前を入力し、ポップアップ表示されます。ファイル名から抽出されたグループのメンバーが） 例えばよく名前の完全なリスト（グループテーブルに表示されます。ファイル名に存在しない付加的な情報を追加するには、をクリックして「 （オプション）次の「追加のグループ名（ 例：入力し「メタデータグループの追加」ボタンをクリックして「薬剤」）と、事前に定義されたグループの各値（ 例えば 「ウェル」）、その値を入力します（ 例：「タキソール」） 。加えることができる付加的なグループの数に制限はない。 </li><li>最後に、メタデータファイルを生成し、解析を継続して &quot;作成Metadatafile」をクリックしてください。メタデータファイルが以前に生成された場合、上記のステップは、直接オプション（下記3に記載されている）「メタファイル」を使用してファイルをロードすることによって回避することができる。 </li></ol></li><li>正規表現ベースのテンプレート：正規表現は、パターンにマッチするための標準的なアプローチであるテキスト内。ファイル名および/またはディレクトリ構造は、グループのイメージに十分な情報が含まれており、命名規則は、既存のテンプレートのいずれかと一致する場合に、このオプションを選択します。正規表現に基づいたカスタムテンプレートは、手動で定義され、再使用することができる。この高度なオプションは、正規表現に精通してユーザーにお勧めします。 </li><li>メタデータファイル：究極のカスタマイズ性のため、このオプションを選択します。定義し、カンマ区切り値、各画像に関連付けられたファイル名やメタデータを含む（CSV）ファイルをロードします。ファイル形式の例では、Webサイト（phenoripper.org）のダウンロード部分で提供されています。単純にそれに含まれる情報を表示するインタフェースを介してファイルをロードします。 </li></ol></li><li>冗長なサンプリングを避けるために、実験での反復を定義するメタデータフィールドを選択します。 IMPRでき（良くするなど ）、それらを一緒にグループ化し、複製物を（ウエル内などの全ての画像のようになります）が含まれているデータ·セットの場合オベパフォーマンス。ほとんどの場合、ランダムなサブセットを選択し、デフォルトのオプション「ランダム（知らない）」を選択することが合理的である。 </li></ol> 2.2解析パラメータの設定データセットを処理するのに必要なパラメータを定義する」に設定パラメータ」をクリックします。定義するパラメータは、左側のパネルにあります。右側のパネルには、データセットのマージされたサンプルが表示されます。異なる画像を切り替えるために、左/右の矢印をクリックしてください。 <ol><li>閾値強度：大体のイメージの細胞部分（というよりも、バックグラウンド、非細胞領域）を識別するために、適切なしきい値を選択します。閾値はPhenoRipperによって事前に計算されるが、画像の上に利用可能なスクロールバーを使用して、細胞領域の強調表示を改善するように調整されてもよい。選択された閾値は、すべての画像にまたがって機能しない場合は、むしろ細胞領域を落とすよりも非細胞領域を含むように、しきい値を下げる。 </li><li>ブロックSIZE：グリッドに画像をピクセル単位で適切なブロックサイズを選択してください。指定されたサイズのブロックが画像に重畳される。 20から30ブロック/セルの平均値を得るために、ブロックサイズを調整します。 「ブロックサイズ」フィールドの前にあるチェックボックスに画像クリック上にグリッドを重ね合わせる。 </li><li>オプションのパラメータ：自動スケーリング画像は希望の相対強度を有するマーカーが表示されていない場合（ 例えば 1色が飽和している）、またはマーカーが分析からドロップする必要がある場合は、「チャネルの強さを調整」オプションを使用します。マーカーのサブセットに細胞領域を識別するために、オプションの「しきい値のために使用されるチャネル」を使用しています。他のパラメータのデフォルトの選択は、通常は十分ですが、必要であれば、「高度な解析オプション」を使用してそれらを調整します。 </li><li>メインアプリケーションパネルの「PhenoRip」を押して、分析を実行します。 PhenoRipperは、自動的に画像内の再発のブロックタイプを識別します。表現型のプロファイルが生成されます各画像は、その中に様々なブロックタイプの分画に基づく。 </li></ol> 3。探検結果<ol><li> PhenoBrowser（ 図1）を使用して画像の表現型のプロファイル間の関係を探る。 PhenoBrowserインタフェースは、4つのパネルで構成されています。左上のパネルには、異なる画像/条件との間の相対的な類似性のグラフィカルな表現（散布図）、選択された条件の右側の表示のサンプル画像上の2パネル、および最後のパネル（棒グラフである）は、その表現型のプロファイルを比較します。 </li><li> 「データ処理」メニューを使用して &quot;空のフレームを廃棄する」。 </li><li>低品質の画像を削除する：第一に、個々の画像は、「データ処理」メニューからグループ化をオフに勉強する。次に、散布図における外れ値の点をクリックすると（ 例えば 、焦点のうち、染色アーティファクト）低品質の画像を破棄します。 </li><li>データを調べる：フィールド定義のメタデータを決定し比較の基本単位（ 例えば 、薬剤を比較し、メタデータ·フィールドの値が同じ「薬物」の画像がグループ化される必要がある）。 「グループ化」を持つ単一のデータポイントにこのメタデータ·フィールドの同じ値を持つすべてのイメージを折りたたむ。例えば、薬物によるグループ化は、薬剤ごとに1ポイントを得るために、各薬剤の中に画像を平均化する。散布図に近い（または遠隔）の点は、同様の（または異なる）細胞の表現型を引き出す条件を反映している。解釈可能を支援するために利用可能なメタデータに基づいて、色やラベルの点（データ表示]メニュー）。 3Dプロットは、「回転可能」チェック·ボックスをクリックして、左ボタンをクリックして、その上でマウスをドラッグして回転可能である。 </li><li>これらを直接比較するために2つの異なる点を選択します。画像パネルは、各ポイントのサンプル画像が表示され、バーグラフパネルは、その出現頻度が2点間の最も異なるブロックタイプが表示されます。 </li><li> Cを起動しますブロックの種類や実験条件との関係をよりグローバルな視点を提供するために、「クラスタグラムメニュー」からlustergram。ブロックの種類と状態の両方をグループ化することによって、この表現は、最良の条件のグループ（ 図5）を区別する細胞の表現型を強調しています。 </li></ol>

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<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li>
<li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで説明するワークフローは、迅速かつ簡単に特性評価と顕微鏡画像の比較を可能にする。まず、このワークフローを迅速顕微鏡画像上の品質管理を行うことで、例えば、実験の最適化を助けることができる方法を説明しました。次に、我々は、ハイスループットスクリーニングデータを解析するための可能性を実証：我々は、それらの作用機序に基づいてグループ薬物することができた。薬物のグループ化はPhenoRipperが速く桁違いたにもかかわらず、より複雑な方法6を用いて見られるものに匹敵した。 私たちはどんなイメージベースのアプローチと同様に、散発的な実験的な変動に対して頑健この方法を発見したが、読み出しは体系的な非生物学的効果の影響を受けます。例えば、マーカー強度のプレート間の変動は、目的の生物学的効果をマスクすることができる。そのようなアーチファクトの影響は、例えば、p適宜修正7,8削減することができプレートの正規化とバックグラウンド除去後半。 PhenoRipperによって生成されたプロファイルはまた、細胞密度の変化によって影響され得る。この動作は（生存または...

過去10年間で、画像技術の急速な進歩は、多くのラボのハイスループット顕微鏡法を実行する能力を与えている。現在の課題は、分析の1に画像の1から移行している。どのように我々は、特性評価の比較、および、典型的なハイスループット撮像画面で生成された複雑なまだ微妙な表現型の急流を探索することができます？ 画像解析と情報プラットフォームの数は、画像の大規模なコレクションからの生物学的情報を抽出するためのユーザー洗練されたツールボックスの1-3を与えている。しかし、多くの重大な障害は、高スループットの画像ベースの画面からデータを分析するにとどまる。 （興味のあるシステムへの）イメージとアルゴリズムパラメータの微調整の適切な特徴付けを選択することに関わる困難さは、多くの場合、特に画像解析の専門知識を持たないユーザーのための長いセットアップ時間をもたらす。具体的には、細胞分割、内の個々の細胞を同定する工程n個の画像は、この点での主なボトルネックである。セグメンテーションは、細胞型、細胞密度、バイオマーカーなどの実験パラメータに非常に敏感であり、頻繁には大きなデータセットに対して繰り返し調整を必要とすることができる。これらの理由から、画像解析は、多くの場合、専門家ではなく、実験的なワークフローの一部として統合することによって実施した独立端末工程である。これは解析と実験の間の迅速なフィードバックサイクル、アッセイ開発の重要な部分を排除する。 ここでは、ハイスループット蛍光顕微鏡用に最適化され、前述の問題点の多くを回避している別のワークフローを記載している。この目的のために、我々はPhenoRipper 4、顕微鏡画像の迅速な調査と分析のためのオープンソース·ソフトウェア·プラットフォームを利用しています。重要なことは、PhenoRipperは、単一の細胞を同定しようとしていないことにより、細胞の分割に関わる課題の多くを避けることができます。その代わり、PhenoRipperは画素に画像を分割細胞内のサイズのブロックとそこに含まれるブロック単位で画像を特徴付ける。具体的には、PhenoRipperはマーカーの共局在ベースの機能の面でブロックをプロファイルし、自動的に訓練画像の中で最も代表的なブロックタイプの4識別します。 PhenoRipperは、各ブロック最も類似する代表的なブロックタイプに割り当て、最終的にそれらが含むブロックの種類に基づいて画像を特徴付ける。 より伝統的な単一セルベースの​​アプローチと比較すると、このアプローチは、最小限の微調整と専門知識を必要とします。ブロックサイズと閾値強度（画像の非細胞部分を破棄すること）、グラフィカルなフィードバックが設定され、どちらも：そのように、ユーザーは二つのパラメータを設定する必要があります。重要なことに、ここで説明したワークフローは、速度と最小限の微調整が大きく、時間と信頼性の向上を提供する非常に大きなデータセットに容易に拡張する4が示されている。実際には、我々はこのアプリがわかりローチは、両方の大きさは4の倍数桁のセットアップと実行に必要な時間が短縮されます。 PhenoRipperのプライマリ出力は、細胞が同様の表現型を表示させる実験条件のグループを識別することを可能にする、画像類似度を視覚的に表現したものである。一般的に見つけPhenoRipperグループ化は、より多くの時間がかかり、セル·ベースの方法4によって生成されたものに匹敵する「生物学的解釈可能」を持っている。実際には、これは、しばしば、典型的な96ウェル蛍光顕微鏡実験を行った30分以内に、前の画像解析経験のない実験者が彼または彼女の実験のパフォーマンスに関する信頼性の高い読み出しを得ることができることを意味する。実験者は次いで、異なる実験条件間の関係を探索を開始し、画像の表現型へのこれらの関係に関連することができる。 私たちは、効果を分析することによって、このワークフローを実証DNAや細胞骨格マーカーについて染色HeLa細胞上の異なるメカニズムのクラスにおける薬物の。薬の同じクラスで処理された細胞の画像がグループ化され、（というように、フォーカス細胞外染色のアーティファクト、）悪い品質の画像を識別し、潜在的に破棄するためにそれらが容易、外れ値として登場した。 このワークフローは、画像ベースの多数のアッセイのために有用であるが、別のアプローチは、潜在的に、より有益である可能性が明らかに多くの状況があります。例えば、PhenoRipperからの出力は、主に実験条件間での蛍光パターンの相対比較である。特定の単一細胞形質の絶対的特徴付けは、（セル内のスペックルの例えば数）の代わりに必要とされた場合、単一細胞ベースの分析が必要とされるであろう。それにもかかわらず、さらにこの種の状況において、PhenoRipperは、これらの単一細胞の表現型の変化を検出し、従って、アッセイの最適ための有用なツールである可能性が高いmization。

<table><tbody><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>High Glucose, L-Glutamine</td></tr><tr><td>Marker Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock</td></tr><tr><td>マーカー phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>共役ファロトキシン, 希釈 1:200</td></tr><tr><td>一次抗体 &-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Primary Ab, mouseモノクローナル、希釈 1:200</td></tr><tr><td>二次抗抗マウス TRITC</td><td>ジャクソン</td><td>115-025-166</td><td>抱合二次抗体、0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml グリセロール</td></tr><tr><td>使用したアルドステロン</td><td></td><td></td><td>濃度: 0.2 &mu;M</td></tr><tr><td>アピシジン</td><td></td><td></td><td>使用濃度: 20 &mu;M</td></tr><tr><td>コルヒチン</td><td></td><td></td><td>使用濃度:0.16 &mu;M</td></tr><tr><td>コルチゾール</td><td></td><td></td><td>濃度:0.2&μ;M</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td></td><td></td><td>使用濃度: 0.2 &mu;M</td></tr><tr><td>ドセタキセル</td><td></td><td></td><td>使用濃度: 0.2 &mu;M</td></tr><tr><td>M344</td><td></td><td></td><td>使用濃度: 20 &mu;M</td></tr><tr><td>MS-275</td><td></td><td></td><td>使用濃度: 5 &mu;M</td></tr><tr><td>ノコダゾール</td><td></td><td></td><td>使用濃度: 0.3 &mu;M</td></tr><tr><td>プレドニゾロン</td><td></td><td></td><td>使用濃度:0.2 &mu;</td></tr><tr>M<td>RU486</td><td></td><td></td><td>使用濃度: 0.2 &mu;M</td></tr><tr><td>Scriptaid</td><td></td><td></td><td>の使用濃度: 70 &mu;M</td></tr><tr><td>使用タキソール</td><td></td><td></td><td>濃度: 0.3 &mu;M</td></tr><tr><td>トリコスタチンA</td><td></td><td></td><td>濃度:0.2&μ;M</td></tr><tr><td>ビノレルビン</td><td></td><td></td><td>使用濃度: 0.3 &mu;メートル</td></tr></tbody></table>

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ハイスループット顕微鏡法の急速な進歩にもかかわらず、定量的な画像ベースのアッセイは、依然として重大な課題を提起する。専門的な画像解析のさまざまなツールが利用可能であるが、最も伝統的な画像解析ベースのワークフローは、（解析パラメータの微調整のために）急な学習曲線を持っているとイメージングと解析間の長いターンアラウンド時間をもたらす。具体的には、細胞分割は、画像内の個々のセルを識別するプロセスは、この点での主なボトルネックである。 ここでは、代替、PhenoRipper、顕微鏡画像の迅速な分析と探査のために設計されたオープンソースのソフトウェアプラットフォームに基づいて、セルセグメンテーションないワークフローを紹介。ここで紹介するパイプラインは、細胞培養の免疫蛍光顕微鏡画像用に最適化されており、最小限のユーザの介入を必要としている。 30分以内に、PhenoRipperは、典型的な96ウェル実験からのデータを解析し、画像のプロファイルを生成することができる。ユーザーことができます目視、そのデータを調査、その実験に品質管理を行う、摂動に対する応答性を確保し、反復実験の再現性を確認してください。これは、アッセイの最適化の際に非常に重要である、解析と実験の間の迅速なフィードバックサイクルを容易にします。このプロトコルだけでなく、品質管理のための最初のパス解析として有用であるだけでなく、エンドツーエンドのソリューションとして使用することができる、特にスクリーニングのため。ここで説明したワークフローは、例えば、ハイスループットスクリーニングによって生成されるような大規模なデータセットに拡張し、正確に生物系の広範囲の表現型によって基実験条件に示されている。 PhenoBrowserインタフェースは、表現型の空間を探索し、生物学的な注釈に画像のプロパティを関連付けるための直感的なフレームワークを提供します。一緒になって、ここに記載されているプロトコルは、イメージベースのスクリーニングの定量分析を採用への障壁を低くします。

ここでは、それらの作用機序に基づいてグループの薬剤に対してこのワークフローの能力を試験した。 HeLa細胞を384ウェルプレートの30ウェルに播種し、DNA /アクチン/α-チューブリンについて染色した。使用された具体的な一次抗体、蛍光標識二次抗体、および他の蛍光汚れ、材料の表に示します。ウェルを三機構的クラス（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、微小管を標的化およびDNA損傷）24時間撹拌し、20X対物倍率で、落射蛍光顕微鏡を用いて画像化に属する15の薬剤で処理した。シックス画像は画像480（×3チャネル）の合計で、各ウェルについて得た。ここに記載されているデータはwww.phenoripper.orgからダウンロードすることができます。 上述したように、PhenoRipperはこれらの画像を分析した。前景閾値は5％（最大可能強度すなわち 5％）および20ピクセルのブロックサイズ（Figurに設定した<html>電子2）。このデータセットの分析は、標準的なデスクトップコンピュータ（64ビット、16ギガバイトのRAMを搭載した3.2 G...

ここでは、急速にPhenoRipper、最近開発された画像解析プラットフォームを用いた蛍光顕微鏡画像の集合を分析し、探索するためのワークフローを記載している。

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

この手順の全体的な目的は、画像解析プラットフォームを使用して、蛍光顕微鏡画像を迅速に解析および探索することです。まず細胞をプレートに播種し、各ウェルに摂動を加え、プレートをインキュベートすることでこれを達成します。その後、自動蛍光顕微鏡を用いて画像を撮影し、pheno loaderツールを使用して、画像をpheno ripper画像解析プラットフォームに半自動的にロードします。解析パラメータを設定すると、pheno ripperは画像内の繰り返しブロックタイプを自動的に識別し、pheno browserを使用して探索可能な各画像の表現型プロファイルを作成します。最終的に、最終的なクラスターグラムは、異なる条件と画像特徴量との関係を示し、ハイスループット画像スクリーニングによって生成された、複雑ながらも微妙な表現型の比較を可能にします。個々の細胞の自動識別を必要とする既存の手法に対するこの手法の主な利点は、操作がはるかに迅速かつ容易であることです。この手法は、異なる薬剤が細胞プロセスにどのような影響を与えるかなど、生物医学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手順は、テキストプロトコルに記載されている細胞培養および細胞固定から始まり、テキストプロトコルに記載されている特定の一次抗体、蛍光標識二次抗体、およびその他の蛍光染色剤を用いて固定細胞を染色します。細胞染色の後、落射蛍光顕微鏡を用いて画像を撮影します。この例では、Benning社のカメラを用い、20倍の倍率で撮影しました。各ウェルにつき16枚の画像を撮影し、合計で480枚の画像を取得しました。画像の解析には、まずpheno ripperからpheno ripperをダウンロードしてインストールしてください。orgからPheno Ripperを起動します。画像を半自動的に読み込み、関連するメタデータとともに解析を開始するには、[File Structure]をクリックしてPheno Loaderにアクセスします。画像データセットが含まれているディレクトリを選択し、必要に応じて画像のファイル拡張を指定してください。解析に使用しないファイルをフィルタリングします。 [define markers] をクリックして、実験で使用したバイオマーカーを指定し、それらを画像に関連付けます。具体的には、画像ファイルをクリックし、バイオマーカーを一意に特定できるファイルパスの一部を選択してください。最後に、各バイオマーカーの名前を入力します。次のステップは、「define metadata（メタデータの定義）」をクリックすることです。各画像に情報を関連付けるには、画像ファイルをクリックし、画像情報を識別するファイルパスの一部を選択してください。グループ名の入力を求めるウィンドウが表示されます。名前を入力してください。ファイル名から抽出されたグループのメンバーが、グループテーブルに表示されます。この情報は、解析結果の視覚化に使用できます。ファイル名に含まれていない情報を追加するには、[追加情報を追加]ボタンをクリックし、[メタデータグループを追加]を選択して、追加したいグループ名を入力します。その後、定義したグループに対する各値を入力してください。追加できるグループ数に制限はありません。最後に、[create metadata file]をクリックして、pheno ripperで読み取り可能なデータの注釈を生成します。この際、冗長なサンプリングを避けるため、実験におけるレプリケート（繰り返し）を定義するメタデータフィールドを選択してください。レプリケートを含むデータセットの場合、これらをグループ化することでパフォーマンスを向上させることができます。次に、[set parameters]をクリックして、データセットの処理に必要なパラメータを定義します。定義するパラメータは左側のパネルにあります。右側のパネルには、データセットのサンプルが表示されます。左右の矢印をクリックして、異なる画像に切り替えます。適切なしきい値を設定し、画像の細胞部分をおおよそ的に特定します。しきい値はPhenoRipperによって事前計算されていますが、画像上部のスクロールバーを使用して調整することで、細胞領域のハイライトを改善できます。選択したしきい値がすべての画像でうまく機能しない場合は、細胞領域を切り捨てるのではなく、非細胞領域が含まれるようにしきい値を下げてください。次に、画像をブロックのグリッドに分割するために、ピクセル単位で適切なブロックサイズを選択します。1つの細胞あたり平均20〜30個のブロックが重なるように、ブロックサイズを調整してください。ブロックサイズ項目の前にあるチェックボックスをクリックします。オートスケールされた画像で、希望する相対強度でマーカーが表示されない場合や、解析からマーカーを除外する必要がある場合は、「adjust channel intensity（チャンネル強度の調整）」オプションを使用して、一部のマーカーにおける細胞領域を特定してください。閾値オプションのデフォルトに使用するチャンネルを選択します。他のパラメータの選択は通常で十分ですが、必要に応じて調整してください。詳細解析オプションを使用して、メインアプリケーションパネルのpheno ripを押して解析を実行します。Pheno ripperは、画像内の再帰的なブロックタイプを自動的に識別します。各画像に含まれる異なるブロックタイプの割合に基づき、表現型プロファイルが作成されます。phenoブラウザを使用して、画像の表現型プロファイル間の関係性を探索してください。phenoブラウザのインターフェースは、4つのパネルで構成されています。左上のパネルは、異なる画像と実験条件間の相対的な類似性をグラフで表したものです。右側の2つのパネルには、選択した条件のサンプル画像が表示されています。最後のパネルでは、選択した条件の表現型プロファイルを比較しています。まず、データ処理メニューからグループ化をオフにし、個々の画像を確認します。次に、散布図内の外れ値をクリックし、低品質な画像を破棄します。どのメタデータフィールドを比較の基本単位とするか決定してください。例えば、薬剤を比較するには、メタデータフィールド「drug」の値が同じ画像をグループ化します。これにより、各点は単一の薬剤を表すようになります。データ表示メニューを使用して、利用可能なメタデータに基づいて点に色を付けたりラベルを貼ったりすることで、解釈性を高めることができます。点同士の距離は、対応する実験条件の相対的な表現型の類似性を反映しています。点が近いほど、類似性が高いことを示します。回転可能なチェックボックスを選択すると、3次元プロットを回転させることができます。マウスの左ボタンを押しながら、グラフ上でマウスをドラッグしてください。2つの異なるポイントを選択して直接比較します。画像パネルにはそれぞれのサンプル画像が表示され、棒グラフパネルには2つのポイントを最もよく区別するブロックタイプが表示されます。クラスターグラムメニューからクラスターグラムを起動すると、ブロックタイプと実験条件の両方をグループ化することで、ブロックタイプと実験条件の関係をより包括的に視覚化できます。この表現では、条件グループを最も明確に区別する細胞表現型が強調されています。ヒストン脱アセチル化酵素、微小管標的薬、およびDNA損傷薬による処理後、DNA、アクチン、およびα-チューブリンを蛍光染色しイメージングしたHeLa細胞の解析にPheno Ripperを使用しました。これらの画像のフォアグラウンド閾値は5%、ブロックサイズは20ピクセルに設定されました。このデータセットの解析には、標準的なデスクトップコンピュータで約10分かかりました。結果の探索にはpheno browserインターフェースを使用しました。画像間の相対的な表現型の類似性は、多次元尺度法を用いて可視化されています。各点は個々の画像を表しており、薬物の作用機序に基づいて色分けされています。このプロットは、表現型プロファイルを用いて薬剤をその作用機序ごとにグループ化できることを示しています。ポア染色や空フレームなどのイメージングアーティファクトは、明確な外れ値として目立つため、容易に特定できました。データのクラスターグラムにより、ここでのグループ化と表現型プロファイルとの関係性が示されています。各行は単一の薬剤を、各列はブロックタイプを表しています。グレースケールの値は表現型プロファイルを示しており、色が明るいほどそのブロックタイプの割合が高いことを意味します。階層的クラスタリングにより、薬剤が薬剤クラスごとに概ね分類されています。この手法を習得すれば、適切に実施することで10分で完了させることができます。本手順に従った後、IRAプロファイリングなどの他の手法を実施することが可能です。これにより、異なる遺伝子が同様のパスウェイにどのように影響するかといった、さらなる疑問に対する答えを得るのに役立ちます。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

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特定のタンパク質の役割や突然変異の影響について、しばしば重要な洞察を得ることができます。この論文では、定量的蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを使用して、生細胞のエンドサイトーシスイベントを定量化するためのツールとして、pH感受性GFPバリアントである超黄道pHluorinを使用する方法を示します。...

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

我々は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）ベースの読み出しを用いてタンパク質相互作用をアッセイするための自動化された蛍光寿命イメージング（FLIM）を利用するオープンソースの高含有量分析（HCA）装置を提示します。このopenFLIM-HCAの楽器のためのデータ取得がマイクロマネージャーとデータ分析で書かれたソフトウェアによって制御されFLIMfitで行われています。...

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ここで広視野高内容分析システム (WHCAS)...

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蛍光顕微鏡画像で特定の細胞区画内の細胞体を迅速に探査し、正確に分析するために構築された自由に利用可能なワークフローを提示します。このユーザーフレンドリーなワークフローはオープンソースソフトウェアのIcy上で設計され、また、ImageJの機能を使用しています。パイプラインは、画像解析に関する知識なしに手頃な価格です。...

サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー

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オープンソースの液滴マイクロ流体工学によるプラスミド安定性解析

学ぶ PhenoRipperプラットフォームを用いた蛍光顕微鏡画像の迅速解析法。細胞シード、自動撮影、ブロック型識別により表現型プロファイルを生成し、クラスターグラムで複雑な表現型の比較を可能にする。

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

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