ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定

以下の実験の全体的な目標は、単純なIL one β読み出しアッセイを使用して、in vitroヒト樹状細胞のインフラマソーム活性を観察することです。まず、R 8 48を細胞に添加して、細胞内プロIL one β発現を誘導します。次に、nigeを追加してNLRPの3つのインフラマソーム形成を活性化します。

これにより、分泌前にプロILの1つのベータが成熟ILの1つのベータに切断されます。次に、サンプルを採取し、免疫蛍光、ウェスタンブロット、およびeliによってプライミングおよび活性化細胞からのIL oneベータの分泌を測定することにより得られた細胞内プロIL one βおよび細胞外成熟IL one βの結果を測定する。検出は、ヒトDCSをプライミングすると、R8 48プライミングされた細胞で細胞内プロILワンベータが産生され、ナイジェリアのジュリスでプライミングおよび活性化された細胞の両方からILワンベータが分泌されることを示しています。

この方法は、合成リガンドに対するヒト樹状細胞の応答におけるNLRP 3インフラマソームの役割についての洞察を提供することができます。また、細菌、ウイルス、自己炎症性疾患などの生理学的トリガーをテストするように設計された他のシステムにも適用できます。新たに単離された単球由来樹状細胞の200マイクロリットルを、96ウェルの丸い底板で休止状態にします。

刺激を受けないネガティブコントロール、プライミングのみ、活性化のみ、プライミングとそれに続く活性化の4つの標準条件から始めます。次に、実験デザインに従って、R8 48の希釈剤コントロールと下流の細胞内サイトカイン染色アッセイ用のニッシンを含め、インフラマソームをプライミングするためのアイソタイプコントロールの重複を含めます。R 8 48を添加し、10マイクロモルの最終濃度を適切なウェルに加えます。

細胞を摂氏37度、5%CO2のインキュベーターに18時間置きます。次に、NLRP 3インフラマソームを活性化するために、20マイクロモルの最終濃度でnigeを添加します。培養物をさらに6時間インキュベーターに戻し、サンプルを回収し、細胞ペレットを乱さずに培養プレートをGの974倍で3分間遠心分離します。

各上清を別々の丸底プレートに移し、EISAによるサイトカイン分泌を測定します。次に、細胞ペレットを200マイクロリットルのXPBSで3回洗浄し、細胞サンプルから細胞外IL 1ベータを除去し、10マイクロリットルの変性溶解バッファーで細胞を直接溶解するプロILワンベータのウェスタンブロット検出のためのさまざまな手法によるさらなる分析を行います。ライセートを1.5ミリリットルのeinor tubesに移した後、サンプルを摂氏100度で10分間加熱し、IL one βのフローサイトメトリーによる蛍光検出を行います。

100マイクロリットルの5%PHS培地を細胞サンプルに加え、1マイクロリットルの蛍光標識抗体を表現型マーカーまたはアイソタイプコントロールに対して室温で暗所で10分間インキュベートします。PBSを3回洗浄した後、細胞を100マイクロリットルの4%PFAで室温の暗所で20分間固定します。次に、100 μLの透過性緩衝液を30分間添加し、続いて62ナノグラムの抗IL one β FSE抗体またはアイソタイプコントロールサンプルを摂氏37度で2時間インキュベートします。

細胞を200マイクロリットルの透過性緩衝液で3回洗浄し、1つのXPBSに再懸濁します。サンプルをホイルで包み、摂氏4度で保存します。顕微鏡でIL one βを検出する場合は、ダッピーで細胞を染色し、山を追加し、スライドガラスの上にカバースリップをそっと置きます。

山を一晩硬化させてから、フローサイトメトリーによる蛍光検出のための顕微鏡画像を撮影します。一度に 1 つのサンプルでデータを取得します。ライブセルに前方および側面散乱ゲートをセットします CD 11 C正のCD14ネガティブセルの次のゲート。

最後に、顕微鏡データ取得におけるプロIL one β染色に基づいてMODC集団を分析します。ポジティブ染色 R 8 48 処理サンプルで露光時間を設定します。次に、ウェスタンブロット検出のためのMO dcsの容易さを発現するpro IL one βの割合を決定します。

総サンプル量をポリアクリルアミドゲルにロードします。ダイの前面がゲルのから離れるまで、140ボルトで実行します。ポリアクリルアミドゲルからタンパク質をFLメンブレン上のA-P-V-D-Fインモに移します。

TBST中の5%BSAでメンブレンを1時間ブロックします。一次抗体と4°Cで一晩振とうしながらインキュベートします。5分間のTBST洗浄を3回行った後、二次抗体と室温で1時間インキュベートし、さらに3回のTBST洗浄でメンブレンを画像化し、ELI SAで分泌されたサイトカインを測定し、室温でサンプルを平衡化します。

サンプルをスピンダウンして上清の凝縮を統合し、製造元の指示に従ってIL one β細胞内サイトカインの測定を行い、プロIL one betaの細胞内サイトカイン染色を行うことで、CD 11、C陽性、CD14陰性単球由来樹状細胞からの顕微鏡検査と事実の読み出しが可能になります。どちらの手法も、非プライム細胞コントロールまたは静止細胞コントロール、ならびにアイソタイプコントロールと比較して定量化できます。pro IL one β染色細胞の割合に、この集団の幾何学的中央値を掛けて、蛍光強度の中央値を求めます。

MFIは、陽性染色細胞に存在するプロIL1ベータの量に匹敵します。ここは。イムノブロッティング技術は、細胞溶解物からプロIL one βを測定するために使用されます。定量的データは、予想どおり、ベータチューブリンなどの内部細胞制御に対して相対的に表されます。

NIナイジェリアで処理された細胞におけるプロIL one βの免疫ブロッティングでは、プロIL one βの減少が明らかになりました。これは、上清中のIL 1ベータの同時増加によって補完され、E ELI a a a R 8 48 のみで測定され、続いて NI ナイジェリアの条件で測定されます。T NF、α、IL 10、IL 6などの他の炎症性サイトカインを同時に測定することで、ニジェールがIL 1ベータの分泌を引き起こすのに特異的であることが保証されます。

プライミングのレベルは、時間と用量に依存します。ex細胞外タンパク質濃度の測定、成熟I one β世代からの化学発光検出、またはインフラマソームのブロッキングなどのさらなる実験は、ex intracellular IO one βが成熟切断型であるかどうか、およびIO one β分泌がnlrpであるかどうかを判断するのに役立ちます。3つのインフラマソーム活性依存性。