三次元インクジェット印刷技術を用いて、ヒト軟骨組織の作製

この手順の全体的な目標は、光重合を同時に行う改造サーマルインクジェットプリンターを使用して、3D組織印刷の実現可能性をテストするための3次元ヒト軟骨組織を構築することです。これは、まず市販のヒューレットパッカードデスクジェット500サーマルインクジェットプリンターと5 1 16 2 6、モノカラーインクカートリッジをバイオプリンターに改造することによって達成されます。2番目のステップは、単純な3Dプリントステージと長波長UVランプを組み合わせて、製造プロセス中に注入されたバイオインクを即座に重合することです。

次に、バイオインクは、拡張したヒト関節軟骨細胞を10%ポリエチレングリコール溶液に500万細胞/ミリリットルで懸濁することによって調製されます。最後のステップは、同時に光重合を行いながら、軟骨組織を層ごとに印刷することです。最終的には共焦点顕微鏡と組織学。

染色は、3Dハイドロゲル中の印刷された軟骨細胞の均一な分布と、培養中の均質な新軟骨における軟骨細胞外マトリックスの優れた産生を示すために使用されます。この技術の主な利点は、手動製造後の重合やスキャン後の細胞の座り込みなどの既存の手段よりも優れている点は、プリントされた細胞が正確に触覚位置に送達され、マトリックス内の位置に留まることです。重力によって足場の底まで考えるのではなく、均質なカートリッジを形成します。

このビデオで紹介されているプリンターの変更は、Hewlett Packard の Desk Jet 500 サーマル インク ジェット プリンターと 5 1 6 2 6 a ブラック インク カートリッジに基づいています。まず、プリンターの上部プラスチックカバーを取り外し、コントロールパネルをカバーから慎重に取り外します。プリンターの上部とベースの間の3本のケーブル接続を外します。

次に、プリンターの上部をベースから取り外します。次に、プリントヘッドクリーニングシステムを構成する小さなプラスチックとゴム製のアクセサリをプリンターの上部から取り外します。用紙トレイのベースをスプリングで取り外します。

プラスチック給紙バーを覆っている金属板も取り外す必要があります。さらに、プラスチック製の給紙バーは、中央の給紙ホイールの位置で切断し、2つの給紙ホイールを取り外す必要があります。このビデオでは、これらのコンポーネントはすでに削除されています。

缶詰の空気とエタノールワイプを使用してほこりや破片を掃除した後、UVを使用する前にプリンターの上部をベースに取り付けます。改造したプリンターを層流フードで少なくとも2時間滅菌しました。インクカートリッジを改造するには、まずキャップを切り取ります。

ハンドソーを使用してインクを空にし、カートリッジの底部ウェルリザーバーを覆っているフィルターを取り外します。カートリッジを流水で十分にすすいで、残留したインクウルトラを取り除きます。カートリッジを脱イオン水で10分間超音波処理します。

カートリッジを調べて、すべてのインクが除去されていることを確認します。カートリッジに70%エタノールを注入して滅菌し、続いて滅菌した脱イオン水にスプレーします。最後に、印刷プラットフォーム上に長波長UVランプを設置して、同時光重合能力を提供します。

UV光量計を使用して、印刷プラットフォームでUV強度を測定します。UVランプとプリンタープラットフォームの間の距離を調整して、印刷対象の強度が1平方センチメートルあたり4〜8ミリワットになるようにします。ランプとプリンタープラットフォームの間のこの距離は、約25センチメートルである必要があります。

バイオインクは、ヒト軟骨細胞から調製され、単層プレートで軟骨細胞を増殖させます。500万個のヒト軟骨細胞を各T1 75組織培養フラスコに入れて細胞増殖させます。DMEMでは、10%のウシ血清と1つのペニシリンストレプトマイシングルタミン培養細胞を摂氏37度で、5%の二酸化炭素を含む加湿空気で補充します。細胞が85%コンフルエントになるまで、3日ごとに培地を交換します。

同じ継代の細胞を使用してください。ポリエチレングリコールDLまたはpeda溶液を調製します。ペダをPBSに溶解し、最終濃度が10%になります容量あたりの重量。

フォトイニシエーターI 2 9 5 9を最終濃度0.05%まで加えます。培養したヒト軟骨細胞が85%コンフルエントになったら溶液を滅菌します。細胞濃度を計算した後、細胞を採取します。

バイオインに必要な細胞懸濁液の量を、1ミリリットルあたり500万個の細胞を1200 RPMの円錐管遠心分離機に5分間移します。細胞をペレット化するには、上清を吸引し、調製したPega溶液に細胞を懸濁してバイオインクを形成します。この手順を開始するには、Microsoft Wordを使用してプリンターとラップトップの電源を入れ、直径4ミリメートルの実線の円の印刷パターンを作成します。

プラスチック型をプリンターに入れます。パターンの位置を調整し、プラスチック金型に正確に印刷されることを確認します。足場の希望の厚さに到達するために必要なプリント数を計算します。

高さが4ミリメートルの場合、目的の足場を作成するには220枚のプリントが必要です。バイオインクをインクカートリッジにセットします。カートリッジをアルミホイルで覆い、uuvに直接さらされないように保護します。

印刷中は、印刷コマンドをプリンターに送信してください。プリンターが印刷を開始したら、用紙センサーを引いて印刷を続行します。プリンターを経由する用紙がない場合、直径4ミリメートル、高さ4ミリメートルの足場で、印刷プロセス全体にかかる時間は4分未満です。

印刷したネオ軟骨を24ウェルプレートに移し、各ウェルに1.5ミリリットルの培地を加えます。細胞生存率を評価するには、プリントされたネオ軟骨を生死生存率でインキュベートします。細胞毒性ワーキング溶液を室温で15分間暗所で、細胞を含んだハイドロゲルを半分に切断します切断領域の蛍光画像を取得した後、盲検化された観察者に、ランダムに撮影された5つの画像で生細胞と死細胞をカウントしてもらい、細胞の生存率を計算します。

この写真には、直径4ミリメートル、高さ4ミリメートルの代表的な印刷されたネオ軟骨組織を、改変されたサーマルインクジェットプリンターの特性に基づいて示しています。このサイズのコンストラクトの場合、レイヤーごとの構築中に印刷された各レイヤーの体積と厚さは、それぞれ0.23マイクロリットルと18ミクロンでした。ネオ軟骨組織を構築するための全印刷プロセスには、4分もかかりませんでした。

これらの画像は、緑色とオレンジ色の蛍光色素で標識された軟骨細胞の画像です。パネルAは、3D足場に印刷された軟骨細胞の均一な細胞分布を示しています。細胞沈着中の周囲の足場の同時光重合により、印刷および光重合プロセスは4分で完了し、細胞生存率は90%対照的に、パネルBは、同時光重合を行わないと、最初に堆積した場所に留まるのではなく、細胞が重力によって下部の水平界面に沈んだことを示しています。

と同じサイズの組成物で、細胞生存率が63%のサフランであり、PEGハイドロゲル中の印刷軟骨細胞のo染色は、培養中にプロトグリカン産生が徐々に増加し、3Dで印刷された軟骨細胞の共遺伝子表現型と均質な新軟骨の形成を示す。このビデオを見れば、改造されたサーマルインクジェットプリンターを使用して、3Dスキャフォールド内に均一な細胞分布を持つ3次元の計算組織を作成する方法を十分に理解できるはずです。