Gタンパク質共役受容体によるカリウムチャネルの調節を検出するために、ラベルフリー光学バイオセンサの使用

本実験の全体的な目的は、ラベルフリー共鳴波長グレーディング光学バイオセンサーを用い、カリウムチャネルによるGタンパク質共役受容体の変調を検出することである。この目的を達成するため、未改変のHEK 293細胞およびラットナトリウム活性化カリウムチャネルslack Bを安定的に発現させたHEK 293細胞を384ウェル光学バイオセンサープレートに播種し、一晩インキュベートする。次に、細胞膜近傍の質量のベースライン測定を行い、内因性Gタンパク質共役受容体（GPCR）のアゴニストを添加する。最終ステップとして、GPCRの活性化に起因する信号変化を測定し、この応答に対するカリウムチャネルによる変調を算出する。

最終的に、この手法によりGタンパク質共役受容体とカリウムチャネル間のシグナリング機構を定量的に測定することで、神経科学および細胞シグナリングの分野における重要な問いに答えることが可能になります。共沈降法などの、チャネルとタンパク質の相互作用を調べる既存の手法と比較した本技術の主な利点は、生細胞を用いてアッセイを実施できる点にあります。また、相互作用するタンパク質の構造を変化させる可能性のある外来性ラベルを使用する必要がありません。

そして最後に、生細胞内において、相互作用を実際にリアルタイムで追跡することができます。この手法はGPCRとカリウムチャネル間のシグナリングに関する知見を提供できるだけでなく、リガンド誘発性の細胞接着や伸展、毒性、増殖、遊走の変化、および原形質膜と光学バイオセンサーとの距離の変化に起因する細胞応答の研究にも利用可能です。

この手法は、チャネルタンパク質に対する薬理学的剤の効果を検証するためのハイスループット法として利用できるため、多くのチャネル病を含む、イオンチャネルや受容体の異常に起因する疾患に対する新しい治療アプローチの探索にも応用できる可能性があります。タンパク質相互作用に関して、私たちはまず、生細胞内でのチャネルタンパク質の相互作用を観察できるアッセイを開発する必要があることに気づき、この手法を用いることを着想しました。

384ウェルの光学バイオセンサープレートのコーティングを開始するため、二酸化チタンプレートの各ウェルに20 µLの滅菌組織培養グレード水を加え、15分間親水化させます。その後、16チャンネルピペッターを使用して、各ウェルを50 µLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回洗浄します。

次に、あらかじめ調製したフィブロネクチンのワーキングソリューションを各ウェルに20 µLずつ加え、室温で2時間インキュベートして細胞外マトリックス（ECM）を形成させます。インキュベーション後、各ウェルを50 µLのPBSで1回洗浄します。その後、調製したオバルブミンのワーキングソリューションを各ウェルに40 µLずつ加えます。

卵白アルブミン結合後のブロッキングを行うため、プレートを4 °Cで一晩インキュベートします。各ウェルに50 µLのPBSを用いて、プレートを3回洗浄します。ECMコーティング済みプレートは、4 °Cで最大48時間まで保存可能です。

本文のプロトコルに従って培養した、未切除のHEK 293細胞およびslack Bを安定的に発現しているHEK 293細胞の両方から、増殖培地を除去します。次に、トリプシンを加えて細胞をプレートから剥離させます。遠心分離機を用いて1000 ×gで1分間遠心し、細胞を回収します。

トリプシン溶液を除去し、増殖培地で細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターまたは自動細胞計数器を用いて細胞濃度を測定し、インキュベーション中の蒸発による影響を最小限に抑えるため、1ウェルあたりの目的の細胞数になるよう細胞を希釈します。本実験では、増殖培地 50 µL 中に 1,000 cells/well とします。

希釈した細胞を各ウェルに50 µLずつ分注し、バイオセンサー上に播種した後、細胞を増殖培地中で37 °C、5% CO₂にて一晩インキュベートした。共鳴波長グレーディング（RWG）光学バイオセンサーアッセイを準備するため、インキュベーション後、細胞から増殖培地を除去した。

細胞をハンクス平衡塩溶液で1回洗浄し、その後、各ウェルに溶液を25 µLずつ加えます。バイオセンサープレートをバインドスキャナーに設置し、細胞を室温で1〜2時間平衡化させます。その間に、アッセイ中にバイオセンサープレートへ添加する目的のリガンドを入れた別の化合物プレートを準備します。

これらのアッセイでは、化合物を含む溶液25 µLをバイオセンサープレートの各ウェルに添加し、合計容量を50 µLとしました。RWG光学バイオセンサーアッセイを行うには、384ウェルプレートの半分に相当するウェルA1からP12までをスキャナーシステムで測定し、ベースラインを測定します。Bind Scanソフトウェアを使用し、各ウェルの中央1.5 mmに対して1ピクセルあたり3.75 µmの最大解像度で測定してください。このベースラインスキャンには約30分かかります。

次に、ウェルA1からP12の各ウェルに、化合物溶液を25 µLずつ加えます。続いて、ウェルA13からP24のベースライン測定を行います。これらのウェルのベースライン測定後、ウェルA13からP24の各ウェルに化合物溶液を25 µLずつ加えます。

最終ステップとして、ウェル A1 から P12 のコンパウンド添加後の測定を行い、同様にウェル A13 から P24 まで繰り返します。アッセイデータを解析するには、Windows でベースライン測定の bind アッセイデータを開き、グリッドエディターボタンをクリックしてセル選択を有効にします。ソフトウェアはユーザーが定義した関心のある指標を算出します。プラグインを開き、セルファインダーおよびベースラインまたは関数セットパラメータを含む設定を行い、バイオセンサーの背景からセルを区別できるようにします。

ベースライン測定のセルファインダーデータを含むセルマップファイルをエクスポートします。化合物添加後のデータについても、同様の手順を繰り返します。次に、ベースラインまたはプラグインを開き、ベースライン測定からセルマップをインポートします。

ソフトウェアにより、バックグラウンドと化合物添加後のデータのピーク波長値（PWV）のシフトが算出されます。細胞のPWVの平均シフトを出力するには、「delta cell mean」を選択してください。その後、データをMicrosoft Excelにエクスポートして詳細な解析を行うことができます。

Slack bを安定的にトランスフェクトしたHEK 293細胞およびコントロールとして未導入のHEK 293細胞を、ECMコートした384ウェルRWGバイオセンサープレートに1ウェルあたり1000細胞で播種し、化合物の添加前および添加30分後にbind scanを用いて質量の密度勾配マップを作成した。

赤色で示されたソフトウェア領域は細胞として識別されたピクセルを表し、黄色の線は灰色のプレート背景から区別された細胞を示しています。化合物添加後のPWVからベースラインのPWVを差し引くことで、GPCRアゴニスト添加によるPWVの変化を決定するためにBind Viewソフトウェアが利用されました。これはカラーグラデーションで表示され、赤色はピーク波長値（PWV）の正の変化を、青色は変化なしを表しています。

カルバコールに対する内因性M1ムスカリン受容体の刺激を、未導入のコントロールHEK 293細胞およびslack Bを安定発現させたHEK 293細胞の両方に適用したところ、コントロール細胞と比較してピーク波長値の正の増加が認められました。slack B導入細胞では、ピーク波長値の増加がより顕著でした。内因性GPCRであるプロテアーゼ活性化受容体1に対してアゴニスト活性を示すS-F-L-L-R NH2 トリフルオロ酢酸塩およびC末端トロンビン受容体活性化ペプチド五量体においても、未導入細胞とslack B導入細胞で異なる応答が示されました。

これらの結果は、Slack Bチャネルの存在が、HEK細胞における内因性GPCRの活性化に伴い発生するPWVのシフトを有意に増大させることを示しており、チャネルタンパク質の相互作用を研究するための本アッセイの有用性を実証しています。このビデオを視聴することで、ラベルフリー光学バイオセンサーアッセイの開発および実施方法について十分に理解できるはずです。この手法を習得し、細胞と試薬を適切に準備しておけば、本手順を2日間で完了させることが可能です。

播種する細胞数やリガンドのインキュベーション時間などのアッセイパラメータは、細胞株ごとに最適化する必要があることに留意してください。本手順を実施した後、RやAIなどの手法を用いて、シグナルの変化にどの特定のタンパク質が必要であるかを特定させることができます。ヒト細胞培養の取り扱いは極めて危険を伴う可能性があるため、本手順の遂行中は常にバイオセーフティキャビネット内で作業するなど、十分な予防策を講じてください。