Name: 三次元文化：乳細胞の悪性形質転換正常対腺房アーキテクチャを研究するためのツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶ三次元培養システムを用いた乳細胞の良性と悪性表現型の識別法。Matrigel上で細胞を培養し、位相差顕微鏡と共焦点イメージングで形態変化を解析することで、乳がんの生物学的理解を深めます。

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この作品は、NIHの助成金R01 CA107469、R01 CA125577、およびCGのKleer、ミシガン州のがんセンターのサポート大学がU01CA154224によってサポートされていました。

1。材料の作製と培養培地<ol><li> 4℃のCO / Nの減少融解成長因子（GFR）マトリゲル</li><li> 37℃での必要な細胞株について完全なメディアを温めるMCF10A-ATCCは、メディアを指定していました。 5％ウシ胎児血清を補充したHME-HamのF-12培地、1μg/ mlのヒドロコルチゾン、5μg/ mlのインスリン、10 ng / mlの上皮増殖因子、および100 ng / mlのコレラ毒素; 5％FBS、2μg/ mlのヒドロコルチゾン及び5μg/ mlのインスリンを補充したSUM149-ハムF-12培地;およびMDA-MB-231から10パーセントFBS-DMEM </li><li>氷上で8ウェルチャンバースライドを予冷。 </li><li>組織培養フード、用品を準備します。 </li></ol> 8ウェルチャンバースライド中の2。三次元培養<ol><li>コー​​トGFRマトリゲル40μlの8ウェルスライドの各ウェル。スライドの中央にマトリゲルを追加してから、P200のピペットチップを使用して拡散。につながる可能性気泡やoverspreadingを避け、できるだけ均等に広がるようにしてくださいメニスカス形成。 </li><li> 5％CO 2下、37℃でスライドをインキュベートする。マトリゲルが固化されているときに、細胞をトリプシン処理し、収集し4分間組織培養遠心分離機で150×gでスピン。 </li><li>細胞を計数し、各細胞株の完全培地中12,500細胞/ mlに希釈する。 2％GFRマトリゲルを追加し、マトリゲル予めコーティングチャンバースライドの各ウェルに400μLを加える。 </li><li> CO 2インキュベータ内でスライドをインキュベートします。 15日まで、すべての4 日目の新鮮な完全なメディアの変化を与える。 </li><li> 薬理学的阻害剤を用いた治療：研究の阻害剤は、GFRマトリゲル上で細胞を成長させながら、3日ごと阻害剤を補充した新鮮な培地の変化に続いて、メッキの際に完全なメディアへの小分子阻害剤を追加します。 </li><li> 精製タンパク質を用いた治療： <ol><li>細胞プレート次は2.1から2.3を繰り返します。培養物は、血清starvati続く4日間増殖することができます16時間に。 </li><li> 5日目に、FBSは、血清飢餓細胞へのメディアの補足0.1％で精製されたタンパク質の適切な濃度で細胞を処理する。 2日後に精製したタンパク質を含む新鮮な培地交換を与えます。 </li><li> 10日目での完全なHMEメディアに馴化培地を交換してください。培養物は、別の5日間増殖することができます。 </li></ol></li><li> マトリゲル上で増殖させた腺房構造の免疫蛍光染色。 <ol><li> 2％パラホルムアルデヒド、0.5％トリトンX-100および1×PBS、pH7.4中の100mMグリシンを調製する。 0.1％ウシ血清アルブミン、0.2％トリトンX-100、0.05％のTween-20を含む1×PBSを含む、免疫蛍光緩衝液（緩衝液IF）を調製する。 </li><li>慎重に条件培地を吸引するP200のピペットチップを使用してください。 </li><li> 20分間室温（RT）で2％、新たに調製したホルムアルデヒドで腺房の構造を修正します。 </li><li> 4℃で10分間、0.5％トリトンX-100で細胞を透過</li><li>文化を洗う100mMグリシンエチルで3回、各洗浄のために10〜15分だ。 </li><li> RTで1時間、一次ブロックと呼ば​​IF緩衝液中の10％ヤギ血清で細胞をブロックする。 </li><li> 20μg/ mlのヤギ抗マウスのF（ab &#39;）30分間の一次ブロックバッファ内の2フラグメントと文化をインキュベートする。このステップは、マトリゲルで免疫反応性マウスIgG種をブロックすることが重要です。 </li><li>第二のブロッキング溶液中で一次抗体と共にインキュベートし、4℃で（一次ブロック+20μg/ mlのヤギ抗マウスF（ab &#39;）2フラグメント）O / N </li><li> 10〜15分緩やかに揺り動かしながらそれぞれのIF緩衝液で3回洗浄する。 </li><li> 45分間のIFバッファ内の蛍光結合二次抗体でインキュベートする。 </li><li> 10分間の洗浄を3回穏やかに揺らしながらIF緩衝液を用いて、それぞれ。 </li><li>核を可視化するために、DAPIを含有する抗退色試薬でスライドをマウントします。 </li><li>スライドを室温でO / Nを乾燥することができます。 </li><li>画像収集：コロニー周辺で共焦点画像を取得マトリゲルの上に増殖した細胞のdsection。詳細については、Zスタッキングにより腺房構造の全長にわたって光学一連のセクションを取得する。 </li></ol></li></ol> 3。イムノ用2ウェルチャンバースライドで三次元培養<ol><li>氷上で2ウェルチャンバースライドを予冷。 2.1〜2.4がマトリゲル160μlの2ウェルチャンバースライドなどのコートのための試薬 ​​をスケールアップし、2ウェルスライドの各ウェルに混ぜ、細胞/マトリゲルの1.6ミリリットルを追加する手順に従います。 </li><li>製造業者の説明書に従って市販の3D培養の細胞の回収キットを用いてマトリゲルから腺房構造を収穫。 </li><li> 1Xと4℃に予冷する細胞洗浄および細胞の回収バッファーを希釈マトリゲルの洗浄および脱落を氷上で行うべきである。 </li><li>細胞洗浄用緩衝液を用いて3倍腺房構造を洗ってください。 </li><li>細胞収穫BUを使用して15ミリリットル遠心チューブに腺房を収集ffer 4℃でロッカーで30分間インキュベートした1ミリリットルピペットでよく懸濁物を混ぜる。これを小片にマトリゲルを破壊し、細胞収穫バッファに細胞の大部分を解放します。 </li><li>培養遠心機で200×gで細胞をペレット化。 P200のピペットチップでペレット化した細胞からのヒドロゲルの浮遊層を除去する。 </li><li>キットで提供SDSサンプル緩衝液中で溶解物を再懸濁する。 RIPA溶解緩衝液を使用することもできる。 </li></ol>悪性対良性乳房表現型の4。定量<ol><li>ステップ2.1から2.4以下の各治療セットに対して三連で細胞を成長させる。 </li><li>スライドシフタと、コンピュータに取り付けられた位相差顕微鏡を用いて5倍または10倍の解像度で各ウェルから腺房構造の位相コントラスト画像を撮影する。別のフレームからスライドを移動するため、チャンバースライドのウェル全体を覆うことにより、画像を取る。 </li><li>腺房構造の合計数をカウントし、シングルラウンドフラット腺房およびmultiacinar構造や組織を欠いて無計画に成長している構造の数の、それから発せられる分岐プロセスと数。 </li><li>棒グラフのような単一のラウンドフラット腺房構造の割合対悪性の構造とプロットを計算します。スチューデントのt検定で有意差を計算します。 </li></ol>

<ol><li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma+in+breast+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).</li>
<li>Rosen, P. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosen%2C+PP+%22Rosen%27s+breast+pathology%22">Rosen's breast pathology</a>. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).</li>
<li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1%2Fp38+pathway%2C+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li>
<li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-%CE%B2+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li>
<li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth%2C+progression%2C+and+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li>
<li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li>
<li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li>
<li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype%2C+gene+expression%2C+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

ここでは、再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養および悪性対良性乳房表現型を区別するために、このシステムの有用性を記載している。このシステムはまた、他の腺組織由来の培養物の異なる細胞型に使用することができ、いくつかの正常12-14に名前を付けるために、培養前立腺上皮、気管支上皮、および甲状腺上皮細胞に使用されてきたことが報告されている。 3D培養の重要性は、それが生理学的に関連するモデルであるという事実にある。 3D培養は、悪性形質転換の間に腺構造の破壊につながる分子メカニズムへの洞察を得るための手段を提供する。それはまた、癌を治療するための新規治療標的をスクリーニングすることに役立つ可能性が現用モデル系を提供する。2D培養物において有効であることが見出されている多くの薬物は、しばしば、実験的および臨床的applictaiにほとんど影響を及ぼさないアドオン15。このような三次元培養としてインビボで化合物の効果を予測するための重要な前臨床ツールを提供することができる。 3D文化は...

再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養（3D）は、複雑な表現型および正常乳房および乳癌2,3の関連するシグナリングを研究するための重要なモデル系である。乳房の機能ユニットは、腺房へ分岐する小さなダクトで構成され、端末のダクト小葉単位（TDLU）です。腺房は、基底膜によって囲まれている5つの細胞層、上皮細胞および筋上皮細胞からなる高度に組織化された構造である。正常な腺房の最も顕著な特徴は、細胞の分極、基盤となる基底膜への付着や、特殊な細胞間接触である。この複雑な組織は浸潤癌で破壊されている。細胞が単層として成長させた広く使用されている2次元培養は、腺房の形成を可能にしないでください。このように、単層培養上皮細胞との間の複雑な関係を捕捉するシステムを提供することに欠けている正常な乳房と乳がんでの規制緩和にある。乳房細胞の機能的単型上皮培養物をいくつかの研究室2,3に開発されている。三次元培養は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞由来の可溶化抽出物であり、市販されてマトリゲル上の乳房細胞の増殖を伴う。コラーゲンのような他の3D基層はIもまた使用される。乳癌細胞は、細胞がマトリゲル2で培養埋め込 ​​まれている3D埋め込 ​​みアッセイにより3次元で培養することができる。あるいは、細胞はまた、マトリゲルより少ない量を必要とし、位相コントラスト撮影によってコロニー形成の時間経過のモニタリングを容易にし、 その場イメージング 2 のために理想的であるように費用対効果のある、3Dオーバーレイアッセイ、いわゆる、トップアッセイに3Dで培養することができる-3。上部アッセイに3Dは腺房表現型および遺伝子発現プロファイル7との間の相関を定義するために使用されている。 3D文化がeffectivすることができますエリー浸潤癌から正常および良性の細胞を区別するために使用される。通常の良性乳腺細胞が浸潤癌細胞が内腔の無いクリアで多産し、無計画に成長する一方で成長がマトリゲル上の中心部にある、明確に定義されたルーメンと偏光構造を逮捕形成している。 E6/E7不死化ヒト乳腺上皮細胞および線維嚢胞性変化を有する36歳の患者から単離された自然発生的に不死化細胞株であるMCF10A細胞株は、正常な3D 3,8における良性乳房表現型を再捕捉するために使用されているとして役立ったいくつかの分子8,9の発癌と腫瘍抑制機能を研究するためのモデルシステム。これらの良性の細胞は、レンチウイルス/レトロウイルスを導入することによって、目的の遺伝子（単数または複数）を操作するために操作することができる。目的の遺伝子（群）は、腫瘍抑制因子である場合は、目的の遺伝子が良性細胞では癌遺伝子の過剰発現であるかのに対し、shRNAを媒介ノックダウンは、悪性形質転換につながる悪性の表現型を示すべきである。どちらの場合も、3Dで形成された腺房構造は、悪性形質転換をキャプチャすることができます。 3Dでメッキ良性単一細胞は増殖し、球状構造ラウンドフォルムを開始します。一日5-8による細胞のこの球状凝集体は、マトリゲルと接触している細胞の周囲の偏光層と、マトリゲルとの接触を欠く少ない極性細胞の内塊へと分化する。次の10〜15日に、内側の細胞はアポトーシスが明らかに管腔を形成することにより、死に始めます。悪性細胞は、それらの極性を失って無計画に成長します。悪性度の高い細胞は、通常、分岐構造を形成する。表現型におけるこれらの差異は、タイムラプス位相コントラスト撮影によりその場で関連する分子マーカーを用いた免疫染色によって捕捉することができる。最も一般的に使用されるマーカーは、増殖マーカーホスホ - ヒストン3およびapoptotと組み合わせて、α-6インテグリン、基底極性マーカーであるでICマーカーはカスパーゼ-3を切断した。後者は、腺房の中心、正常および良性の乳房細胞の機能における内腔の形成があるかどうかを決定することが重要である。他方の極性と細胞間接触マーカーはGM130、ラミニン、ERM、E-カドヘリンが含まれる。交互に乳癌細胞株は、目的の遺伝子を操作するために操作することができる。この場合、それ以上の成長への復帰は、良性の表現型は癌表現型と区別するために読むようにして使用することができ逮捕した。 三次元培養はまた、悪性形質転換注意深く10-11に関与するシグナル伝達経路を描写するために使用することができる。使用して、上記リードアウト、薬理学的阻害剤、遮断抗体又は組換えタンパク質を挙げるが悪性形質転換をもたらすシグナル伝達分子で突き止めることに使用することができる。種々の研究室からの継続的な努力とそれがRNAを単離し、また、免疫ブロット法および免疫のための溶解物を調製するために3Dから細胞を抽出することが可能であるnoprecipitation。これらの戦略は、プロトコルの段階的かつ詳細に説明されています。

<table><tbody><tr><td>成長因子の減少 マトリゲル</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td>凍結融解の繰り返しを避ける&nbsp;</td></tr><tr><td>Lab-Tek ガラス ハンバー スライド 8 ウェル</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>177402</td><td>氷上での予冷&nbsp;</td></tr><tr><td>Lab-Tekガラスチャンバースライド2ウェル&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>177380</td><td>氷上での予冷&nbsp;</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスF(ab&acute;)2 fragment</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-006</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>蛍光標識アレクサ抗体</td><td>分子プローブ 分子プローブ</td><td></td>のウェブサイト<td>をご覧ください</td></tr><tr>DAPI<td>分子プローブ</td><td>P36935</td><td></td>3D培養細胞<td>を使用した金色褪色防止試薬</td></tr>を延長してください<tr><td>収穫キット</td><td>Trevigen</td><td>3448-020-k</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Apha-6-integrin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MAB1378</td> 1<td>:100 希釈 for IF</td></tr><tr><td>Anti-GM130</td><td>BD Biosciences</td><td>610822</td><td>1:100 dilution for IF</td></tr><tr><td>Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-222</td><td>1:100 dilution for IF</td></tr><tr><td>Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td><td>CellSignaling</td><td>9661s</td> 1<td>:50 希釈 (IF</td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td> 1<td>:200</td></tr></tbody></table>)

三次元文化：乳細胞の悪性形質転換正常対腺房アーキテクチャを研究するためのツール

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

浸潤性乳癌の転移に隣接する組織や性向の侵入を特徴とする悪性上皮性腫瘍の一群である。癌細胞とそれらの微小環境との間の信号の相互作用は、乳癌の成長および生物学的挙動1に強力な影響を与える。しかし、細胞外マトリックスからのこれらの信号の大部分が失われたり、細胞を単層として2次元培養（2D）で栽培されている場合、その関連性が代役されています。近年では、再構成基底膜上の3次元（3D）培養物は、良性および悪性の乳房細胞の組織構造を再現するための選択の方法として浮上している。 3Dで増殖した細胞は、細胞外マトリックスからの重要な手がかりを保持し、生理学的に関連するex vivoでのシステム2,3を提供する。注目すべきは、2次元4と比較して、3Dで増殖させたときの細胞は異なる挙動を示すことを示唆している証拠が増えている。三次元培養効果的に3関与良性乳房表現型から悪性表現型を区別するための手段として、および細胞および分子のシグナル伝達を支えるために使用することができる。良性の上皮細胞の顕著な特徴の1つは、頂端細胞質内腔に向かってであり、基底細胞質は基底膜上に載るように、それらが偏光されることである。このapico - 基底極性がでたらめに周囲の間質に浸透細管を吻合及び分岐の細胞崩壊と形成を特徴としている浸潤性乳癌で失われます。良性腺と浸潤癌との間に、これらの病理組織学的な違いは、3D 6,7で再生することができる。単一ラウンド腺房構造の定量のような適切なリードアウトを用いて、又は他の分子および細胞生物学技術と組み合わせて、細胞増殖、およびアポトーシスの極性が検証分子マーカーの発現を差動に、3D culturEは、より良い悪性形質転換の際に、責任あるシグナリングの輪郭を描くための細胞の変化を理解するための重要なツールを提供することができます。

3D培養物を効果的に良性の乳房からのヒト乳房上皮細胞の悪性の表現型を区別するために使用することができる。マトリゲル上にプレートし、単一の良性細胞が簡単に位相コントラストイメージングを用いて1つの平面内でラウンドフラット腺房として画像化することができる組織化球状構造として成長。マトリゲル上に播種単一の悪性細胞が、偶然に成長する非常に高い屈折率を示し、一平面内の画像に困難である。 図1に示すように、高転移性乳癌細胞株SUM149及びMDA-MB-231はそれらから発せられるプロセスと管状構造の分岐として成長するのに対し、良性HMEおよびMCF10A細胞は球状探し腺房を形成する。悪性形質転換を確認するために読み出され、腫瘍抑制因子としてまたは腫瘍プロモーターとして分子の機能を定義するために使用することができるように、良性の表現型からのそのような偏差を用いることができる。 図2は 、腫瘍抑制遺伝子CCN6 tのノックダウン（KD）に示すように、悪性形質転換をリガー。 HME細胞は、非常に早い段階から自分の組織を失うレンチウイルス媒介トランスフェクションによりCCN6の下に規制...

再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養は、良性乳房のインビボアーキテクチャを再現するために、良性乳房表現型から悪性の表現型を区別するために有用な方法である。重要なことに、このシステムは、他の組織に浸潤癌を研究するために適用することができる。

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

この手順の全体的な目的は、3次元培養システムを利用して、乳腺の良性表現型と悪性表現型を区別することです。まず、コントロール細胞と実験細胞を、8ウェルチャンバースライド上の成長因子低減Matrigel層に3連（triplicate）で播種します。次に、4日ごとに2% GFR Matrigelを含む新鮮な完全培地で交換を行い、腺胞様コロニーを10〜15日間成長させます。次に、3Dで育成したaser様コロニーの位相差画像を5倍の解像度で取得します。最終ステップとして、適切な分子マーカーを用いてaser様培養物を免疫細胞化学分析用に処理し、続いて中央断面におけるC2免疫染色したaser様コロニーの共焦点画像を取得します。最終的に、3D培養で育成した細胞の位相差画像と共焦点画像を用いて、細胞の表現型および分子レベルの変化を特定し、これにより良性の乳腺細胞と悪性細胞を区別します。2次元培養や浸潤・遊走アッセイなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、良性乳腺の組織構造および悪性転換に伴う組織構造の喪失を再現できる点にあります。したがって、本手法を用いることで、良性の乳腺細胞と悪性の乳腺細胞を効果的に区別することが可能です。この方法は、細胞表現型に対するシグナル伝達経路の欠損など、乳がん分野における重要な疑問への解答や、新たな発がん経路および腫瘍抑制経路の特定に寄与すると考えられます。実験を開始するために、成長因子低減（GFR）Matrigelを4°Cで一晩かけて融解させます。次に、完全HME培地を37°Cで温め、8ウェルチャンバースライドを氷上に置いて冷却します。あらかじめ冷却したスライドの各ウェルの中央に、GFR Matrigelを40 µLずつ加えます。P 200 ピペットチップを用いて、気泡が入らないように、またメニスカス形成の原因となる広げすぎに注意しながら、ゲルをできるだけ均一に広げます。その後、スライドを 37 °C、5% CO2 の条件下でインキュベートし、Matrigel を凝固させます。Matrigel が凝固している間に、HME 細胞をトリプシンで剥離させ、15 mL チューブに回収し、150 ×g で 4 分間遠心分離します。細胞数をカウントし、完全培地を用いて 12,500 cells/mL に希釈します。細胞懸濁液に GFR Matrigel を最終濃度 2% となるように添加し、この溶液を 400 µL ずつ、あらかじめコーティングしたチャンバースライドの各ウェルに加えます。その後、スライドをCO2バッファーインキュベーターに入れます。15日間、4日ごとに完全培地を新鮮なものに交換してください。阻害剤を用いた研究では、播種時に完全培地に低分子阻害剤を添加し、その後、細胞の増殖を開始させるために3日ごとに阻害剤を補充した新鮮な培地で交換しま

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定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。...

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

このビデオでは、細胞とマトリックスの相互作用を研究するための肺癌細胞の3D培養の技術について説明しています。このプロトコルでは、TUM622 肺がん細胞の 3D 培養を行い、in vitro...

肺癌細胞の3次元培養:細胞-マトリックス相互作用を研究する方法

標準的な培養法では、細胞は、それらの生理的環境から採取し、皿のプラスチック表面上に成長した。初代ヒト骨髄細胞の挙動を研究するために、我々は、細胞が組織の天然の微小環境をrecapitulating条件下で増殖される3-D培養系を作成した。...

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

この資料は、乳癌細胞の浸潤を定量化するための3次元（3D）のアッセイの使用のための詳細な方法論を提供する。具体的には、細胞が侵入したときに発生する膜の完全性の喪失を検査するためにこのようなアッセイ、定量化、およびデータ分析だけでなく、メソッドを設定するために必要な手順を説明します。...

3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

ここでは、多細胞相互作用やがん細胞の挙動の細胞外マトリックス依存性調節を調査するのに役立つ、3次元での共培養のプロトコールを紹介します。この実験モデルでは、ヒトのがん関連線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル上でがん細胞を培養します。...

腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

私たちは、酸素と栄養素を送達するために灌流バイオリアクターシステムを使用して培養できる3D乳がん代理を生成する方法を示します。成長後、代理母体を固定し、目的のパラメータの評価のためにパラフィンに加工します。そのようなパラメータの1つであるセル密度の評価について説明します。...

の調製と分析<em&gt;インビトロ</em&gt;三次元乳癌サロゲート

がん細胞をコラーゲンゲルに包埋し、その後、無細胞フィブリンゲルに挟み込むことで、浸潤性と衛星腫瘍の形成をモニタリングできる3D培養システムを生成します。...

癌細胞の浸潤や衛星腫瘍形成を探検するための三次元培養アッセイ

ここでは、乳癌、がん細胞同様単球とコラーゲン分解、免疫細胞の動員、セルなど成果の直接的/間接的相互作用の研究としての形態を分析する三次元培養法について述べる侵略、および炎症の癌関連のプロモーション。...

単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム

このプロトコルは、ヒト乳腺細胞の形質転換を評価するための実験的なインビトロツールを提供する。細胞増殖率、アンカレッジ非依存性増殖能、基基膜マトリックスを用いた3D培養における細胞系統の分布をフォローアップするための詳細なステップについて説明する。...

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

本プロトコルは、血小板活性化因子(PAF)誘導形質転換を研究するために改変された非形質転換乳房上皮細胞株MCF10Aの3D...

三次元培養におけるリン脂質メディエーター誘導形質転換

学ぶ三次元培養システムを用いた乳細胞の良性と悪性表現型の識別法。Matrigel上で細胞を培養し、位相差顕微鏡と共焦点イメージングで形態変化を解析することで、乳がんの生物学的理解を深めます。

三次元文化：乳細胞の悪性形質転換正常対腺房アーキテクチャを研究するためのツール

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