三次元文化：乳細胞の悪性形質転換正常対腺房アーキテクチャを研究するためのツール
2014年4月25日
再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養は、良性乳房のインビボアーキテクチャを再現するために、良性乳房表現型から悪性の表現型を区別するために有用な方法である。重要なことに、このシステムは、他の組織に浸潤癌を研究するために適用することができる。
この手順の全体的な目標は、良性乳房表現型と悪性乳房表現型を区別する手段として三次元培養システムを利用することです。これは、まず、8ウェルチャンバースライド中の成長因子還元マトリゲルの層上に、コントロール細胞と実験細胞を三重にプレーティングすることによって達成されます。第2ステップは、4日ごとに2%GFRマトリゲルを使用して新鮮で完全な培地交換を行い、アシニン様コロニーを10〜15日間成長させることです。
次に、3Dで成長したAser様コロニーの位相コントラスト画像を5倍の解像度で取得します。最後のステップは、関連する分子マーカーを用いた免疫細胞化学分析のためのaser様培養物を処理し、続いて中央部のC中の2つの免疫染色aser様コロニーの共焦点画像を取得することです。最終的に、3D培養で増殖した細胞の位相差と共焦点画像を使用して、細胞の表現型と分子の変化を特定し、良性の乳房細胞と悪性細胞を区別します。
この技術の主な利点は、二次元培養、浸潤または移動アッセイなどの既存の方法よりも優れている点であり、良性乳房の組織構造と悪性形質転換中の組織の喪失を再現できることです。したがって、この技術は、良性乳房細胞を悪性乳房細胞と区別するために効果的に使用することができる。この方法は、細胞表現型におけるシグナル伝達経路の欠損や、新たな発がん性および/または腫瘍抑制経路の特定など、乳がん領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。
実験を開始するには、成長因子を減少させるか、摂氏4度で一晩でGFRマトリゲルを解凍します。次に、完全なHMEメディアを摂氏37度でウォームアップし、氷の上に8ウェルチャンバースライドを置いて冷却します。予冷したスライドの各ウェルの中央に40マイクロリットルのGFRマトリゲルを追加します。
P 200ピペットチップを使用してゲルをできるだけ均等に広げ、気泡やメニスカスの形成につながる可能性のある過度の広がりを避けます。次に、マトリゲルがトリプシンアイ、HME細胞を固化している間に、スライドを摂氏37度と5%CO2でインキュベートすることにより、マトリゲルを固化し、15ミリリットルのチューブにそれらを収集し、重力の150倍で細胞を4分間回転させ、細胞をカウントし、ミリリットルあたり12,500細胞に希釈します。完全な培地では、GFRマトリゲルを最終濃度2%で細胞懸濁液に加え、予めコード化されたチャンバースライドの各ウェルに400マイクロリットルの溶液を加えます。
次に、スライドをCO2バッファーインキュベーターに入れます。メディアを 15 日間、4 日ごとに新しい完全なメディアと交換します。阻害剤の研究では、プレーティング時に低分子阻害剤を完全な培地に添加し、その後、3日ごとに阻害剤を補充した新しい培地を交換して、細胞の成長を開始し、各治療セットでトリプリケートします。
スライドシフターとコンピューターに取り付けた位相差顕微鏡を使用して、各ウェルから5倍の分解能でaser構造の位相コントラスト画像を撮影します。スライドをあるフレームから別のフレームに移動し、チャンバースライドのウェル全体を広く覆って画像を撮影します。アセリング構造の総数、単一の丸いフラットアシニンの数、およびマルチアセリング構造または組織化されていない無計画に成長している構造の数を数えます。
また、分岐プロセスを発散して、単一の丸いフラットアセル構造と悪性構造の割合を計算し、情報をプロットします。縦棒グラフとして。両側の不対応のスチューデントT検定によって有意性を計算します。
免疫蛍光染色用の試薬を調製します。これは、添付のテキストプロトコールに記載されているとおりです。次に、P 200ピペットを使用して、コンディショニングされた媒体を慎重に吸引します。次に、ASINまたは構造を新たに調製した2%パラホルムアルデヒドで固定後20分間室温で固定し、0.5%トリットン×100で細胞を4°Cで10分間浸透させます。
次に、各洗浄ごとに10〜15分間、100ミリメートルのグリシンで培養物を3回洗浄します。次に、プライマリブロックバッファ内の細胞を室温で1時間ブロックします。次に、マトリゲル中のアミノ反応マウスIgG種をブロックするために、第2ブロッキング溶液とも呼ばれる一次ブロックバッファー内のヤギ抗マウスファブ2フラグメントのミリリットルあたり20マイクログラムで培養物をインキュベートします。
ブロッキング後、細胞を一次抗体と2回目のブロッキング溶液で摂氏4度で一晩インキュベートします。免疫蛍光バッファーまたはIバッファーで細胞を3回洗浄し、洗浄ごとに10〜15分間穏やかに揺さぶってください。次に、蛍光標識二次抗体と細胞をif Fバッファーで45分間インキュベー
トします。次に、細胞をif Fバッファーで各10分間3回洗浄し、穏やかに揺さぶる。DPI入りの退色防止試薬をスライドにセットし、核を可視化します。スライドを室温で一晩乾燥させます。
次に、マトリゲルの上で成長する細胞のコロニー中央部で共焦点画像を取得し、アスナー構造の全長にわたって一連の光学切片を、DPI染色HME制御細胞とC CN5日目の6ノックダウン細胞のzスタッキング共焦点画像を取得すると、ノックダウン細胞が組織化を欠いていることを示しています。15日目に、コントロール細胞は、分化したASINまたは構造と、ノックダウン細胞から分岐する明確な内腔で増殖が停止され、浸潤性分岐および尿細管表現型を示します。免疫蛍光染色は、ラミニンvαシックスインテグリンおよびECAヘリンの発現喪失を示し、それぞれ基底膜の破壊、基底極性の喪失、および細胞細胞の接触を示しています。
悪性細胞では、対照細胞は、α 6インテグリンのアシニン基底発現の周囲に無傷の層を示します GM one 30 および eca の頂端発現。ここで、細胞細胞接合部では、CCN 6ノックダウンHME細胞の悪性表現型が、精製された組換えヒトCCN 6タンパク質2つの高度に転移性の乳房細胞株、some 1 49およびM-D-A-M-B 2 31の外因性処理によって逆転しました。P 38マップキナーゼ阻害剤、SB2 0 3 8 50、およびSB2 0 2 1 90で治療し、悪性行動を減少させた。
このビデオを見た後、3D培養で乳房細胞を増殖させる方法と、良性乳房細胞と悪性乳房細胞の表現型を区別するための読み出しとしてマトリゲル上のシノ様増殖を効果的に使用する方法についてよく理解しているはずです。
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概要
本研究では、良性と悪性の乳腺表現型を区別するために、三次元培養システムを利用します。生体内（in vivo）の状態を模倣することで、乳がんに関連する細胞挙動や分子変化を解析することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 腫瘍学
背景
- 三次元培養システムは、組織構造をより正確に再現することができます。
- 良性細胞と悪性細胞の違いを理解することは、がん研究において極めて重要です。
- この手法は、さまざまな浸潤性癌の研究に適応させることができます。
- 免疫細胞化学的解析は、特定の分子マーカーの同定に役立ちます。
研究の目的
- 良性と悪性の乳腺表現型を区別すること。
- 細胞挙動の研究に3D培養システムを利用すること。
- 乳腺細胞における表現型および分子レベルの変化を解析すること。
使用された手法
- 8ウェルチャンバースライド上の成長因子低減Matrigelに細胞を播種する。
- コロニーの増殖を維持するため、4日ごとに培地交換を行う。
- コロニーの形態を観察するために、位相差顕微鏡像を撮影する。
- 免疫染色されたコロニーの詳細な解析には、共焦点イメージングを用いる。
主な結果
- 位相差顕微鏡像および共焦点顕微鏡像により、異なる細胞表現型が明らかになります。
- 免疫細胞化学的解析により、関連する分子マーカーが特定されます。
- この3D培養系は、良性細胞と悪性細胞を効果的に判別します。
- これらの知見は、他の組織における浸潤性癌に関する今後の研究に役立てることができます。
結論
- 3D培養システムは、がん研究における有用なツールです。
- これにより、乳がんの生物学的理解が深まります。
- 今後の応用により、他の種類の癌腫への展開が期待されます。
よくある質問
産業界における有用性
三次元培養システムは、単層培養システムでは失われる組織構造を再現することで、乳がんの進行を研究するための生理学的に適切なex vivoモデルを提供します。このアプローチにより、定量可能な腺腔形態や分子マーカーの発現を通じて、良性表現型と悪性表現型を区別することができ、がん遺伝子経路のメカニズム的なリスク低減が可能になります。本手法は、細胞外マトリックスのシグナルと細胞形質転換イベントを関連付けることで、初期創薬におけるターゲットバリデーションや表現型スクリーニングを支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索および標的バリデーション
- 科学的価値： 悪性転換時における頂端-基底極性の喪失および基底膜の完全性の崩壊を明らかにすることで、治療仮説を検証する。
- 運用の価値： ラミニン、α6インテグリン、E-カドヘリンなどの検証済みマーカーの差次的発現を通じて、機能的なターゲットバリデーションを可能にする。
- 予測的価値： パスウェイ活性の表現型リードアウトとして、単層の腺胞構造と侵襲的な分枝状管状構造を定量化し、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 細胞外マトリックス依存性シグナリングを10～15日間維持することで、化合物評価のための標準化された生物学的システムを構築します。
- 定量的な出力： ヒット化合物の検証に向けた、腺房構造の形成、分枝形態、および免疫蛍光法に基づくマーカー発現の測定を可能にします。
- プラットフォームの再利用： チェンバースライドへの3連プレート配置と再現可能な培地交換スケジュールの導入により、拡張可能なスクリーニングワークフローをサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性：吻合管や間質浸潤パターンなど、良性腺と浸潤性癌の組織病理学的相違をモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性：増殖、極性、アポトーシスの分子マーカーを介して、探索段階の表現型観察を前臨床検証へと結びつけます。
- メカニズムのリスク低減：微小環境依存的なコンテキストにおいて、分子的な摂動を表現型のアウトカムに関連付けることで、オンコジェニックパスウェイ（例：CCN6、p38 MAPK）におけるシグナル伝達不全を明確にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、疾患に関連したシステムを提供することで、組織構造および分子表現型に対する化合物の影響を評価し、標的仮説の検証からリード化合物の特定に至る創薬の連続的なプロセスへと統合されます。
- 発見生物学：遺伝的または薬理学的な摂動後の腺房組織における表現型の変化を定量化することで、パスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：コロニー形態の位相差画像および免疫染色構造の共焦点解析を通じて、アッセイの標準化と再現性を実現します。
- 分析：定量的な従属変数（例：単一円形腺房の割合、マーカー発現強度）を算出し、条件間の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：基底膜の完全性と関連する極性分子および接着分子の発現を追跡することで、バイオマーカーの開発に寄与します。
- 企業の再利用：複数の乳がんモデル、および潜在的に他の癌腫における細胞外マトリックスの影響を研究するための、再利用可能なプラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞外マトリックスの喪失が、細胞の組織崩壊および浸潤性表現型にどのように寄与するかを明らかにすることで、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用の価値：標準化されたMatrigelの播種、培地交換の頻度、および定義された解像度でのブラインド画像取得により、再現性を確保する。
- 戦略的価値：パスウェイの有効性に対する早期の表現型アンカーを提供することで、代替エンドポイントへの依存を減らし、go/no-go決定の精度を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：3D培養の表現型を悪性腫瘍の既知の組織病理学的特徴と相関させることで、リスク調整済みの研究推進を可能にする。
実施上の留意点
- 正確な表現型評価には、細胞外マトリックスの取り扱い、免疫蛍光染色、および共焦点顕微鏡解析の専門知識が必要です。
- 成長因子低減Matrigel、位相差および共焦点イメージングシステム、ならびに極性と接着マーカーの検証済み抗体パネルへのアクセスが必要です。
- 画像取得プロトコル（例：5倍位相差、z-stack共焦点）のチーム間での標準化、および腺胞構造分類の盲検解析が必要です。
- 異なる細胞株や腫瘍モデルに移行する際は、特にMatrigelの濃度や成長因子の添加に関して、適応上の検討事項が含まれます。
- 腺胞形成効率の変動や、形態観察以外で浸潤能を確認するための相補的なアッセイの必要性といった、実用上の制限事項が含まれます。
