3次元組織学ボリュームとマウス乳腺研究への応用再建

本ビデオの目的は、乳腺細胞のマクロ構造の変化を研究するため、3次元組織学に向けた画像レジストレーションアプローチおよびボリューム再構築法を提示することです。このため、野生型およびインスリン様成長因子結合タンパク質7（IGFBP7）欠損マウスから、授乳開始3日後に乳腺を摘出します。その後、乳腺を処理し、切片作成のためにパラフィンブロックに包埋します。

次に、組織ブロックの光学的な前面画像を撮影し、組織ブロックを薄切します。切片の画像を撮影し、カスタムソフトウェアを用いて各切片を対応する前面画像と整合させることで、乳腺の組織学的ボリュームを再構築します。得られたデータにより、変異型と野生型の乳腺におけるサイズの差が明確になります。

3次元共焦点二光子顕微鏡法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、はるかに広い空間範囲の情報を提供できる点にあります。また、この手法は、ボリューム医療イメージングや治療における新しい技術やアルゴリズムの調査および検証だけでなく、さまざまな臓器の高解像度3D解析の作成にも利用可能です。このように再構成された組織学的なボリュームは、レジストレーション誤差の累積がない、処理済み検体の信頼性の高い表現を提示します。

IGF P seven欠損マウスでは産子数が少なく、繰り返し大きな産子数を維持できないことに気づいたことから、まずこの手法を考案し、乳腺の構造を調査することにしました。組織をパラフィンに包埋した後、ロータリーミクロトームを使用して、余分なパラフィンが除去されるまでブロックをトリミングします。次に、垂直切削機を用いて、カセット台座に対して垂直に、パラフィンブロックの少なくとも2つの角に1 mmの穴を開け、組織ブロックをロータリーミクロトームに固定します。

次に、ミクロトームの前面にブロック面イメージングシステムを設置します。テレレンズを装着したカメラを、組織ブロックの表面からわずかに角度をつけた位置に配置してください。カメラはミクロトームの前にあるコンピュータに接続されている必要があります。その後、ブロックの前面に光源を配置し、ブロックからの反射光をカメラで捉えられるようにします。

ブロック表面の組織が周囲のパラフィンと容易に区別できるまで、カメラの角度を調整します。光学的なブロック面画像を1枚撮影します。次に、ミクロトームを用いて、厚さ5 µmの切片を4枚、リボン状に切り出します。

リボンを冷水バスに移し、リボンの各セクションを分離させた後、2番目と4番目のセクションを冷水からスライドガラス上にすくい上げます。その後、それらを温水バスに移してしわを伸ばします。2番目と4番目のセクションを選択することで、セクション間に5 µmの隙間を設けることができます。

しわが伸びたら、すくい上げるようにして切片を顕微鏡スライドに再マウントします。前述の通り、切片の作製、マウント、およびしわ伸ばしの過程で、断裂、折り畳み、収縮、膨張などの歪みが生じる可能性があることに注意してください。これらのアーティファクトは、組織切片のレジストレーションを困難にします。

オートステイナーを用いて、切片を H&E 染色します。次に、オートカバースリッパーを用いてスライドをカバーガラスで封入し、デジタル組織スライドスキャナーを使用して、目的の解像度でスライドをデジタル化します。本プロトコルでは、倍率は 20 x、解像度は 0.47 microns としています。

このビデオのセクションでは、当研究室で開発したカスタムソフトウェアとMATLAB C++を組み合わせて行う画像レジストレーション（画像位置合わせ）プロセスの概要を説明します。ITKを用いて、まず組織切片画像をブロック面画像の解像度までダウンサンプリングします。これにより、組織切片画像は0.026倍に縮小されます。

次に、画像セグメンテーションとポイント選択を行うため、数枚のブロック面画像をMATLABで開き、データカーソルツールを用いてレジストレーションホールのピクセル値を測定します。レジストレーションホールをセグメンテーションするために、平均ピクセル値を固定しきい値として使用します。不要なセグメントを除去するには、セグメント化されたオブジェクトの円形度と面積を利用して、ホールのみを保持し、その他のセグメントを削除します。

次に、各乳腺について、基準となるブロック面画像を1枚選択します。残りのブロック面画像のレジストレーションホールの中心を、基準画像のレジストレーションホールの中心に合わせて調整します。その後、レジストレーションホールで得られた変換を用いて、ブロック面画像を位置合わせします。位置合わせされたブロック面画像について、hおよびdセクションの組織を背景から手動でセグメンテーションまたは抽出します。

Otsuの二値化手法を用いて画像を背景からセグメンテーションし、組織学的画像のバイナリマスクを作成します。次に、ラベル付けされたオブジェクトのヒストグラムを用いて、各マスク内で最大のオブジェクトを特定し選択します。組織学的マスクとブロックフェイスマスクの両方から、幅1ピクセルの境界点を抽出します。

次に、フーリエ記述子アルゴリズムを使用して、組織切片の境界点とその対応するブロックフェイス画像との間の初期剛体変換を求めます。この初期変換には、平行移動、回転、およびスケール因子が含まれます。前のステップで得られた初期変換を用いて、各組織切片画像を変換します。

剛体レジストレーションを精緻化するため、ローリングボールフィルターを用いて組織切片の輪郭から曲率の高いエッジ部分を除去します。次に、一様分布を用いて、残りの組織切片の境界点から500点をランダムに選択します。フーリエ記述子から得られた初期変換を用いて、組織切片の境界点を変換します。

ブロック面境界点を用い、反復最近接点（ICP）アルゴリズムを使用して、ブロック面境界点と組織学的画像との間の剛体変換を求めます。境界点はランダムに選択します。次に、前ステップで得られた組織学的画像を変換し、3D可視化ソフトウェア内で組織学的ボリュームの可視化画像を作成します。

Me vis labで、「modules」から「file miscellaneous」を選択し、「composed 3D from 2D files」モジュールを追加します。次に、メニューから「image」を選択し、「image property convert」モジュールを追加します。最後に、「modules」の「visualization 3D viewers」から「view 3D」モジュールを追加します。

「compose 3D from 2D files」をダブルクリックして画像を読み込み、「create 3D」をクリックします。「image property convert」をダブルクリックしてボクセルサイズを調整し、ボクセルサイズを0.018 0.018 0.01に設定します。「view 3D」をダブルクリックしてボリュームを表示します。

最後に、付属ドキュメントの手順に従い、5倍の倍率で画像スタックを確認します。IGFBP7欠損マウスの欠損特性をより詳細に評価するため、以下に述べる方法で乳腺の3D再構成を行いました。これらの図は、野生型および欠損マウスの乳腺の再構成された組織学的ボリュームを示しています。

右側の変異腺は左側の野生型よりも短く幅が狭いですが、深さはほぼ同じであり、野生型の腺は1.06 mm、ヌル腺は1.02 mmです。また、左側の野生型腺ではエオシン染色のピンク色で示される間質組織がほとんど見られないのに対し、右側のヌル腺は主に間質組織で構成されているように見えることに注目してください。ここでは、有核細胞を同定するヘマトキシリン・エオシン染色により、野生型腺が主に腺構造を含んでいるのに対し、ヌル腺はその密度を維持していることが示されています。

これをさらに詳しく調べるため、リンパ節領域の高解像度画像をここに並べて示しました。乳汁で満たされていたと考えられる大きな構造が見られます。対照的に、IGFBP7ヌル腺には、十分に発達した構造がほとんど見られません。

さらに、これらの構造には線維芽細胞のような細胞が密集しています。このビデオを視聴することで、連続切片のスキャン画像を再構築し、臓器の3D再構築を作成する方法を十分に理解できるはずです。さて、この手順を試みる際は、スライドとスキャンの数が非常に多くなるため、一貫した命名を行い、順序立てて整理することが、この手順を成功させる鍵となる重要なポイントです。

特定の細胞マーカーや疾患マーカーに対する免疫組織化学染色などの他の手法を用いることで、「血管がどのように腫瘍に浸透しているか」といった追加の問いに答えることが可能です。