タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

本実験の全体的な目的は、無傷のタバコ葉で発現させた2つのタンパク質の相互作用をモニタリングすることである。これは、適切なコンストラクトを設計し、目的の2つの遺伝子を分割蛍光タンパク質に融合させ、これらのコンストラクトをアグロバクテリアに形質転換することで達成される。第2ステップとして、アグロバクテリアの培養液を混合してタバコ葉に注入することで、タンパク質が発現し、再構成された蛍光シグナルが得られる。

タンパク質同士が近接した場合、次に、葉全体または単離したプロトプラストを顕微鏡下で解析します。蛍光顕微鏡によって検出された蛍光信号に基づき、タンパク質間相互作用を示す結果が得られます。共免疫沈降法や酵母ツーハイブリッド法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、生きた植物細胞内でタンパク質間相互作用を直接的に観察できることです。

この手法は、さまざまな細胞内コンパートメントにおけるタンパク質複合体の形成など、植物生物学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この手順を開始するために、タバコ葉の形質転換に使用するアグロバクテリアを培養します。滅菌済みの50 mLチューブ内で、目的のプラスミドを含むAG L1グリセロールストック培養液 50 µLを、適切な抗生物質を含む10 mLのLB培地に接種します。

28 °Cで少なくとも24時間、190 RPMで振盪しながら、翌日に培養液のOD 600が1.0から2.0に達するまでインキュベートします。細菌を3000 ×gで15分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを調製したばかりの浸潤用培地に懸濁し、懸濁液のOD 600を1.0に調整します。

タバコ葉への浸潤のため、アグロバクテリア細胞を室温・暗所にて、オーバーヘッドシェーカーで2時間インキュベートします。3週齢のタバコ植物から、成熟した葉を数枚選びます。等量を混合します。

目的のコンストラクトを保持するアグロバクテリウムをそれぞれ3 mL用意する。針のない5 mLシリンジに細胞懸濁液混合物を充填し、タバコ葉に浸潤させる。葉の裏側の数か所にシリンジを慎重に押し当て、植物に水を与え、遮光した状態で2日間保持する。

浸潤させた葉からプロトプラストを単離するには、まず葉をペトリ皿に入れ、調製したばかりの酵素溶液を加えます。新しいカミソリの刃を用いて、葉を約0.5平方センチメートルの大きさに切り分けます。次に、葉の断片を酵素溶液とともに真空装置に移します。

浸透用フラスコ。葉から気泡が出るまで、約20秒間真空浸透させます。真空状態を非常に慎重に解除してください。

90分後、室温、暗所で40 RPMで90分間フラスコを振とうします。90 RPMで1分間振とうし、プロトプラストを放出させます。溶液をガーゼでろ過し、15 mLのラウンドボトム遠心チューブに移します。

プロトプラスト溶液の上にFPCN緩衝液を2 mL加え、室温にて、緩やかな加速および減速で70 ×gで10分間遠心分離します。完全なプロトプラストは酵素溶液とFPCNの界面に蓄積します。広口の1 mLピペットチップを用いて、完全なプロトプラストを新しい遠心チューブに移します。この手順を成功させるため、完全なプロトプラストの破裂を防ぐために必ず広口チップを使用してください。

チューブにW five bufferを満たし、緩やかな加速・減速で100 ×gで2分間遠心分離します。プロトプラストを沈殿させるため、上清を慎重に取り除き、プロトプラストの量に応じて、約200 µLのW five bufferでペレットを再懸濁します。

レーザースキャニング顕微鏡用のプロトプラスト試料を調製するには、まず、顕微鏡スライドガラス上に約2cm間隔で2本の小さなシーラントストリップを配置します。ストリップの間に20 µLのプロトプラスト溶液を滴下し、慎重にカバーガラスを被せます。シーラントストリップにより、カバーガラスでプロトプラストが押し潰されるのを防ぐことができます。

レーザースキャニング顕微鏡観察用の葉の全層サンプルを調製するには、葉を1 cmの大きさに切り取り、葉の裏面を上にして顕微鏡スライドガラス上に置きます。水を約30 µL加えます。カバーガラスを被せ、両側を粘着テープでしっかりと固定します。

倍率を調整するため、MICCA type TCS SP fiveの共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてイメージングを行う。イメージング媒体としてグリセロールを用い、63倍の対物レンズを使用し、評価にはLeica application suite advanced fluorescentソフトウェアを使用する。アルゴンレーザーを30%に設定し、488 nmのレーザーパワーを強度18%に設定する。515 nmの信号をモニターするため、第1PMT検出器の放出帯域幅を495 nmから550 nmに設定する。

クロロフィルの自家蛍光をモニタリングします。2番目のPMT検出器の emission bandwidth を650から705ナノメートルに設定してください。M cherry シグナルをモニタリングするには、HENI 5 61 レーザーを使用します。

レーザー強度を18%に設定し、3つ目のPMT検出器の放出帯域幅を587〜610ナノメートルに設定します。すべてのPMT検出器チャンネルの画像が同じゲイン設定で撮影されるようにしてください。背景信号を除去するため、ゲインは800から900の間にする必要があります。

幅および高さ1024×1024ピクセル、走査速度100 Hzの形式で画像を収集します。Zスタック撮影では、各スタック間の最大距離を0.5 µmに設定します。本研究では、BFC法を用いて、細胞質分子シャペロンHSP 90と膜ドッキングタンパク質TPR7およびTPR64の相互作用をモニタリングしました。

この概略図に示すように、Venusは、小胞体に存在するTPR7、または葉緑体外膜に存在する64のいずれかの細胞質側部分に結合しています。Hsp90はN末端にSCFPが融合されており、これによりTOC64およびTPR7のTPRドメインがHsp90のC末端と相互作用することが可能になります。TPR7-Hsp90タンパク質複合体の局在を確認するための陰性対照として、SCFP単独を細胞質で発現させます。TPR7とHsp90は、小胞体マーカーと共に共導入されました。

コントロールとして、無傷の葉において蛍光をモニタリングしました。SCFPを、TPR7およびERマーカーと共に単独で発現させました。提示されたすべての画像において、スケールバーは10 micronsを表しています。

左側のパネルは、515ナノメートルでモニターした緑色の再構成された蛍光を示しています。小胞体（ER）マーカーは赤色で表示されています。中央のパネルには両方の信号のオーバーレイが示されており、右側のパネルにも同様に表示されています。

TPR7とHSP90の再構成シグナルをモニターしたところ、ERマーカーと重複し、黄色に表示されました。対照的に、TPR7のシグナルおよびCFPを用いた陰性コントロールでは、シグナルは観察されませんでした。次の例では、コントロールとして葉緑体タンパク質Tox64をHSP90と共発現させました。

Tox 64をSCFP単独で共発現させました。前回と同様に、緑色の再構成蛍光を515 nanometersでモニタリングしました。中央のパネルは、480 nanometersでモニタリングしたクロロフィルの自家蛍光を示しています。

両方のシグナルの赤色のオーバーレイを右側のパネルに示します。tox 64とHSP 90を共発現させた細胞では蛍光の再構成が観察されましたが、tox 64とSCFPのみを共発現させた細胞では観察されませんでした。

葉全体の顕微鏡写真ではtox 64およびHSP 90の正確な局在を特定することが困難であるため、蛍光顕微鏡観察用に、浸潤させたタバコ葉からプロトプラストを単離しました。前述と同様に、再構成された蛍光を515 nmで、クロロフィルの自家蛍光を480 nmでモニタリングし、この重ね合わせ画像に示すようにオーバーレイ画像を作成しました。これにより、tox 64およびHSP 90が葉緑体を囲むリング状の構造として検出されることがわかります。

このビデオを視聴することで、コンストラクトの設計方法、タバコ葉への形質転換方法、および目的とする2つのタンパク質の相互作用を示す蛍光信号を最適に可視化する方法について、十分に理解することができます。