Name: タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学ぶ二分子蛍光相補法によるタバコ葉におけるタンパク質間相互作用の可視化手法。分割蛍光タンパク質を用いて生細胞内のタンパク質動態をリアルタイムで観察し、植物細胞生物学研究に応用する。

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私たちは、原稿の重要な読書のための有用な議論とクリスキャリーのためのユルゲン·Sollのに感謝したいと思います。このプロジェクトは、（SSに助成金​​番号SFB 1035、プロジェクトA04とRSに22分の187の操作を行います）、DFGとフォン·デア·chemischenインダストリーによって資金を供給された。

1。 BIFCの形質転換は、アグロバクテリウム中の構築<ol><li> BIFC構築物のクローニング<ol><li>隣接のattB-部位を含むオリゴヌクレオチドを​​用いて、適切なテンプレートから目的の遺伝子を増幅する。プルーフリーディングポリメラーゼを用いてPCRを行う。フラグメントサイズに応じて設計したプライマーの組み合わせ、および伸長工程の長さにアニーリング工程の長さを適合させる。アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を確認し、PCRクリーンアップキットを使用して、それを精製する。 </li><li>得られた断片とのBP反応とBPリコンビナーゼを使用して、エントリーベクターを実行します。エントリーベクターの150 ngののattB-PCR産物の15から150 ngのを混ぜて、BPリコンビナーゼの2μlを添加し、8μlの全量を、TE緩衝液でいっぱいに。 RTで1時間反応をインキュベートし、37℃で10分間、2μlのプロテ​​イナーゼKを添加することにより反応を停止</li><li> コンピテントに反応全体を変換する大腸菌 DH5α;細胞およびベクターへのDNA断片の正確な挿入のためにコロニーPCRによって得られたコロニーを選別。陽性プラスミドのDNA配列決定は、変異の有無を確認するために行われる。 </li><li> LRリコンビナーゼを使用して適切なデスティネーションベクターでLR組換えについて得られたエントリークローンを使用してください。デスティネーションベクターの150 ngのエントリーベクターの50〜150 ngのを混ぜて、1μlのLRリコンビナーゼを追加し、5μlの全量を、TE緩衝液でいっぱいに。 RTで1時間反応をインキュベートし、37℃で10分間、1μlのプロテ​​イナーゼKを添加することにより反応を停止</li><li>ベクターへのDNA断片の正確な挿入のためにコロニーPCRによりコロニーを得たコンピテント大腸菌DH5α細胞とスクリーンへの反応全体を変換します。 DNA配列決定は、この段階では必要ではない。 </li><li>高純度を確保するために、プラスミドミニキットを用いてプラスミドDNAを単離する。 </li></ol></li><li>化学的にコンピテントアグロバクテリウムの調製（AGL1株、リファンピシンおよびカルベニシリン耐性） <ol><li>ストリークうち保存培養からのアグロバクテリウムとは、28℃で24時間、成長する</li><li>単一コロニーを5ミリリットルのLB培地に接種し、28℃で一晩インキュベート</li><li>一晩培養物2mlを、50 mlのLB培地に接種し、OD 600が1.0 になるまで28℃で約4時間成長する。 </li><li> 4℃で15分間、3,000×gで細胞を遠心分離し、氷冷のCaCl 2（10mM）を1mlの滅菌ペレットを再懸濁する。このステップの後、氷上で細胞を維持する。 </li><li> -80℃で液体窒素とストアにすぐに凍結し、細胞のアリコート（100μL）を準備</li></ol></li><li>化学的にコンピテントアグロバクテリウムの変容<ol><li>氷上で有能AGL1細胞の1アリコートを解凍。細胞へのプラスミドDNAの1〜2μgのを追加します。 37℃で、氷上で5分間インキュベートし、液体窒素で5分間で5分間細胞とSに600μlのLB培地を追加28℃で4時間650rpmでメルルーサ</li><li> 8,000×gで1分間細胞を遠心分離し、上澄みを捨てる。適切な抗生物質を含むLBプレート上の残りのLB培地とプレートの50μlにペレットを再懸濁します。プレートをシールし、28℃で2日間インキュベートコロニーPCRによるプラスミドの存在のための画面コロニー。 </li><li>適切な抗生物質を含む5 mlのLB培地で1陽性コロニーを接種し、一晩28℃でインキュベートする。 500μlの50％滅菌グリセロールで一晩培養液500μlを混合し、-80℃で凍結</li><li>タバコの葉の一過性の形質転換のためにグリセロールストックから直接、適切な抗生物質を含むLB培地でアグロバクテリウムを接種する。 </li></ol></li></ol> 2。タバコ葉の一過性の形質転換<ol><li>アグロバクテリアの成長<ol><li>以下のストック溶液を調製：アセトシリンゴン（150ミリメートル、70で溶解％エタノール）、-20℃でアリコートとしてストアMES / KOH（0.1M）pHは5.7、4℃（長期保存中に細菌の増殖を防ぐために0.2μmのフィルターを通して滅菌フィルター）で保存し、 塩化マグネシウム（1 M）株、室温で保存する。 </li><li>無菌50mlチューブへの関心のプラスミドを含有するAGL1グリセロールストック培養液50μlとの適切な抗生物質を含む10mlのLB培地に接種し、1.0の間のOD 600まで、190 rpmで振とうし、少なくとも24時間、28℃でインキュベート-2.0に達した。 </li><li> 15分間3000×gで遠心分離菌。作りたての浸潤培地中のペレット[ 塩化マグネシウム（10ミリモル）、MES / KOH（10 mM）のpHは5.7、アセトシリンゴン（150μM）]を再懸濁し、OD 1.0の600にサスペンションを調整します。 </li><li>暗闇の中で2時間のオーバーヘッドシェーカーでアグロバクテリウム細胞をインキュベートする。次いで、細胞を浸潤のために使用することができる。 </li></ol></li><li>タバコの葉の浸潤<ol><li> 3を使用してください週齢のタバコ（ ベンサミアナタバコ ）の植物。浸透のためのいくつかの古い葉を選択してください。 </li><li>興味の構築物を運ぶアグロバクテリウム等容量（3ミリリットルずつ）混ぜる。浸透のための針なしに5ミリリットルの注射器を取る。いくつかの場所で、葉の下側に注射器を押すことによって、タバコの葉に慎重に細胞懸濁液に潜入。 </li><li>植物を水と2日間、暗闇の中でそれらを残す。 </li></ol></li></ol> 3。プロトプラストの準備タバコの葉のプロトプラスト調製は、クープら 16から適応し、わずかに変更した。 <ol><li>バッファの準備<ol><li> F-PCN媒体を準備します。マクロの塩は、[3（1012μg/ mlの）をKNO、塩化カルシウム2•2H 2 O（440μg/ ml）を、硫酸マグネシウム4•7H 2 O（370μg/ ml）を、KH 2 PO 4（ 170μg/ ml）を、NH 4-コハク酸[（20ミリモル、2Mの株式ゾルを調製ution]（コハク酸（236μg/ ml）を、およびNH 4 Cl水溶液（106μg/ mlの）を、溶解させてpHを5.8に調整）、マイクロ塩は、[EDTA-鉄（III）、Na塩（40μg/ mlの）× KJ（0.75μg/ ml）を、H 3 BO 3（3μg/ ml）を、のMnSO 4•H 2 O（10μg/ ml）を、硫酸亜鉛4•7H 2 O（2μg/ ml）を、 硫酸ナトリウムのMoO 4• 7H 2 O（0.25μg/ ml）を、 硫酸銅•5H 2 O（0.025μg/ ml）を、のCoCl 2•6H 2 O（0.025μg/ ml）を]、MES（390μg/ ml）を、グルコース（約80μgの/ ml）の浸透圧は550 mOsmで、pHは5.8（KOH）。 -20℃での分量を保存する</li><li> F-PINの媒体を準備し、F-PCNとしてではなく、グルコース利用のスクロース（約110μg/ ml）を、浸透圧は550 mOsmで、pHは5.8（KOH）の全成分。 -20℃での分量を保存する</li><li> 150のNaCl、125のCaCl 2、5mMのKCl、2mMのMES、浸透圧は550から580 mOsmで、pHは5.7（KOH）：W5メディアを準備します。 4℃で保存、C（長期保存中に細菌の増殖を防ぐために0.2μmフィルターで無菌フィルター）。 </li><li>プロトプラストを単離するための新鮮な酵素溶液（0.1グラムセルラーゼ、10ミリリットルのFピン0.03グラムのmacerozym）を準備します。 10分間、55℃で溶液をインキュベートし、室温まで冷却。 10ミリリットルの溶液に、10％のBSAを100μlを加える。 </li></ol></li><li>プロトプラストの分離<ol><li>ペトリ皿に1浸透させ、葉を置き、新​​鮮な酵素溶液を加える。約0.5cm 2サイズの断片に葉をカットする新しいカミソリの刃を使用しています。真空浸透フラスコに酵素液と葉の部分を転送し、気泡が（非常に慎重に解放真空）の葉から出てくるまで、真空を約20秒間浸透させる。 </li><li>暗闇の中で40 rpmで90分間、フラスコを振る。 </li><li> 90 rpmで1分間振とうすることによりプロトプラストを放します。 15ミリリットル遠心チューブ（丸底）にガーゼ（100μM）に溶液をろ過する。 </li&gt; <li> 2ミリリットル、室温で70 XG（緩加速と減速）で10分間のF-PCNバッファと遠心でプロトプラスト溶液を重ねる。 </li><li>プロトプラストを無傷の酵素溶液及びF-PCNの界面に蓄積する。新鮮な遠心管にそのままプロトプラストを転送し、W5緩衝液で一杯に広い開口部1ミリリットルピペットチップを取る。プロトプラストをペレットに100 XG（緩加速と減速）で2分間遠心分離する。 </li><li>プロトプラストの量に応じて、約200μlのW5バッファにピペット再懸濁ペレットを使用して、慎重に上清を除去します。 </li><li>常に完全なプロトプラストの破裂を防ぐために、広い開口部のヒントを参考にしてください。 </li></ol></li></ol> 4。レーザー走査顕微鏡<ol><li>試料調製<ol><li>顕微鏡用スライド（2センチメートル離れて）を中心に、シール材の二つの小さな細片を貼り付けます。ストリップ間のプロトプラスト溶液20μlを置き、慎重にカバーガラスを配置上に。シーラントストリップは、プロトプラストをカバーガラスで押しつぶされていないことを確認してください。 </li><li>総葉のサンプルについては葉から1cmの部分をカットし、上向きに葉の下側を顕微鏡スライド上に置きます。約30μlのH 2 Oを追加する上にカバーガラスを配置し、両面に粘着テープでしっかりと固定します。 </li></ol></li><li>共焦点イメージング顕微鏡の設定<ol><li> TCS SP5：イメージングは​​ライカ、型から共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて行われる。倍率ためのイメージング媒体としてグリセリンと63Xの大きさは、対物レンズ（HCX PL APO CS）を使用しています。開口数を1.3に設定します。ライカ·アプリケーション·スイート/評価のための高度な蛍光ソフトウェアを（補足データS1を参照）を使用します。 </li><li> 515 nmでの再構成BIFC信号を監視し、495から550まで1 PMT検出器の放射帯域幅を設定するために18％の強度に30％のアルゴンレーザーおよび488nmのレーザパワーを設定する。 </lI&gt; <li>クロロフィルの自家蛍光をモニターするには、650から705秒PMT検出放射帯域幅を設定。 </li><li> mCherry信号はヘリウムネオンレーザー561を使用し監視するために、レーザの強度百分の561から18と587から610まで三PMT検出器の放射帯域幅を設定。 </li><li>すべてのPMT検出器チャネルの画像は、同じゲイン設定（ゲインがバックグラウンド信号を除外するために800〜900の間でなければなりません）で撮影されていることを確認してください。 </li><li> 100Hzのスキャン速度で1024×1024ピクセルの形式幅/高さで撮影する。 </li><li> Z-スタッキングのために各スタック間0.5μmの最大距離を使用しています。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

BIFC実験を計画する際に、いくつかの点を考慮する必要があります。目的のタンパク質についての構造情報は必要ありませんが、トポロジー、膜貫通タンパク質で作業するとき知る必要がある。蛍光タンパク質は、同じ細胞内区画内に存在する又は相互作用を可能にするために、膜の同じ側に直面している。 N末端標的化配列を必要とするタンパク質を分析する場合、当然、唯一のC-末端タグを考慮することができる。それは、タグは、目的のタンパク質の適切な標的化または膜挿入を妨害することが可能であるので、それはGFP-タグ化タンパク質を発現させることによって、例えば、事前に細胞内局在性を試験することが望ましい。また、陰性コントロールは必ず含まれなければならない。この例では、唯一のサイトゾル中にSCFP Cを発現する構築物を生成した。しかし、相互作用することが期待されていない任意のタンパク質を陰性対照として使用することができる。適切な表現Oを確認するにはfは全く蛍光が表示されていない場合は特に、浸潤葉又はプロトプラストのタンパク質抽出物をSDS-PAGEおよびタンパク質発現に供することができる構築物は、各タグに対する抗体で確認することができる。 </...

タンパク質複合体の形成を研究およびインビボでの植物細胞におけるそれらの局在化は、セルラーネットワークを調査するために不可欠であり、シグナリングおよび代謝プロセス。 BIFCを直接生きた植物細胞1-5内でのそれらの天然の環境におけるタンパク質-タンパク質相互作用の可視化を可能にする。 BIFC中で再構成した蛍光タンパク質と蛍光タンパク質鉛の二非蛍光N-およびC-末端フラグメントの相補性に近づく。多くの異なる蛍光タンパク質の断片タンパク質相互作用を検出するために使用されており、 例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、化学的に三つの異なる残基6によって形成された発色団。蛍光タンパク質は、目的の両方のタンパク質に融合させることができる2つの非蛍光フラグメントを生じ、ループ又はβ-ストランド内半減することができる。アッセイは、任意の細胞内compartmeにおける相互作用を検出するために使用することができるntの遺伝子的に融合タンパク質を発現するように修飾することができる任意の好気的に成長する生物または細胞において。 2つのタンパク質が、細胞内で近接するようになった場合は、蛍光が再構成され、外因性蛍光団又は染料3を添加せずに顕微鏡によりモニターすることができる。 タンパク質は容易にタバコのアグロバクテリウム媒介形質転換を利用して表現することができるので、タバコ（ ニコチアナ·ベンサミアナ ） が発生構築物、葉、植物タンパク質との相互作用を可視化するための便利なモデル生物であることが証明された。アグロバクテリウムは、植物細胞に目的の遺伝子の伝達を媒介する酵素をコードする、いわゆるTiプラスミド（腫瘍誘発）を使用します。 BIFCは、可溶性のためだけでなく、すべての細胞区画内膜タンパク質のための十分に適用可能であり、成功して、生体内でのタンパク質相互作用識別するだけでなく、相互作用部位を分析するために、過去数年にわたり使用されてきた7-9タンパク質内。導入された遺伝子の発現の際に、蛍光タンパク質の相互作用は、例えば、小胞体（ER）などのより大きな細胞構造、原形質膜又は葉緑体に適している、葉を直接可視化することができる。しかし、より洗練された構造における局在化を監視するために、例えば、葉緑体エンベロープは、形質転換タバコの葉から単離されたプロトプラストの蛍光を可視化することが望ましい。 C-末端またはN-末端蛍光タグのいずれかを含むBIFCベクトルのセット10は、植物におけるBIFCアプローチのために使用されなければならない。後述のプロトコルは、テトラトリコペプチド反復タンパク質ドッキングToc64とAtTPR7は葉緑外側エンベロープそれぞれ小胞体、11-13に存在する含有（TPR）ドメインと細胞質ゾルの熱ショックタンパク質90（HSP90）の相互作用を研究するために使用した。この目的のために、HSP90は、Ctを融合させたSCFPのerminal一部（SCFP C）。タグは、N末端TPRドメイン型クランプするHSP90のC末端MEEVD結合モチーフのアクセシビリティを確保するためにシャペロンに融合した。並行して、ビーナス（金星N）のN末端 ​​部分は、それぞれ、ドッキングタンパク質Toc64とAtTPR7を含むTPRドメインの細胞質ゾルドメインに融合した。ネガティブコントロールとして、我々は細胞質ゾルに存在し、したがって、適切なコントロールであるだけにSCFP Cの可溶性C末端部分をクローニングした。 研究されたタンパク質の蛍光標識は、近接することにより、蛍光シグナルの再構成を可能にするために、同じ細胞区画に直面している。再構成された蛍光シグナルの局在を決定するために、異なる蛍光タグに融合されたマーカータンパク質の相互作用の細胞内局在を実証するために同時形質転換することができる。 mCherrryに融合ERマーカータンパク質は、同時に形質転換したAtTPR7 14に位置し、ER例。クロロフィルの自家蛍光はToc64例で葉緑のマーカーを務めた。これにより細胞質ゾルのHSP90シャペロンとそれぞれToc64とAtTPR7のin vivoでの相互作用だけでなく、タバコの葉を直接監視することができるだけでなく、相互作用の細胞内局在を調べることができる。 BIFCは、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究する他の方法に相補的なアプローチとして適している。免疫共沈降する又はインビトロプルダウン実験で比較し、例えば、特定の抗体は、目的のタンパク質に利用可能である必要はなく、タンパク質、特に膜タンパク質のために、挑戦することができる、組換えによってin vitroで発現される必要はない。蛋白質が融合した蛍光タグ15との相互作用によって捕捉されるので、また一時的な相互作用は、BIFCを用いてモニターすることができる。

<table><tbody><tr><td>3&#039;,5&#039;-ジメトキシ-4&#039;-ヒドロキシアセトフェノン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>アセトシリンゴン</td></tr><tr><td>セルラーゼ, Onozuka-R10</td><td>Serva</td><td>16419</td><td>from Trichoderma viridae</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10&nbsp;</td><td>Serva</td><td>28302</td><td>from Rhizopus sp.</td></tr><tr><td>GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11789-(020)</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11791-(020)</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609-250</td><td></td></tr><tr><td>pDEST-GWVYNE</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>ゲートウェイクローニング</td></tr><tr><td>pDEST-VYNE(R)GW</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>ゲートウェイクローニング</td></tr><tr><td>pDEST-SCYCE(R)GW</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gatewayクローニング</td></tr></tbody></table>

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

多くのタンパク質は他のタンパク質と一過性に相互作用するか、それらの生物学的機能を実行するために多タンパク質複合体に組み込まれる。二分子蛍光相補性（BIFC）は、植物細胞内でこのような相互作用を監視するin vivo法である。提示されたプロトコルで調べ候補タンパク質は、蛍光タンパク質の相補的な半分に融合され、各構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換を介して植物細胞に導入される。続いて、タンパク質を一過性にタバコの葉において発現され、復元された蛍光シグナルは、無傷の細胞における共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて検出することができる。これは、相互作用自体だけでなく可視化を可能にするだけでなく、タンパク質複合体の細胞内局在を決定することができる。この目的のために、蛍光タグを含むマーカー遺伝子は、従って、例えば、tのような細胞構造を視覚化する、BIFC構築物とともに同時発現され得る彼は胞体、ミトコンドリア、ゴルジ装置または原形質膜を小胞体。蛍光シグナルは直接葉表皮細胞において、または容易に形質転換されたタバコの葉から単離することができる単一のプロトプラスト、のいずれかでモニターすることができる。 BIFCは、理想的には、生細胞内でそれらの天然の環境の中でのタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために適している。しかしながら、発現が強力なプロモーターによって駆動されなければならず、相互作用パートナーを相互作用による機構を妨害する可能性があり、比較的大きな蛍光タグの融合物に変更されていることを考慮しなければならない。それにもかかわらず、BIFCは、例えば共免疫沈降、タンパク質-タンパク質相互作用、 インビトロでのプルダウンアッセイまたは酵母ツーハイブリッド実験を調査する他の一般的に適用される方法への優れた相補的なアプローチである。

この例では、膜結合タンパク質AtTPR7とToc64とサイトゾルの分子シャペロンHSP90との相互作用をモニターするためにBIFC法を用いた。 AtTPR7はSecトランスの一部であり、おそらくER膜への翻訳後転座のために分泌プレタンパクを提供し、サイトゾルシャペロンと相互作用する。同様に、葉緑体の外封筒にToc64は、HSP90に関連する葉緑体プレタンパクを受信することにより、翻訳後の輸入に作用する。両方のタンパク質は、HSP90のC末端MEEVDモチーフとの相互作用を媒介する細胞質ゾル露出TPRドメインを含む。 タンパク質は、蛍光タグは細胞質ドメインに結合し、従って、タンパク質の標的化および膜挿入を妨げないことを確実にする、ビーナスNにドッキングタンパク質を含有するTPRドメインを融合させる適切なデスティネーションベクターに特異的リコンビナーゼを用いてクローニングした。 HSP90、SCFP Cの場合</suC-末端MEEVDモチーフに干渉しないように、p&gt;は、N-末端に融合された（ 図1,2）。</strong...

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

本実験の全体的な目的は、無傷のタバコ葉で発現させた2つのタンパク質の相互作用をモニタリングすることである。これは、適切なコンストラクトを設計し、目的の2つの遺伝子を分割蛍光タンパク質に融合させ、これらのコンストラクトをアグロバクテリアに形質転換することで達成される。第2ステップとして、アグロバクテリアの培養液を混合してタバコ葉に注入することで、タンパク質が発現し、再構成された蛍光シグナルが得られる。タンパク質同士が近接した場合、次に、葉全体または単離したプロトプラストを顕微鏡下で解析します。蛍光顕微鏡によって検出された蛍光信号に基づき、タンパク質間相互作用を示す結果が得られます。共免疫沈降法や酵母ツーハイブリッド法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、生きた植物細胞内でタンパク質間相互作用を直接的に観察できることです。この手法は、さまざまな細胞内コンパートメントにおけるタンパク質複合体の形成など、植物生物学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この手順を開始するために、タバコ葉の形質転換に使用するアグロバクテリアを培養します。滅菌済みの50 mLチューブ内で、目的のプラスミドを含むAG L1グリセロールストック培養液 50 µLを、適切な抗生物質を含む10 mLのLB培地に接種します。28 °Cで少なくとも24時間、190 RPMで振盪しながら、翌日に培養液のOD 600が1.0から2.0に達するまでインキュベートします。細菌を3000 ×gで15分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを調製したばかりの浸潤用培地に懸濁し、懸濁液のOD 600を1.0に調整します。タバコ葉への浸潤のため、アグロバクテリア細胞を室温・暗所にて、オーバーヘッドシェーカーで2時間インキュベートします。3週齢のタバコ植物から、成熟した葉を数枚選びます。等量を混合します。目的のコンストラクトを保持するアグロバクテリウムをそれぞれ3 mL用意する。針のない5 mLシリンジに細胞懸濁液混合物を充填し、タバコ葉に浸潤させる。葉の裏側の数か所にシリンジを慎重に押し当て、植物に水を与え、遮光した状態で2日間保持する。浸潤させた葉からプロトプラストを単離するには、まず葉をペトリ皿に入れ、調製したばかりの酵素溶液を加えます。新しいカミソリの刃を用いて、葉を約0.5平方センチメートルの大きさに切り分けます。次に、葉の断片を酵素溶液とともに真空装置に移します。浸透用フラスコ。葉から気泡が出るまで、約20秒間真空浸透させます。真空状態を非常に慎重に解除してください。90分後、室温、暗所で40 RPMで90分間フラスコを振とうします。90 RPMで1分間振とうし、プロトプラストを放出させます。溶液をガーゼでろ過し、15 mLのラウンドボトム遠心チューブに移します。プロトプラスト溶液の上にFPCN緩衝液を2 mL加え、室温にて、緩やかな加速および減速で70 ×gで10分間遠心分離します。完全なプロトプラストは酵素溶液とFPCNの界面に蓄積します。広口の1 mLピペットチップを用いて、完全なプロトプラストを新しい遠心チューブに移します。この手順を成功させるため、完全なプロトプラストの破裂を防ぐために必ず広口チップを使用してください。チューブにW five bufferを満たし、緩やかな加速・減速で100 ×gで2分間遠心分離します。プロトプラストを沈殿させるため、上清を慎重に取り除き、プロトプラストの量に応じて、約200 µLのW five bufferでペレットを再懸濁します。レーザースキャニング顕微鏡用のプロトプラスト試料を調製するには、まず、顕微鏡スライドガラス上に約2cm間隔で2本の小さなシーラントストリップを配置します。ストリップの間に20 µLのプロトプラスト溶液を滴下し、慎重にカバーガラスを被せます。シーラントストリップにより、カバーガラスでプロトプラストが押し潰されるのを防ぐことができます。レーザースキャニング顕微鏡観察用の葉の全層サンプルを調製するには、葉を1 cmの大きさに切り取り、葉の裏面を上にして顕微鏡スライドガラス上に置きます。水を約30 µL加えます。カバーガラスを被せ、両側を粘着テープでしっかりと固定します。倍率を調整するため、MICCA type TCS SP fiveの共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてイメージングを行う。イメージング媒体としてグリセロールを用い、63倍の対物レンズを使用し、評価にはLeica application suite advanced fluorescentソフトウェアを使用する。アルゴンレーザーを30%に設定し、488 nmのレーザーパワーを強度18%に設定する。515 nmの信号をモニターするため、第1PMT検出器の放出帯域幅を495 nmから550 nmに設定する。クロロフィルの自家蛍光をモニタリングします。2番目のPMT検出器の emission bandwidth を650から705ナノメートルに設定してください。M cherry シグナルをモニタリングするには、HENI 5 61 レーザーを使用します。レーザー強度を18%に設定し、3つ目のPMT検出器の放出帯域幅を587〜610ナノメートルに設定します。すべてのPMT検出器チャンネルの画像が同じゲイン設定で撮影されるようにしてください。背景信号を除去するため、ゲインは800から900の間にする必要があります。幅および高さ1024×1024ピクセル、走査速度100 Hzの形式で画像を収集します。Zスタック撮影では、各スタック間の最大距離を0.5 µmに設定します。本研究では、BFC法を用いて、細胞質分子シャペロンHSP 90と膜ドッキングタンパク質TPR7およびTPR64の相互作用をモニタリングしました。この概略図に示すように、Venusは、小胞体に存在するTPR7、または葉緑体外膜に存在する64のいずれかの細胞質側部分に結合しています。Hsp90はN末端にSCFPが融合されており、これによりTOC64およびTPR7のTPRドメインがHsp90のC末端と相互作用することが可能になります。TPR7-Hsp90タンパク質複合体の局在を確認するための陰性対照として、SCFP単独を細胞質で発現させます。TPR7とHsp90は、小胞体マーカーと共に共導入されました。コントロールとして、無傷の葉において蛍光をモニタリングしました。SCFPを、TPR7およびERマーカーと共に単独で発現させました。提示されたすべての画像において、スケールバーは10 micronsを表しています。左側のパネルは、515ナノメートルでモニターした緑色の再構成された蛍光を示しています。小胞体（ER）マーカーは赤色で表示されています。中央のパネルには両方の信号のオーバーレイが示されており、右側のパネルにも同様に表示されています。TPR7とHSP90の再構成シグナルをモニターしたところ、ERマーカーと重複し、黄色に表示されました。対照的に、TPR7のシグナルおよびCFPを用いた陰性コントロールでは、シグナルは観察されませんでした。次の例では、コントロールとして葉緑体タンパク質Tox64をHSP90と共発現させました。Tox 64をSCFP単独で共発現させました。前回と同様に、緑色の再構成蛍光を515 nanometersでモニタリングしました。中央のパネルは、480 nanometersでモニタリングしたクロロフィルの自家蛍光を示しています。両方のシグナルの赤色のオーバーレイを右側のパネルに示します。tox 64とHSP 90を共発現させた細胞では蛍光の再構成が観察されましたが、tox 64とSCFPのみを共発現させた細胞では観察されませんでした。葉全体の顕微鏡写真ではtox 64およびHSP 90の正確な局在を特定することが困難であるため、蛍光顕微鏡観察用に、浸潤させたタバコ葉からプロトプラストを単離しました。前述と同様に、再構成された蛍光を515 nmで、クロロフィルの自家蛍光を480 nmでモニタリングし、この重ね合わせ画像に示すようにオーバーレイ画像を作成しました。これにより、tox 64およびHSP 90が葉緑体を囲むリング状の構造として検出されることがわかります。このビデオを視聴することで、コンストラクトの設計方法、タバコ葉への形質転換方法、および目的とする2つのタンパク質の相互作用を示す蛍光信号を最適に可視化する方法について、十分に理解することができます。

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タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

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