ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

次の実験の全体的な目標は、生きたゼブラフィッシュの胚における酸化ストレスを定性的および定量的に測定することです。これは、調製した胚に酸化溶液を添加して酸化ストレスを誘発するか、胚の尾鰭に創傷縁を作ることによって達成されます。次に、胚は、シングルセル法またはホールマウント法のいずれかによって酸化ストレス検出のために処理されます。

次に、調製物をRoss検出プローブでインキュベートします。結果は、ホールマウントの共焦点顕微鏡または単一細胞の細胞フルオロメトリック分析に基づいて、酸化ストレスの量とロスレベルを示すことができます。この手法が、オキシストレスマーカーの免疫蛍光剤のような既存の方法と比較した場合の主な利点は、生体の状況での生の検出と単一組織レベルでの定量を可能にすることです。

この方法は、病的状態の文脈での酸化ストレス状態の調査など、基礎研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。入院したばかりの個人は、生の敏感な分子プローブが計画外の酸性度の原因である可能性があるため、偶発的な組織損傷のために苦労する可能性があります。また、高レベルの酸化ストレスは細胞死につながるに違いないため、実践や実験で検出するのが難しすぎるかもしれませんが、これらの問題は自分自身でしか生じません DMSOで知られている腐敗物で構成されるミトコンドリアに酸化ストレスを誘発するための溶液を準備するとき、それは5〜50マイクロモルの濃度で腐敗した既知のストックで作られるべきであり、100マイクロモルを超えることは決してありません 腐敗したものは有毒で危険です。

ラベル付きの注意事項に注意してください。ホールマウントロス検出用のプローブ溶液は、調製中に光や酸素にさらされてはならず、シングルセルロス検出法用に新たに調製する必要があります。PBS中のFBSの停止溶液は、調製し、摂氏4度に保つ必要があります。

その他の調製には、ゼブラフィッシュのエアインキュベーターを摂氏28度に設定することや、シングルセル法では遠心分離機を摂氏4度に冷却することが含まれます。ゼブラフィッシュの交配、胚採取、麻酔などを行います。標準的な方法を使用して、受精後48〜72時間で目的の胚を採取します。

麻酔をかけた後、胚は麻酔薬を2回洗い流し、次に胚を3つの皿にロードし、1皿あたり30個以下で単一細胞の生を検出します。複数の皿で状態ごとに少なくとも35個の胚を収集します。次に、10ミリリットルの酸化剤溶液を塗布するか、またはネガティブコントロールとして塗布します。

10ミリリットルの水を適用し、胚が摂氏28度でインキュベートするまで10〜60分待ちます。また、洗濯のためにHBSSを摂氏28度に予温します。インキュベーション後、胚を温かいHBSSの新しい皿に移して渦巻きます。

次に、ホールマウントまたはシングルセルのRoss検出に進みます。より生理学的な選択肢は、NI Tomer氏らが説明した尾びれの傷害技術を使用して、組織の損傷後にストレスを発生させることです。酸化剤処理後、最大10個の胚のグループを小さなチューブに移します。

HBSSでしっかりとすすぎ、ホイルで光から保護します。次に、各チューブに1ミリリットルの生検出溶液を加え、インキュベート中にチューブを摂氏28度で15分間インキュベートします。コントロール条件と実験条件の両方を含むスライドガラスを準備します。

くぼみスライドを300マイクロリットルのメチルセルロースで覆います。メチルセルロースを排出する際に気泡を出さないでください。胚のインキュベーション後、チューブ内の溶液を2ミリリットルのHBSSとすばやく交換し、チューブを数回反転させて胚を洗浄します。

次に、胚をマイクロピペットの先端に吸引し、処理したスライドに静かに排出します。細いナイロンラインを使用して胚の向きを合わせ、蛍光顕微鏡または共焦点走査型顕微鏡を使用して分析を進めます。必ず同じ設定ですべての胚を分析してください。

HBSS洗浄液から新しい皿に胚を移し、できるだけ多くの溶液を取り除きます。次に、胚を手動でデコレーションします。これは、胚を単一の細胞に解離するために本当に必要です。

次に、胚を24ウェルプレートに移し、それぞれに15個の胚をロードします。ウェルは、各条件に対して3つのウェルを最適に充填します。次に、すべての溶液を取り出し、300マイクロリットルのHBSS、30マイクロリットルのコラゲナーゼp、および50マイクロリットルのトリプシンEDTAと交換します。

1ミリリットルのピペットチップを使用して、トリアーで胚を均質化します。すべてのウェルが準備されたら、プレートを摂氏28度に5分ごとに少なくとも20分間移し、サンプルを三分割して良好な均質化を確保します。また、マイクロフュージチューブを氷の上に置いて、準備ができたら組織を採取します。

20分後、サンプルを採取し、顕微鏡下で組織が単一細胞懸濁液に破壊されることを確認します。そうでない場合は、合計で最大30分間インキュベーションを続けます。組織の準備ができたら、さらに200マイクロリットルの停止溶液で反応を停止します。

これを1ミリリットルのピペットチップを使用してTRIと混合します。次に、各ウェルの内容物を事前に冷却したマイクロフュージチューブに移し、これらのチューブを氷上に光が当たらないように保ちます。次に、サンプルを250GSで摂氏4度で5分間遠心分離します。

そして、吸引によって上清を取り除きます。細胞ペレットを氷冷HBSSに穏やかなトライで再懸濁し、懸濁液に少なくとも200万個の細胞があることを確認します。次に、生の高感度プローブ溶液のミリリットルに細胞を再懸濁します。

室温で暗所で約3分間インキュベートします。このインキュベーション時間を経験的に調整します。次に、セルを光から遮蔽されたファックス管に移します。

ファックス解析を進めて、トランスジェニックマーカーを検出します。蛍光およびロスプローブの蛍光 分析中。バックグラウンド蛍光を正規化するために、コントロールサンプルと比較して倍率が増加するにつれて、常に損失レベルを計算します。

Mount Rossの検出はすべて、創傷部位での過酸化水素の蓄積を調べるために使用されました。無傷の尾部と損傷した尾部を、酸化剤処理の 20 分後に比較しました。どちらの条件でも非特異的なシグナルが検出されました。

過酸化水素レベルを下げるための胚の前処理に関する同じ実験。OX阻害剤VAs 28 70を用いて、検出されたシグナルが実際にロス蓄積腐敗に依存していることが明らかになった。既知の処理済み胚も全マウントで検査しました。

高倍率下では、解剖学的領域を特定できました。それは、ファックスによるロス陽性細胞の蛍光計数によって示されるようにロスを産生し、単一細胞ロス検出のために行った。この分析は、死細胞を含めずに実施しました。コントロール。

無処理の細胞も解析した。これらの結果を比較することで、ロス蓄積の定量化が非常に容易になりました。このアッセイは、任意の数の実験的操作をテストするのに優れていることが証明されています。

これをマスターすると、適切に実行すれば、テクニックは90分で完了することができます。分子プローブでの作業は非常に危険であり、先入観があることを忘れないでください。このような手袋の使用は、この手順を実行する間は常に行う必要があります。