回生研究ハーモニックナノ粒子
2014年5月1日
プロトコルの詳細は、 インビトロ第二高調波発生ナノ粒子でヒト胚性幹細胞を標識するために設けられている。多光子顕微鏡および心臓のクラスタへの分化によるヒトES細胞の研究のための方法論も提示されています。
次の実験の全体的な目標は、ヒト胚性幹細胞に由来する心臓ビーズクラスターを3Dリアルタイムかつ高空間分解能でin vitroでモニタリングすることです。これは、最初に胚性幹細胞を培養し、それらが胚体を形成するまで増殖させることによって達成されます。次に、ビートクラスターを解剖し、ポリテトラフルオロエチレンまたはPTFE多孔質フィルターでメッキすることで、長期的な空気として維持することができます。
その後、液体培養物を叩きつけたクラスターを高調波ナノ粒子で標識し、リアルタイムの多光子顕微鏡検査を行います。得られた結果により、空間的伸びと心臓収縮の頻度を顕微鏡スケールで分析できます。したがって、これらのナノ粒子の主な利点は、任意の波長、特に赤外線を使用できるため、組織のより深くまで進むことができ、時間の経過とともに非常に安定していることです。
そのため、長い時間枠で長いプロセスを監視できます。この幹細胞培養法は、心筋細胞の機能的収縮の分野における重要な疑問に3次元で答えるのに役立ちます。特に、心臓の成熟と組織工学。
個々の新しい疾患法は、高調波ナノ粒子による標識手順は多光子顕微鏡にのみ使用でき、他の種類のイメージングシステムには転送できないことに注意する必要があります。私たちが初めて高調波ナノ粒子を使用するというアイデアを思いついたのは、2005年のことでした。これらのナノ粒子は、蛍光色素や量子ドットに対して利点があります。
実際、その信号は時間の経過とともにフェードアウトすることはなく、長期間にわたってサンプルの現像を監視するために使用できます。サンプル調製の視覚的なデモンストレーションは、特に薬物試験を実施する際に、さまざまなステップの効率と再現性にとって重要であり、さまざまな組織や疾患にも適用できます。組織モデリング。
テキストプロトコルに従ってヒト胚性幹細胞またはESCを培養および増殖させ、それらを温かいコラゲナーゼとインキュベートした後、4回で10分間、コロニーフラグメントを2ミリリットルの新鮮な分化、培地またはDMに収集し、重力115倍で3分間遠心分離します。培養、コロニーの断片は超低アタッチメントで懸濁液で。6つのウェルプレートを4日間使用して、胚体またはebsを形成できるようにします。
次に、新たに形成したEBSを0.1%ゼラチンでコーティングした24ウェルプレートにプレートし、ビートクラスターが現れるまで15〜30日間プレートします。PBSを除去し、acutusを使用して、遠心分離と再投与後にコロニーを単一細胞に解離し、アグロあたり2ミリリットルのDM培地プレートに細胞を懸濁します。ウェルチャンバーでチャンバーを組み、摂氏37度で1日間インキュベートします。
新しく形成されたEBSを回収し、0.1%ゼラチンでコーティングされた24ウェルプレートにウェルごとに3つをプレート化します 培養で2〜4週間後。鼓動している心筋細胞のクラスターを特定し、細長い鋭くカットされたペーストピペットを使用して、手動でそれらを解剖します。インサートごとに4つのPTFEフィルターを堆積させ、それぞれを6ウェルプレートのウェルに入れます。
それぞれに1ミリリットルのDMを加えた後、各PTFEフィルターに解剖したビートクラスターを1つよく追加します。クラスターにラベルを付けるには、PTFEフィルターをビートクラスターとともに3.5センチメートルのガラス底皿に移します。1ミリリットルの第2高調波発生ナノ粒子を50マイクログラム/ミリリットルで加え、摂氏37度で30分間インキュベートして非線形光学イメージングを行います。
標識されたHEBまたは心拍動クラスターをイメージングチャンバーに移した後、白色光照明下で広視野イメージングを使用して、分化したEBSまたは活性拍動クラスター内の目的の構造を同定します。高速な低解像度の3次元スキャンを実行して、心臓クラスターの全体的な形態を再構築し、クラスターボリューム内の画像平面を選択し、いくつかの目に見える第2高調波発生ナノ粒子をリアルタイムで監視します。心臓クラスターの収縮により、顕微鏡光学スキャナーは最速モードになり、2次元画像のマルチヘルツ取得が可能になります。
ビート活動を評価する前に、ここに示されているように、MATLABソフトウェアを使用してテキストプロトコルに従って画像を解析します。PTFEフィルターの非線形光学応答の特性評価は、裸の基質から光子蛍光が非常に弱く、関連する生体サンプルの測定と分離されたものからの放出を防ぐことができないことを確認するために行われます。第2高調波発生ナノ粒子は、エピ検出モードで基板を介してイメージングすることにより、容易に取得できます。
この図では、心臓構造とEBSと標識された第2高調波発生ナノ粒子がブレードで示されています。赤、黄、緑の色はNADH自家蛍光に対応し、濃い青色の第2高調波スポットは孤立した第2高調波発生ナノ粒子に由来します。量子ドットやアップコンバージョンナノ粒子と比較して、良好な光学コントラストと比較的まばらなラベリングに注意してください。
この図は、心臓鼓動クラスターと標識された第2高調波発生ナノ粒子のスライスビューを示しています。この動画のように、3D構造を高速に記録し、第2細胞の収縮パターンを監視しています。高調波発生ナノ粒子は、NP運動を分解するための高い取得速度を維持するために凝集します。
全体的な取り込み感度は、第2高調波発生からの第2高調波発光による細胞自家蛍光を記録するのに十分ではありませんでした。ムービーフレーム上で行われたナノ粒子画像解析は、同じ心臓クラスター内での変位が数マイクロメートルのオーダーであり、単純な第2高調波発生ナノ粒子の動きの出入りに対して周波数が一定であることを示しています。細胞調製技術を習得すると、ベッティングクラスターの空気液体培養物の解剖と子羊の出産は、適切に実行されれば24〜36時間で行うことができます。
特にこの技術では、汚染を防ぐためにオープンエアの接触を避ける必要があります。この手順に続いて、活動電位プロファイルと3次元の拍動周波数との相関などの追加の質問に答えるために、複数の電極アレイを使用した電気生理学的記録などの他の方法を適用できます。高調波ナノ粒子による非線形信号の検出に基づく私たちの新しい技術は、イメージングに使用される波長を感染させるin vivo研究のためにさらに開発することができます組織へのより深い浸透を可能にします。
考えられる開発の1つは、再生医療アプリケーションのための幹細胞由来の構造の統合に続くことです。
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概要
この記事では、二次高調波生成ナノ粒子を用いたヒト胚性幹細胞（hESC）のインビトロ標識プロトコルを提示します。多光子顕微鏡を用いたhESCの調査方法と、心臓クラスターへの分化について詳述します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 幹細胞研究
- 心臓生物学
- 顕微鏡技術
背景
- ヒト胚性幹細胞は様々な細胞タイプに分化できます。
- 心臓ビーディングクラスターのモニタリングは心臓発達の理解に不可欠です。
- 二次高調波生成ナノ粒子はイメージングに利点を提供します。
- 多光子顕微鏡はリアルタイム分析のための高空間分解能を提供します。
研究の目的
- hESC由来の心臓ビーディングクラスターをリアルタイムでモニタリングすること。
- 心臓収縮の空間的伸長と周波数を分析すること。
- より深い組織イメージングのためにナノ粒子を利用すること。
使用された方法
- hESCの培養と胚様体の形成。
- PTFE多孔フィルター上での拍動クラスターの解離と培養。
- 拍動クラスターの高調波ナノ粒子による標識。
- 分析のためのリアルタイム多光子顕微鏡の実施。
主要な結果
- 顕微鏡スケールでの心臓収縮の成功的なモニタリング。
- 時間の経過に伴うナノ粒子の安定性の実証。
- より深い組織浸透のための様々な波長の使用可能性。
- 心臓クラスター挙動のダイナミクスに関する洞察。
結論
- この方法により、心臓クラスターの効果的なインビトロモニタリングが可能になります。
- 二次高調波生成ナノ粒子はイメージング能力を向上させます。
- このアプローチは幹細胞からの心臓発達の理解を進めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Labeling human embryonic stem cell-derived cardiac clusters with second harmonic generation nanoparticles (HNPs) enables high-resolution, real-time 3D monitoring of tissue dynamics critical for regenerative research. This approach provides stable, deep-tissue imaging for extended observation of cardiac maturation and functional contraction, supporting predictive confidence in early discovery and tissue engineering workflows. The method advances portfolio decision-making by enabling quantitative, reproducible analysis of stem cell-derived tissue constructs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cardiomyocyte function and maturation in 3D tissue models.
- Supports mechanistic de-risking by providing direct visualization of contractile behavior in stem cell-derived systems.
- Facilitates functional target validation for cardiac tissue engineering and regenerative medicine research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, labeled cardiac clusters for downstream multiphoton imaging assays.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of contraction frequency and displacement patterns.
- Supports assay standardization and scalability for compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling 3D functional analysis of cardiac constructs.
- Provides continuity from discovery-stage tissue modeling to preclinical validation of regenerative therapies.
- Reduces biological risk by supporting predictive assessment of tissue integration and function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, functional validation, and quantitative analysis of stem cell-derived cardiac tissues.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of cardiac differentiation and contractility in engineered tissues.
- Screening: Provides robust, quantitative imaging outputs for evaluating functional endpoints.
- Analytics: Enables measurement of displacement and contraction frequency for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue modeling with preclinical assessment of regenerative strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue research.
- Operational Value: Delivers stable, reproducible imaging over long-term experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in regenerative portfolio development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue engineering and regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, tissue engineering, and multiphoton microscopy.
- Needs access to advanced imaging platforms and quantitative analysis software (e.g., MATLAB).
- Demands cross-team standardization of labeling and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissue types or disease models may require protocol optimization.
- Labeling with HNPs is limited to multiphoton microscopy and not transferable to other imaging modalities.
