回生研究ハーモニックナノ粒子

本実験の全体的な目的は、ヒト胚性幹細胞由来の心拍クラスターを、3Dリアルタイムかつ高空間分解能でin vitroモニタリングすることである。まず、胚性幹細胞を培養・増殖させて胚様体を形成させる。次に、拍動クラスターを切り出し、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）多孔性フィルター上に播種することで、長期的な空気界面での維持を可能にする。

次に、液体培養中の拍動クラスターをハーモニックナノ粒子で標識し、リアルタイム多光子顕微鏡観察を行います。得られた結果により、微視的スケールでの心収縮の空間的伸展と頻度の解析が可能になります。これらのナノ粒子の主な利点は、任意の波長、特に赤外線を使用できるため、組織のより深部まで観察が可能であり、かつ経時的な安定性にも非常に優れている点にあります。

これにより、長期間にわたる長いプロセスのモニタリングが可能になります。この幹細胞培養法は、3次元における心筋細胞の機能的収縮という分野における重要な疑問、特に心筋の成熟と組織工学に関する課題の解決に寄与します。

この新しい疾患解析手法を導入する際は、高調波ナノ粒子を用いた標識手順は多光子顕微鏡にのみ適用可能であり、他の種類のイメージングシステムには転用できないことに注意してください。私たちは2005年に、高調波ナノ粒子を利用するというアイデアを初めて考案しました。これらのナノ粒子は、蛍光色素や量子ドットと比較して優れた利点を持っています。

実際、これらの信号は時間経過とともに減衰せず、長期間にわたって展開中のサンプルをモニタリングすることが可能です。サンプルの調製を視覚的に実演することは、各ステップの効率性と再現性にとって極めて重要であり、特に薬剤試験を行う際や、異なる組織や疾患の組織モデリングに適用する場合に重要となります。

テキストプロトコルに従ってヒト胚性幹細胞（ESC）を培養・拡大し、温めたcollagenase IVで10分間インキュベートした後、コロニー断片を2 mLの新鮮な分化培地（DM）で回収し、115 ×gで3分間遠心分離します。コロニー断片を超低接着6ウェルプレートで4日間浮遊培養し、胚様体（EB）を形成させます。

その後、新たに形成されたEBSを0.1%ゼラチンコートした24ウェルプレートに播種し、拍動するクラスターが出現するまで15〜30日間培養します。PBSを除去し、アキュタスを用いてコロニーを単一細胞に解離させ、遠心分離後、DM培地で再懸濁します。各ウェルに2 mLずつ分注し、37 °Cで1日間インキュベートします。

培養開始から2〜4週後、新たに形成されたEBSを回収し、0.1%ゼラチンでコーティングした24ウェルプレートの各ウェルに3つずつ播種します。拍動する心筋細胞のクラスターを特定し、先端を鋭くカットした延長パステリピペットを用いて、それらを手動で切り出します。インサート1つにつき4つのPTFEフィルターを配置し、それぞれを6ウェルプレートのウェルに入れます。

それぞれに1 mLのDMを加えた後、解剖した拍動クラスターを各PTFEフィルターの上に1つずつ載せます。クラスターを標識させるため、拍動クラスターが載ったPTFEフィルターを3.5 cmのガラス底ディッシュに移します。50 µg/mLの第二高調波発生ナノ粒子を1 mL加え、37 °Cで30分間インキュベートして、非線形光学イメージングを行います。

標識したHEBまたは心拍クラスターをイメージングチャンバーに転送した後、白色光照明下の広視野イメージングを用いて、分化したEBまたは活性な拍動クラスター内の目的の構造を特定します。高速で低解像度の3次元スキャンを行い、心拍クラスターの全体的な形態を再構築し、リアルタイムでモニターするために、いくつかの第二高調波発生ナノ粒子が視認できるクラスター体積内の画像平面を選択します。心拍クラスターの収縮に合わせて顕微鏡の光学スキャナーを最速モードに設定することで、2次元画像のマルチヘルツ取得が可能になります。

拍動活性を評価する前に、ここで実演されているテキストプロトコルに従い、MATLABソフトウェアを用いて画像を解析してください。PTFEフィルターの非線形光学応答の特性評価を行い、ベア基板による光蛍光が極めて弱く、関連する生物学的試料の測定や、単離された第二高調波発生ナノ粒子のエミッション取得を妨げないことを確認します。これらは、エピ検出モードで基板を通してイメージングすることで容易に取得可能です。

この図では、第二高調波発生ナノ粒子で標識された心臓構造とEBSが示されています。赤、黄色、緑色はNADHの自発蛍光に対応しており、強度の高い青色の第二高調波スポットは孤立した第二高調波発生ナノ粒子に由来します。量子ドットやアップコンバージョンナノ粒子と比較して、良好な光学コントラストが得られており、標識が比較的疎であることに注目してください。

この図は、第二高調波発生ナノ粒子で標識された心拍拍動クラスターのスライスビューを示しています。この動画に示されているように、2番目の細胞における収縮パターンをモニタリングするために、3D構造が高速で記録されています。ナノ粒子（NP）の動きを分解して観察するため、第二高調波発生ナノ粒子を凝集させ、高い取得速度を維持しています。

全体の取得感度は、第二高調波発生による第二高調波放出を伴う細胞の自家蛍光を記録するには不十分でした。動画フレームを用いてナノ粒子の画像解析を行った結果、同一の心筋クラスター内における変位は数µmオーダーであり、面内および面外の第二高調波発生ナノ粒子の運動周波数は一定であることが示されました。細胞調製技術を習得すれば、適切に実施することで、心筋クラスターの解剖、気液界面培養、およびラミングを24時間から36時間で完了させることができます。

特にこの手法では、汚染を防ぐために外気に触れる接触を避けなければなりません。この手順に従い、多電極アレイを用いた電気生理学的記録などの他の手法を適用することで、3次元的な拍動頻度と活動電位プロファイルの相関など、さらなる疑問を解明することが可能です。調和ナノ粒子による非線形信号検出に基づく我々の新しい手法は、イメージングに使用される波長が組織へのより深い浸透を可能にするため、in vivo 研究に向けてさらに発展させることができます。

今後の展開のひとつとして、再生医療への応用のための幹細胞由来構造体の統合が考えられます。