マウス胎児心臓の開発に細胞標識と注入

この手順の全体的な目標は、マウスの胚の心臓に細胞ダイ、またはDNAの注射を行うことです。細胞脂肪を調べたり、遺伝子発現を局所的に操作したりするためには、まず妊娠したマウスから胚を解剖し、胚の心臓を露出させることでこれを達成します。次に、DNA色素または細胞を心臓の標的関心領域に注入します。

次に、胚をインキュベートした後、心臓を取り出して培養します。最後に、注入または標識された細胞の運命は、顕微鏡検査によって決定されます。最終的に、注射、標識、または遺伝子組み換え細胞の運命は、共焦点顕微鏡または光およびエピ蛍光顕微鏡によって監視され、心臓発生中の特定の遺伝子および細胞の機能的重要性が明らかになります。

マウスでのトランスジェネシスのような既存の方法のこの技術の主な利点は、実験室に局所的かつ正確に注入したり、生体内で細胞を遺伝子組み換えしたりできることです。これにより、適切な環境でこの細胞を調査することができます。この手順を実演するのは、私と研究室の博士課程の学生であるエミリー・アールです。

機器、試薬、溶液を準備した後、テキストプロトコルに従って、安楽死させた妊娠中のマウスからE 9.5およびE 10.5胚を収集します最初に70%エタノールを使用して胸部を滅菌し、腹側正中線切開を行って腹部を開き、子宮角を回収してから室温PBSに移します。PBSでさらに2回洗浄した後、シリコンを充填したペトリ皿に移します。M 16ミディアムでは、昆虫ピンを使用して子宮角をシリコン層に固定し、子宮の血管新生側が下にくるようにします。

次に、細い鉗子を使用して子宮の表面を切り取り、落葉性を表面から1ミリメートル下にキャップします。落葉膜の壁を広げ、卵黄袋に胚をそっと取り出します。細胞注入前に摂氏37度の培地であるM16に保管して注入を行います。

まず、ハミルトンのシリンジを使ってガラスピペットの裏側からDNAや細胞を充填し、ピペットを振って気泡を取り除きます。先端でピペットをマイクロインジェクションホルダーに置き、以下の設定に従ってインジェクターをセットします。次に、胚に適切に触れることなく、卵黄袋を通して胚をシリコンの底に固定します。

次に、心臓の領域を特定し、この領域のすぐ上にある袋を開けます。胚の周りに4本のピンを追加して、細胞注入中の動きを防ぎます。手動に設定されたマイクロマニピュレーターを使用して、ピペットチップを心膜の45度の角度、注射する心臓の領域のすぐ上にゆっくりと配置します。

ピペットを関心のある領域に移動し、注入をトリガーして、できるだけ早くピペットを取り出します。DNAまたは細胞の注入後に心臓が適切に鼓動していることを確認してください このビデオで説明されている注射プロトコルを使用して、上皮から間葉への移行を研究し、E 9.5 A VCエクスプランに、心内膜細胞の内皮間葉転換に必要なタンパク質をダウンレギュレートするS-H-R-N-Aを注射しました。対照胚に空の骨格ベクターを注入し、同様に、SOXナインプロモーターの制御下でGFPを発現するHUES細胞由来の内皮前弁膜細胞をE 10.5のA VCに注入し、続いて48時間の外植心臓培養を行った。

これらの細胞は、心内膜細胞と同様に、ペリオスチンなどのEMTのマーカーを獲得します。ここで示すex vivoアプローチは比較的簡単ですが、最大48〜72時間の短期追跡に限定されます。ただし、テキストプロトコルに記載されている超音波ガイド下注射手順は、技術的により困難なアプローチを提供しますが、出生後でも子宮内でのフォローアップを長期間行うオプションがあります。

ここでは、特定の心臓領域の細胞を標識するための色素またはウイルスベクターの子宮内注射を示します。この方法では、蛍光色素またはウイルスを用いて心外膜細胞の特異的標識を達成することができ、この方法は細胞または代替注射剤で拡張することができる。この手順に従うと、遺伝子、分子の長期的な影響、または発生後の組織形態形成などの長期リストの読み取り値などの追加の質問に答えるために、コケ培養のような方法があります。

この技術は、心臓発生生物学および遺伝学の分野における研究者への道を開きました。これにより、新しい遺伝子の世界を探求し、適切な胚の文脈でヒト細胞の運命を調査することもできます。これは、トランスジェニックマウス系統が利用できない場合に非常に便利です。