落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

この手順の全体的な目標は、腫瘍組織のマトリックス成分のダイナミクスを研究するために、黒色腫罹患マウスの耳の生体内免疫蛍光イメージングを実行することです。これは、まずマウスの耳にB16F10メラノーマ細胞を発現するGFPを接種することによって達成されます。次に、腹側を背側の耳の皮膚から分離し、腫瘍組織を露出させるために、マウスの耳に手術を行います。

次に、背側の耳の露出した組織に対して免疫染色を行います。最後に、動物はイントラバイタルイメージングのために準備されます。最終的に、蛍光立体顕微鏡または多光子顕微鏡法を使用して、腫瘍細胞とそのマトリックス成分の局在化と動的挙動を示します。

この手法が他のライブイメージング法と比較した場合の主な利点は、腫瘍細胞と免疫細胞などの間質関連細胞とのダイナミックな相互作用をイメージングできることですが、それは細胞外マトリックスのような繊維状およびメッシュの文脈で行われます。したがって、この方法は、腫瘍細胞が物理的な微小環境とどのように相互作用するかなど、腫瘍生物学の分野における重要な問題に対処するのに役立ち、その結果、腫瘍がどのように進行するかについての重要な洞察が得られる可能性があります。手順の一部は、私たちの研究室の上級科学者であるVita Kkiによって実証されます 注射用の腫瘍細胞を準備するには、B 16 F 10 GFPメラノーマ細胞を培養することから始めます。

細胞を遠心分離した後、細胞を1.5ミリリットルのeinor tubeに移し、再び回転させ、ペレットのすぐ上に留まる培地の薄い層を除くすべての上清を取り除き、細胞を厚い細胞スラリーに再懸濁し、次に細胞スラリーを10マイクロリットルの容量にロードします。ハミルトンシリンジ。付属の33ゲージ針からチップキャップを取り外し、チップチャンバーの上部に20マイクロリットルのスラリーをロードします。

次に、5マイクロリットルのスラリーがシリンジ内に装填されるまで、プランジャーを引き戻します。C 57 black six mouse を注射麻酔で麻酔した後、マウスの頭を剃り、頭と耳の周りの毛を切除し、水ですすいでください。粘着テープを使用して、耳の近位端を人差し指の先に固定します。

ハミルトンシリンジ針を、真皮背と耳の軟骨の間に挿入します C 57ブラックシックマウス 近位から遠位まで約2〜3ミリメートル浸透します。.細胞スラリーを注入し、針を皮膚からゆっくりと引っ込めます。腫瘍細胞を7〜9日間かけて固形腫瘍を形成し、蛍光顕微鏡を使用して腫瘍の成長を追跡します。

加湿酸素とイソフッ素の混合物を使用してマウスを麻酔した後、マウスを摂氏37度の加熱パッドに置き、つま先を優しくつまみます。動物が十分に麻酔されていることを確認するため。眼科用軟膏を目に塗布し、手術全体を通してマウスを直腸サーミスタ制御の加熱パッドの上に保ちます。.

次に、腫瘍を抱える耳をスライドガラスの積み重ねの上にそっと置きます。次に、粘着テープの小さなストリップを使用して、メスを使用して耳の前端と後端をスタックに固定し、マウスの耳介の反らせんに沿って耳の腹側皮膚を切断します。湾曲したピンセットを使用して、耳からテープをはがします。

背側真皮から腹側真皮と軟骨をそっと剥がします。リンガーバッファーを使用して耳を洗浄し、免疫蛍光染色を行います。ブロッキングバッファー中の細胞外マトリックス分子を標的とする一次抗体を露出した耳に塗布し、その上にカバースリップを敷きます。

15分間インキュベートしてから、約5ミリリットルのリンガーバッファーを使用して耳を2回洗浄します。ブロッキングバッファーに適切な二次抗体または連鎖球菌Adenを塗布します。カバースリップを貼り、15分間インキュベートしてから2回洗う前と同じように、開いた真皮領域をEM mencia conkiに折り込み、滅菌ワイプを使用して外側の未開封の耳の真皮を乾燥させます。

スライドガラスの積み重ねの上に耳を置き、0.5マイクロリットルの外科用接着剤を前部と後部の背側縁に塗布して、2時間以下の短期間のイメージングのために耳を固定します。固定された耳の上にソルビン酸リンガーバッファーとして新たに調製した滅菌物を追加し、カバースリップを塗布します。次に、2つのレンズを備えた蛍光実体顕微鏡を使用して、耳を画像化します。

長期イメージング用。ソルベートリンガーを含むリザーバーに取り付けられた針の出口を、耳から約0.5センチメートル離れたカバースリップの下に置きます。1分間に1マイクロリットルの速度でペリスタルティックポンプを使用して、バッファーを常にチャンバーに送達します。

取得ソフトウェアを開きます。ゲイン蛍光強度、倍率、露光時間画像、腫瘍細胞を含むいくつかのフィールド、および染色された細胞外マトリックスタンパク質を調整して、シリコングリースを使用した多光子顕微鏡を使用して生体内イメージングを実施します。耳の付け根から始めます。

耳の周りに直径約2センチ、高さ2〜3ミリメートルの円形の壁を作ります。円をソルビン酸リンガーで満たします。マウスをステージ上の加熱パッドに置き、摂氏37度に設定し、テキストプロトコルに従って顕微鏡の設定を構成します。

この図に示すように、免疫染色後の形態によって多くの構造を区別することができます。コラーゲン4やプロリンなどの基底膜成分の場合、最も重要なのは、通常はSHGでは検出できない構造タンパク質です。従来のマトリックス検出法を可視化することができます。

例えば、腫瘍微小環境内で発生する線維性コラーゲンの力により、腫瘍間質の異なる場所にtensとCが沈着し、腫瘍マトリックスの拡張または収縮を引き起こし、その結果、創傷治癒と同様に腫瘍血管系のリモデリングにつながる可能性があることを発見しました。ここでは、2つの光子タイムラプス顕微鏡法を実行しながら、免疫標識tenasとCマトリックスを同時にイメージングし、Fluor foursの光退色を最小限に抑え、高光子密度から光子顕微鏡までを観察できることを示します。この動画では、コラーゲン4をプレステインした露出した真皮に重ね合わせた腫瘍細胞が、組織に付着し、集団で血管や脂肪部位の基底膜に沿って集団で移動し始めました。

耳を開けて免疫染色する手順全体をマスターすると、2時間かかります。このビデオを見れば、エピ蛍光顕微鏡または2光子顕微鏡を使用して腫瘍内の細胞マトリックス相互作用を研究するための生体内免疫染色の実施方法について十分に理解できるはずです。