ラットにおける心不全のための細胞ベースの治療：心筋梗塞および細胞およびバイオマトリックスの心外膜移植のためにダブル開胸

本手順の目的は、冠動脈結紮および心外膜への適用を行うため、ラットに二重開胸術を施行することである。まず、第4肋間での開胸を行い、次に左前下降冠動脈（LAD）を結紮することでこれを達成する。

その後2週間後に、第5肋間において2回目の開胸術を行います。最後に、細胞とマトリックスを拍動する心梗塞部位の表面に適用します。最終的に、心エコー検査によって心機能を評価し、梗塞サイズの測定による組織学的解析を行います。

胸骨切開などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、低侵襲アプローチであることで、本手順は当研究室のLopezおよび共同研究者によって実証されています。すべての動物は、F-E-L-A-S-Aの勧告およびスイス動物保護法に従って取り扱われました。ラットを失血させ、テキストプロトコルに従って大腿骨を分離・洗浄した後、ハサミを用いて骨の両端を切断します。

次に骨髄を洗浄するため、滅菌PBSを骨の中心に注入し、骨髄を15 mLチューブに回収します。回収した骨髄を300 ×gで7分間遠心分離します。上清を取り除き、3 mLの赤血球溶血バッファーを加えます。ペレットを懸濁させ、室温で1分間インキュベートした後、再懸濁して再び300 ×gで7分間遠心分離します。

ペレットを滅菌培養液中で懸濁させます。150 mLの培養フラスコに細胞培養液を追加し、培養2日目に細胞を播種します。培地を交換して非接着細胞を除去し、目的の細胞密度に達するまで2〜3週間、2日ごとに培地交換を継続します。

最初のT字胸腔切開術を行うには、まずラットの体重を測定し、それに応じて人工呼吸器のパラメータを設定します。換気流出量は自動的に定義されます。次に、胸部の左側を剃毛し、ヒーティングパッドをオンにして37 °Cに設定します。

テキストのプロトコルに従ってラットに麻酔をかけた後、足指または尾を挟んで反応を確認し、ラットを腹臥位にして加温パッドの上に置きます。14ゲージのIVカテーテルを使用して動物を挿管し、挿管カテーテルを齧歯類用人工呼吸器に接続します。設定は、酸素 2.5 liters per minute、イソフルラン 2.5%、1回換気量 2 milliliters、呼吸数 90 breaths per minuteに設定します。buprenorphine 0.1 milligrams per kilogramを皮下投与するためのシリンジを準備し、溶液の3分の1を注入した後、1% Betadine溶液を用いて患部を消毒します。

次に、第4肋間腔の胸骨に垂直に皮膚を切開し、3層の胸筋を分離します。続いて、第4肋骨と第5肋骨の間の第4肋間腔を開きます。小型のリトラクターを用いて肋骨を広げ、心臓を露出させます。

次に、心膜を慎重に切り開き、左前下降冠動脈（LAD）を確認します。心房から4 mm下の位置で、7.0縫合糸を用いて結紮します。その後、胸骨から遠位の概ね適切な位置に3-0縫合糸を配置し、虚血領域の色調変化をコントロールします。肋間腔を閉鎖するための縫合を2箇所行います。

遠位側の縫合糸を締め、固定します。胸部を膨らませ、気胸を避けるため、人工呼吸器の排気チューブを2秒間クランプします。その後、2番目の縫合糸を締めて固定します。

筋肉層を元の位置に戻します。次に、1% Betadine溶液を用いて、5-0縫合糸で皮膚を閉鎖します。縫合部を消毒し、残りのブプレノルフィン溶液を注入します。

麻酔システムを停止し、挿管カテーテルを抜去します。ラットを温熱ランプの下にあるケージ内に1〜2時間安置した後、IVCユニットに戻します。初回開胸術から2週間後には治癒が完了し、瘢痕はほとんど目立たなくなります。

本ビデオの前半で説明したラットの手術準備手順に従い、第5肋間において胸骨に垂直に皮膚を切開します。3層の筋肉を分離し、第5肋骨と第6肋骨の間の第5肋間を開きます。小型のリトラクターを用いて肋骨を広げ、心臓を露出させます。

多少の癒着がある場合は、精細鉗子を用いて慎重に除去します。次に、結紮部位の下方に淡色に見える梗塞領域を確認します。必要に応じて、7-0縫合糸を10 cm切り、心尖部に挿入して軽く引っ張り、左心室をより明確に可視化させます。

次に、心臓の虚血領域の表面に細胞とマトリックスを適用します。テキストプロトコルに記載されている通り、ペレット化した4 × 10⁶個の細胞を心臓上に配置し、フィブリンシーラントを用いて被覆します。この接着層によって細胞が心臓表面に固定されます。

心尖部の縫合糸を取り除いた後、筋肉層を元の位置に戻して縫合し、動物を消毒します。これはビデオの前の場面で示した通り、ここで行います。外科的介入後、動物は体重が減少しましたが、適用された治療法にかかわらず、速やかに回復し、その後体重が増加しました。このカプラン曲線で示されているように、最初の開胸術後の生存率は高く、このグラフに見られるように、フィブリンおよび/または細胞で治療した動物は、他の群よりも生存率が低いことが示されました。

それにもかかわらず、2回目の開胸術後の全体的な生存率は高いままでした。心機能は心エコー図検査によって評価されました。健康な動物と心筋梗塞動物の代表的なMモード画像は、LAD結紮の2週間後にLV壁の収縮能が消失していることを示しています。合計104匹の動物において、LAD結紮の2週間後に短縮率を記録しました。

頻度分布は、変動係数が17%であり、方法の再現性が概ね良好であることを示しています。この図は、LAD結紮後2週間および6週間における駆出率の測定値による心機能のグラフ表示です。この期間中、心機能は低下し続けています。また、この期間に心リモデリングも起こり、ここでは収縮期および拡張期の両方で記録されたLV容量の増加として示されています。最後に、心臓切片のゴールド染色により、LAD結紮後6週間までに線維性組織および最終的に透壁性瘢痕が形成されたことが明らかになりました。この手技を習得すれば、適切に行った場合に30分から40分で完了できます。

このビデオを視聴することで、低侵襲な両側開胸術の実施方法について十分に理解することができます。