Name: ラットにおける心不全のための細胞ベースの治療：心筋梗塞および細胞およびバイオマトリックスの心外膜移植のためにダブル開胸 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶラットの心筋梗塞治療のための最小侵襲的なダブル開胸法。心外膜への細胞とバイオマトリックスの移植手順を含み、心機能評価と組織学的解析により治療効果を検証する方法です。

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著者らは、研究の最初の部分のための財政支援のための教授ヘンドリックTevaearaiと心臓血管外科に感謝します。

注：ルイス雌雄ラット、200〜220グラムは、標準的な実験室条件（12時間の明暗周期、 自由摂取させ 、 水や食料、IVCケージ）の下で飼育した。すべての動物は、動物保護に関するFELASAとスイス法の勧告に準拠して処理した。 1。細胞の調製：骨髄から間葉系幹細胞の単離<ol><li> 5分間の誘導チャンバ内でイソフルラン5％とO 2を5L /分でラットを麻酔。麻酔システムに接続されたノーズコーンに動物の鼻を置きます。鎮静を確認するために、足指や尾のピンチを実行します。 </li><li>腰に足首から皮膚をカットしてはさみで足から皮膚を取り除きます。筋肉を外し、動物失血のための大腿動脈を切った。股関節を公開し、大腿骨頭を脱臼。これは、大腿骨頭に損傷を与えないことが重要である。 50ミリリットルのプラスチックチューブに滅菌PBS中の骨を置きます。 </li><li>すべてのムーを削除それらを壊すことなく骨からsclesや靭帯。注：骨エタノールで洗浄溶液または汚染の連鎖を避けるために無傷のままであることが重要である。 5分間、70％エタノール中で剥離した骨を洗い流す。 </li><li>無菌層流フードの下では、はさみで骨の両方の先端をカット。骨端から滅菌PBSを注入することにより、骨髄をフラッシュします。 15ミリリットルチューブに骨髄を収集します。 300×gで遠心し7分。 </li><li>上清を取り除きます。赤血球溶解バッファー3mlにペレットを一時停止します。 300×gで7分間再びスピンする前に室温で1分間、懸濁液をインキュベートする。 150ミリリットルの培養フラスコ中で、無菌細胞培養培地（395ミリリットルIMDM培地を5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを100mlのFBS）を添加し、細胞を播種する。 </li><li>非付着細胞を除去するために二日目の媒体に変更します。 <ol><li>所望の細胞量が得られるまで2〜3週間おきに毎日培地交換を行います。 </li><li>代わりに、種子によってbiograftを準備必要に応じて他の場所3記載の固体マトリックス上に細胞をる。 </li></ol></li><li>心臓移​​植の日には、細胞を調製または単に心外膜適用前にbiograftを収穫。 <ol><li>のAccutase細胞剥離液を用いて細胞を収集します。細胞を数える。所望の細胞量を得るために計算された細胞懸濁液の体積を1.5 mlの遠心チューブを埋める。 300×gで7分間遠心分離し、上澄みを除去します。 </li><li>あるいは、滅菌PBSですすぎ、細胞培養培地からbiograftを採取し、血清を含まない新鮮な培地中で維持する。 </li></ol></li></ol>まず開胸とLAD結紮<ol><li>ラットを計量。 37℃で加熱パッドをオンにします。 5-7分間の誘導室中の5％イソフルランおよび5 L /分、100％O 2でラットを麻酔。鎮静を確認するために、足指や尾のピンチを実行します。加熱パッド上にラットを置きます。 </li><li> 14を動物に挿管G静脈カテーテル。 2.5リットル/分の酸素、2.5％イソフルラン、2ミリリットルの一回換気量、および90呼吸/分の呼吸頻度のためにプログラムさ齧歯類ベンチレータに挿管カテーテルを接続します。 </li><li> 0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィン溶液を調製する。液の皮下に三分の一を注入。胸部の左側の部分を剃る。 1％ベタジン溶液で消毒。 </li><li>第四肋間で胸骨に垂直に皮膚を切開。胸の筋肉（大胸、胸を昇順、および外腹斜胸筋）の3層を分離。 （リブ4と5の間）第四肋間を開きます。 </li><li>肋骨を広げるためにと心を露出させ、小さなリトラクターを使用してください。慎重に心膜を開きます。アトリウム以下の7.0縫合糸4ミリメートルで冠状動脈（LAD）を左前の位置を確認し、連結する。 </li><li> 3.0縫合を使用して2針で肋間スペースを閉じます。胸骨から近位および遠位に2本の縫合糸を配置します。まず、T遠位縫合糸をighten。胸を膨らませると、任意の気胸を避けるために、2秒間の人工呼吸器の排気チューブをクランプします。第2の縫合糸を締めます。 （無縫合は必要ありません）が所定の場所に戻り、筋肉層を配置します。 5.0縫合で皮膚を閉じます。 </li><li> 1％ベタジン溶液で縫合糸を駆除。ブプレノルフィン液の残りを注入します。麻酔システムの電源をオフにします。挿管カテーテルを取り外します。 </li><li> 1〜2時間、暖かいランプの下にケージにラットを保管してください。ケージの中に温度計を保持し、過熱を避けるために、温かいランプとケージとの間の距離を制御します。 IVCユニットにラットを返します。 48時間皮下ブプレノルフィン0.05〜0.1ミリグラム/ kgのポスト-operativelyごとに6〜12時間後に注入する。 </li></ol>第二に開胸処理によって3。心外膜の管理<ol><li>繰り返します2.1から2.3を繰り返します。 </li><li>第五肋間で胸骨に垂直に皮膚を切開。 3層を分離胸の筋肉（大胸、昇順胸筋と外腹斜胸筋）のsの。 （リブ5と6の間）第五肋間を開きます。 </li><li>肋骨を広げるためにと心を露出させ、小さなリトラクターを使用してください。いくつかの付着がある場合は、慎重に細かい鉗子でそれらを削除します。 </li><li>合字下の淡い領域として表示される梗塞領域の位置を確認します。注：必要に応じて、より良い左心室を可視化するために頂点に挿入された縫合糸の10cmのピース（7.0）を使用します。心臓を露出させクランプによって緩く維持縫合糸に慎重に引き抜いてください。 </li><li>以下の処置のいずれかを適用します。 <ol><li>心臓の表面にbiograftを配置します。 10分間室温で予め温めプレフィルドフィブリンシーラント注射器を使用してください。 25 Gルアーの針を用いてbiograft下のフィブリンシーラントの低下（50〜100μl）を適用します。 biograftが完全に密封されていることを確認します。 </li><li>あるいは、表面oをでピペットの先端で収集した細胞ペレットを適用する合字下の淡い領域に心F。細胞ペレット上にフィブリンシーラントの低下（50〜100μl）を適用します。 </li></ol></li><li>頂点から縫合糸の部分を削除します。 </li><li>繰り返します2.6から2.8を繰り返します。 </li></ol>

<ol><li>Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling+at+the+population+level--risk+factors%2C+screening%2C+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes.</a> Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

LADの永久的な連結は、不可逆的な心筋障害を引き起こす。最初の動物モデルは、1960 4に記載した。以来、それは、慢性MIのための標準および適切なモデルとして考えられてきた。その安定性と再現性は、MI 5のための治療法の実験的評価を可能にした。最初の説明の後の改善の手順は、35から13までパーセント6の手術死亡率を報告した。 予想されるように、LAD結紮2週間以内に観察障害、心機能を誘発した。心臓機能のさらなる低下は6週間まで記録し、経壁線維性瘢痕と関連していた。また、左室拡張を含むLVリモデリングは明らかに6週間結紮を投稿観測された。 第一および第二の手術の間に2週間の間隔を選択した。彼らは1週間perforする後にあまりにも豊富であったように、この状態では、第二開胸は、癒着が存在しないことによって促進された最適な条件でのミリアンペア秒の手術。また、2週間の治療用途のための最適な時間枠を表現し、虚血により誘発される炎症の初期の写真を回避し、拡張の密な線維性組...

19 世紀末以来、心血管疾患は、先進国でナンバーワンの連続殺人犯を推移している。これらの中でも、冠動脈疾患、メイン病因を表す。心筋梗塞（MI）および急性期の結果は次第に慢性期および重症心不全に向かって発達不適応リモデリングが続く。最近の重要な技術的および治療 ​​の進歩にもかかわらず、原因心不全の進行に罹患率と死亡率は依然として1を拡大しています。この文脈において、細胞療法は、心不全に向かって疾患の進行を停止させると、心筋の最近同定再生能を刺激するために新たな治療選択肢としてますます関心を集めている。実験的及び臨床的研究は、さまざまな細胞型の心臓移植後に得られる有益な効果の説得力のある証拠を提供した。主なアウトカムは改善されたカーディを含め交流収縮機能は、左心室リモデリングを減少させ、梗塞サイズを減少し、梗塞領域内の血管密度を増加させた。しかし、細胞注入後の低細胞数の保持は重要な欠点が残った。細胞送達2の改善するバイオマトリックスによる細胞の協会は最近、研究者や臨床関心を育んできた。 左冠動脈前下行枝（LAD）の連結は、経壁心筋梗塞および成熟瘢痕をもたらす小動物モデルにおける心筋梗塞のための参照方法です。 MIの慢性期に適用される細胞治療は、第二外科的介入を必要とします。胸骨正中切開は、通常、細胞またはbiograftsの心外膜注入の心筋内注入を可能にするために行われる。このような侵襲性外科手術手順は、死亡率、術後回復時間、痛み、感染症のリスクを高める。ここで紹介する低侵襲性のアプローチは、このようなバイアスを防ぐだけでなく、Oを提供するだけでなく治療適用のための心臓のptimalアクセス可能。 MIとゲル状のバイオマトリックスに関連する細胞の心外膜注入は左肋間開胸術を経由して拍動している心臓上で実行されます。

<table><tbody><tr><td>ポリソルブ 3-0 縫合糸</td><td>Covidien</td><td>UL 204</td><td></td></tr><tr><td>ポリソルブ 5-0 縫合糸</td><td>Covidien</td><td>UL 202</td><td></td></tr><tr><td>Surgipro II 7-0 縫合糸</td><td>Covidien</td><td>VP904X</td><td></td></tr><tr><td>カテーテル インサイト 14 G</td><td>BD</td><td>381267</td><td></td></tr><tr><td>Inspira アドバンスド ボリューム コントロール ベンチレーター</td><td>ハーバード デバイス</td><td>557058</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #7 鉗子</td><td>FSTドイツ</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>フィブリンシーラント</td><td>バクスター</td><td>1501441</td><td>TISSEEL接着剤、冷凍-20°C;C</td></tr><tr><td>Castroviejo Eye Specula</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8925</td><td>肋骨のリトラクターとして使用</td></tr><tr><td>IMDM GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31980</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAA Clone</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;A15-101</td><td></td></tr><tr><td>骨はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>16044-10</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解液</td><td>Gentra Systems</td><td>D-50K1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Stem Cell Technology</td><td>7920</td><td></td></tr></tbody></table>

ラットにおける心不全のための細胞ベースの治療：心筋梗塞および細胞およびバイオマトリックスの心外膜移植のためにダブル開胸

Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix

心臓細胞療法は、細胞に関連生体材料の関心の高まりと注入が、心筋細胞送達を最適化するための大きな課題となって得ています。左前下動脈（LAD）結紮からなる心筋梗塞のげっ歯類モデル（MI）は、一般的に開胸を介して行われています。胸骨切開を介して第心臓切開手術は、伝統的に、治療の心外膜の用途のために行われている。 LAD結紮モデルの記述なので、手術後の死亡率は、しかし第二の手術が重要で推移している、百分の35から13まで低下した。術後の回復を改善し、痛みおよび感染を減少させるために、低侵襲性外科手術手順が提示される。二つの開胸術は、LAD結紮のための初期のものと治療心外膜投与のための第1を実施した。固体またはゲルタイプのマトリックスに関連した細胞からなるBiograftsは梗塞AR上に塗布し、EA。 2および6週後に行っ心エコー検査によって確認されるようにLAD結紮の心臓機能の喪失をもたらした。ゴールドナーは、心臓切片で実施トリクローム染色は、経壁瘢痕形成を確認した。第一及び第二の手術は少なく、その10％の術後死亡率をもたらした。

すべての動物は、開胸した後1時間以内に回復した。創傷治癒は急速であった。いいえ感染や浮腫が認められなかった。 左ダブル開胸、心臓（ 図1）への最適なアクセスを可能にした。痛みと手術後の死亡率は低かった。動物は、手術から素早く回収した（ 図2）体重が増えた。カプランメイヤー生存率は、最初開胸96％であった。 104以上の4匹のラット二開胸経由治療適用後24時間以内に死亡した。動物は第二開胸が、無治療（偽）を受けた100％、MSCのための96％およびフィブリンシーラントグループ、または動物がMSCを受けた86パーセントまで変化カプランメイア生存パーセントは直接心筋（ 図3）内に注入した。 Mモード心エコー評価は2週間LAD結紮44±3％から短縮率（FS）の減少を示した掲示を行っ22±4％である。方法（ 図4）の再現性の証拠を提供した104の動物2週間後のLAD結紮に記録されたF...

げっ歯類モデルでLAD結紮により誘導される心筋梗塞を治療するためbiograftの移植は、従来、2つの心臓切開手術を必要としてきた。死亡率を減少させ、細胞に関連する、固体およびゼラチン状バイオマトリックスを固定するための最適な条件を提供するために、最小侵襲性処置が開発されてきた。

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial ...

本手順の目的は、冠動脈結紮および心外膜への適用を行うため、ラットに二重開胸術を施行することである。まず、第4肋間での開胸を行い、次に左前下降冠動脈（LAD）を結紮することでこれを達成する。その後2週間後に、第5肋間において2回目の開胸術を行います。最後に、細胞とマトリックスを拍動する心梗塞部位の表面に適用します。最終的に、心エコー検査によって心機能を評価し、梗塞サイズの測定による組織学的解析を行います。胸骨切開などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、低侵襲アプローチであることで、本手順は当研究室のLopezおよび共同研究者によって実証されています。すべての動物は、F-E-L-A-S-Aの勧告およびスイス動物保護法に従って取り扱われました。ラットを失血させ、テキストプロトコルに従って大腿骨を分離・洗浄した後、ハサミを用いて骨の両端を切断します。次に骨髄を洗浄するため、滅菌PBSを骨の中心に注入し、骨髄を15 mLチューブに回収します。回収した骨髄を300 ×gで7分間遠心分離します。上清を取り除き、3 mLの赤血球溶血バッファーを加えます。ペレットを懸濁させ、室温で1分間インキュベートした後、再懸濁して再び300 ×gで7分間遠心分離します。ペレットを滅菌培養液中で懸濁させます。150 mLの培養フラスコに細胞培養液を追加し、培養2日目に細胞を播種します。培地を交換して非接着細胞を除去し、目的の細胞密度に達するまで2〜3週間、2日ごとに培地交換を継続します。最初のT字胸腔切開術を行うには、まずラットの体重を測定し、それに応じて人工呼吸器のパラメータを設定します。換気流出量は自動的に定義されます。次に、胸部の左側を剃毛し、ヒーティングパッドをオンにして37 °Cに設定します。テキストのプロトコルに従ってラットに麻酔をかけた後、足指または尾を挟んで反応を確認し、ラットを腹臥位にして加温パッドの上に置きます。14ゲージのIVカテーテルを使用して動物を挿管し、挿管カテーテルを齧歯類用人工呼吸器に接続します。設定は、酸素 2.5 liters per minute、イソフルラン 2.5%、1回換気量 2 milliliters、呼吸数 90 breaths per minuteに設定します。buprenorphine 0.1 milligrams per kilogramを皮下投与するためのシリンジを準備し、溶液の3分の1を注入した後、1% Betadine溶液を用いて患部を消毒します。次に、第4肋間腔の胸骨に垂直に皮膚を切開し、3層の胸筋を分離します。続いて、第4肋骨と第5肋骨の間の第4肋間腔を開きます。小型のリトラクターを用いて肋骨を広げ、心臓を露出させます。次に、心膜を慎重に切り開き、左前下降冠動脈（LAD）を確認します。心房から4 mm下の位置で、7.0縫合

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