ベスト：四分子のバーコード有効シーケン

本手法の全体的な目的は、どの後代が同じ元の四分子から由来したかという情報を保持したまま、酵母の交雑から大量の組換え後代を作成することである。これは、まず交雑に使用するヘテロ接合性二倍体株に、四分子特異的バーコードと胞子形成特異的蛍光レポーターを含むプラスミドライブラリーを形質転換することで達成される。次のステップとして、バーコード化された細胞を胞子形成培地へと移す。

これによりテトラードが形成され、胞子形成に失敗した細胞では誘導されず、テトラード内でのみGFP蛍光レポーターの発現が誘導されます。次に、FACSソーターを用いて蛍光標識されたテトラードを他の細胞から分離し、寒天プレートに直接分取します。そこで、テトラードの外層を酵素的に消化します。最終ステップとして、ガラスビーズを用いて消化されたテトラードの胞子を分離し、寒天プレートの表面に分散させることで、各胞子が単一のコロニーを形成するようにします。

最終的に、この方法で得られた菌株は、各菌株の4特異的バーコードを読み取るハイスループット・マルチプレックスDNAシーケンシングプロトコルを用いてジェノタイピングされます。その後、これらのバーコードを使用して、単一の減数分裂の結果として生じた4つの菌株をそれぞれ特定します。マイクロマニピュレーターを用いた手動の四分子解剖などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、1人の研究者がわずか数時間で数千もの組換え子子孫を単離できる点にあります。

本研究で使用した二倍体酵母細胞は、付属の原稿に記載されている通り、バーコード化されたプラスミドライブラリを用いてあらかじめ形質転換されており、冷凍ストックから細胞を復元するために-80 °Cで保存されています。翌日、これらを5 mLのYPD培地に200 µg/mLのG418を添加し、30 °Cで振盪しながら一晩培養します。一晩培養した細胞をPBSで3回洗浄し、その後、200 µg/mLのG418を添加した胞子形成培地を用いて、最終容量2 mLになるように再懸濁します。

室温で胞子形成培養液を攪拌します。新しい四分子（テトラド）の形成が停止するまで、毎日胞子形成の進行状況を観察してください。通常、培養液中に十分に形成された四分子が認められ、二分子（ダイアド）が比較的少なくなった後、2〜4日で完了します。

培養物を振とうから外し、四分子選別（tetrad sorting）を行う前に、室温で少なくとも7日間静置します。この手順で最も困難な点は、胞子を十分に分離させることです。経験的に、四分子選別前に胞子形成させた培養物を室温で少なくとも1週間振とうせずに静置させることで、胞子の分離が大幅に改善されることがわかりました。

二倍体細胞内のバーコード付きプラスミドは、胞子形成特異的なGFP融合タンパク質も保持しているため、胞子形成培養液からの四分胞子は、蛍光活性化細胞分取（FACS）によって検出および単離することが可能です。本プロトコールは、FACSAria IIを用いて開発されました。この手順を開始するには、胞子形成後の培養液をFACSソーターにロードし、前方散乱光（forward scatter）と側方散乱光（side scatter）の2つのゲートを設定して、デブリ、凝集細胞、および1ドロップレットあたりの複数細胞を除外します。

蛍光細胞の集団が存在するはずであり、PS 2 GFPリポーターコンストラクトを使用する場合、そこには2細胞期（dyads）および4細胞期（tetrads）が含まれます。GFP対FSCを用いて、これらの蛍光イベントを囲むようにゲートを設定してください。菌株のバックグラウンドによっては、4細胞期やその他の細胞を含む凝集塊を除去するために、追加のゲート設定が必要になる場合があります。蛍光イベントのFSCヒストグラムを確認してください。

この例では、左側のピークのイベントは主に四分子であり、右側のピークのイベントは一般的に出芽を伴う四分子です。赤色のバーで示される、主に四分子であるFSC（前方散乱光）の低いイベントを含む最終ゲートを適用します。約1,500個の四分子を顕微鏡スライド上にソートし、四分子と非四分子の割合をカウントして、ゲーティング条件の効率を確認してください。400倍の位相差顕微鏡を使用し、ソートされたイベントのうち約200個のみをカウントすることで、四分子の割合を正確に推定できますが、約1,500個をソートすることで、顕微鏡スライド上で細胞を探索する時間を短縮できます。

これらの明視野画像は600倍の倍率で撮影したものです。分取後、左側にテトラードの例を、右側に非テトラードの例を示しています。25個のテトラードを顕微鏡スライドに分取し、液滴内の細胞を位相差顕微鏡を用いて400倍の倍率で観察することで、ソーターがイベント数を正確に報告しているか定期的に確認してください。

ドロップレット内には25個の四分子体が含まれているはずです。そのランにおけるfax装置の分散を評価するため、これを3回または4回繰り返します。この手順に使用するアガープレートを準備するため、必要な数のYPD plus G 4 18プレートを、faxソーターの近くに配置した37 °Cのインキュベーターで1.5時間以上温めておきます。

このソーティングプロトコルの重要な特徴は、FAXソートされた四分胞子を、X溶液を含むアガールプレート上の特定の場所に正確にターゲットして回収できることです。まず、ソーターの自動細胞回収ユニットにランドマーク96ウェルプレートを設置します。次に、96ウェルプレートの1つのウェルに25個の四分胞子をソートするように、ソートレイアウトを作成します。

プレートあたり25個のテトラをウェルフォーマットでソートすると、コロニーが十分に分離されます。プレートの中央付近のウェルを選択してください。例えば、ウェルD5です。

37 °Cのインキュベーターからアガープレート10枚のスタックをソーターまで運びます。アガープレートを1枚取り、プレートの中央付近のアガー上にzy溶液を25 µLピペットで滴下します。その後、プレートをランドマーク96ウェルプレートに設置し、Xドロップレットをターゲットに合わせて調整します。

あらかじめ選択しておいたD5を用います。ソートを開始し、寒天プレート上のzyドロップレットの中央にテトラポッドを25個滴下します。

プレートを取り出し、カバーをかけます。スタック内の各プレートにつき25個のテトラードがzamoドロップレットに分取されるまで、プレートごとに分取を繰り返します。テトラードを含むプレートのスタックを37 degree Celsiusのインキュベーターに戻します。

次の10枚のプレートのスタックをソーターに運び、分級手順を繰り返します。四分胞子を含むアガープレートを37 °Cで1.5時間インキュベートした後、胞子を分離できます。この手順を開始するには、各プレートに滅菌済みの3 mmガラスビーズを15〜25個加え、5枚ずつの2つのスタックとしてプレートを3〜5分間振盪します。

プレートを左右または前後にしっかりと動かすことで、最も効率的に胞子を分離できます。ビーズがプレートの外縁に沿って回転するように動かさないでください。操作終了後は、ビーズをプレートに残したままにします。

ビーズを上にしたプレートのスタックを30 °Cのインキュベーターに入れます。37 °Cのインキュベーターから次のプレートのスタックを取り出し、ビーズを用いて胞子分離の手順を繰り返します。胞子を分離した翌日に、すべてのプレートを30 °Cで一晩インキュベートします。

ガラスビーズを乱さないように注意して、30 °Cのインキュベーターからプレートを取り出します。プレート上に小さなコロニーが形成されているはずです。プレートを深い容器の上に慎重かつ迅速に反転させ、ガラスビーズを取り除きます。

プレートを逆さまにした状態で底を軽く叩くと、プレートに付着したビーズを剥離させるのに役立ちます。容器は、ビーズが跳ね返ってアガープレートに当たることなく回収できる十分な深さである必要があります。各プレート上のコロニー数をカウントし、そのコロニー数を用いて、胞子の分離および回収の効率を推定します。

例えば、生存率がほぼ100%の交配で1プレートあたり25個の四分子（テトラッド）がある場合、高生存率である65個以上のコロニーを含む十分なコロニー数のプレートからは、1プレートあたり合計100個のコロニーが得られる可能性があります。各コロニーから細胞を、YPD液体培地にG418を添加した96ウェルプレートの個別のウェルに転移します。また、どのウェルに同じアガープレート由来のコロニーが含まれているかを記録しておいてください。

この情報は、後の四分胞子割り当ての補助に使用されます。ソフトウェアを用いることで、四分胞子からの胞子分離速度を大幅に向上させることができます。本手法の現在のバージョンでは、手動の解剖と比較して効率が多少低下していますが、すべての胞子の回収成功率に基づき、二項分布を用いて、1、2、3、または4つのコロニーを形成する胞子が少なくとも1つ正常に回収された四分胞子の期待分率を算出しました。

このグラフは、本研究で観察されたように、最終的に3つまたは4つの胞子四分子（テトラ）として構築される株数の大まかな目安となります。本研究では、プレートあたりのコロニー数が増えるにつれて、回収される完全な四分子の数も増加しました。手作業による解剖で決定された胞子生存率が100%に近い、25 radsで照射した株を149枚の寒天プレートに播種しました。

プレートあたりに観察されたコロニーの最大数は80であり、20個の胞子が独立したコロニーを形成できなかったことを示しています。プレートあたりの平均コロニー数は62でした。65個以上のコロニーを含む61枚のプレートから4,354個のコロニーを回収し、配列解析を行いました。配列解析の品質管理を通過した3,700株のうち、2,665株（72%）が、解析後に計算によって3つまたは4つの胞子四分子に割り当てられました。

この手法を用いれば、1時間あたり1,000個以上の四分胞子を処理することが可能です。ただし、3時間を超える精緻な作業を行う場合は、補助者の支援が必要になります。