仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞
2014年4月23日
ここでは、一貫性のある成果と効率向上を示しているセンダイウイルスと導入遺伝子のない人間性IPSCにヒト体細胞を再プログラムする当社の確立された手法を提案する。
この手順の全体的な目標は、センダイウイルスを使用してヒト人工多能性幹細胞を生成することです。これは、最初に形質導入する線維芽細胞を調製し、プレーティングすることによって達成されます。手順の次のステップは、細胞をセンダイウイルスに感染させることです。
次に、感染した線維芽細胞を新鮮なマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞に移します。最後のステップは、再プログラムされたものを手動で選択することです。現在、多能性幹細胞、最終的にはトランス遺伝子を使用せずに線維芽細胞細胞をI PSCに再プログラミングすることは、免疫標識とR-T-P-C-Rによって示すことができます。
既存の方法に対するこの技術の主な利点は、トランスのままで、費用対効果の高い方法で再プログラミング効率を向上させることです。FBSを使用して、これらの細胞を実験プレート用の24ウェルプレートに移し、細胞を6回の連続希釈で細胞接着に最適な密度を決定します。24ウェルプレートの各列は、1つの希釈シリーズの細胞を収容できます。
したがって、4つの細胞タイプを1つのプレートでテストし、希釈液を24時間インキュベートできます。翌日、形質導入のために3つの合流点にあるウェルを選択します。1つは80〜90%のコンフルエンス、1つは約60%のコンフルエンス、3つ目は形質導入の1時間以上前に約30%のコンフルエンスです。
形質導入融解のために、培地を300マイクロリットルの新鮮な線維芽細胞培地と交換します。仙台ウイルスチューブ1セットを摂氏37度で数秒間、その後終了します。室温で解凍します。
解凍したウイルスを6, 000 Gで10秒間遠心分離し、1本のマイクロ遠心チューブで氷上に保存します。形質導入する細胞の数に応じて計算されたウイルスの混合物を作ります。計算の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。
穏やかなピペッティングでウイルスをよく混ぜます。次に、最も密度の高い細胞に、2ボリュームのウイルスを追加します。中密度の細胞に 1 容量のウイルスを追加し、最も密度の低い選択に半分の量のウイルスを追加します。
プレートを渦巻かせ、翌日反応が起こるまで一晩インキュベートします。メディアを500マイクロリットルの新鮮な線維芽細胞メディアと交換します。これを2日後、形質導入細胞に対して行われた2回目の培地交換の3日後に再度行います。
10%FBSプレート500, 000細胞を皿ごとに含むDMEMを使用して60ミリメートル皿に覚せい剤細胞を調製し、一晩インキュベートします。翌日、覚せい剤細胞の培地を新しい培地と交換し、共培養のセットアップに進みます。まず、形質導入した線維芽細胞から培地を取り出し、DPBSで一度洗浄します。
次に、200マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTAを、形質導入した各細胞ウェルに5分以内に加えます。すべての剥離細胞を1本の15ミリリットルの円錐管にプールします。細胞を1,350Gで4分間スピンダウンします。
次に、上清を取り除き、ペレット化した細胞を約5ミリリットルの新鮮な培地で洗浄して、トリッピンを中和します。次に、1,350 G.Nextプレートでさらに4分間のスピンで細胞を収集します。ほとんどの細胞は、覚せい剤中の6つの段階希釈液として。
最初と最後の希釈は、細胞の死亡率によっては必要ない場合があります。一部の細胞をRNA抽出用に保存し、プレートを一晩インキュベートします。翌日、培地を10マイクロモルのROキナーゼ阻害剤Y 2 7 6 3 2を添加したヒトES培地と交換する。
次の日の間に細胞の生存を改善するために、培地を正常なunsu添加ヒトES培地に交換します。1週間の培養後、数日ごとに皿をチェックして、細胞塊のようなESコロニーの形成を確認します。それらが現れたら、成長を監視します。
形質導入から3週間後、ES細胞塊のコロニーは増殖の準備ができているはずです。覚せい剤フィーダーセルを24ウェルプレートに調製したのと同様に、60mmプレートに調製しました。コロニーを選ぶ前に、覚せい剤細胞の培地を10マイクロリットルのY2 7、6、3、2のES培地に交換します。
皿から一度に1つのコロニーを選びます。コロニーを15ミリリットルのチューブに移し、そこに溶液を入れます。ピペッターを使用してコロニーを分割します。
それから私を一つ覆ってください。バラバラになったコロニーとよく似ています。最終的には、各ウェルに1つの分割されたコロニーをロードし、できるだけ多くのウェルをロードします。
毎日の培地交換で細胞を維持し、6つのウェルプレート、次に60mmのディッシュに拡大します。通常、センダイウイルスに感染した線維芽細胞は、5日後まで形態変化を示さない。その後、細胞は丸い形をしており、核は大きく、細胞質は小さくなります。
この小規模プロトコルには、線維芽細胞密度、ウイルス力価、mesへのめっき密度など、最適化できるいくつかのパラメータが含まれています。異なる色で示されている異なる共流暢さの細胞の形質導入も最適化できます。メスフィーダー細胞との共培養を1週間行った後、部分的に再プログラムされた線維芽細胞は緩い形をしており、トリプシンを使用して採取するのではなく、簡単に摘み取ることができます。
完全に再プログラムされたI PSCは、部分的に再プログラムされた細胞から明確に識別できます。完全に再プログラムされた細胞は密集しており、コロニーは明確な境界を持つことができます。部分的に再プログラムされた細胞は、簡単に分離できる緩いクラスターを作ります。
IPSCクローンを数週間増殖させた後、幹細胞マーカーの染色はH nine細胞と比較して必要です。これらのIPCは、SSEA 4、OCT 4、TRA 81、nano Gなど、いくつかの予想される抗体に対して陽性であり、その多能性を裏付けています。R-T-P-C-R導入遺伝子の発現を使用した場合、ヒトIPSCクローンでは認められませんでした。
外因性OCT 4、SOX 2、klf 4、およびCmicのプライマー10個を、強力な導入遺伝子発現レベルを示したポジティブコントロールサンプルとともに使用しました。このビデオを見た後、体細胞を再プログラムして多能性幹細胞を誘導する方法と、それらを選択する方法、他の細胞から細胞を完全に再プログラムする方法をよく理解しているはずです。
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概要
この記事では、センダーイウイルスを使用して、ヒトの体細胞をトランスジェンフリーの人工多能性幹細胞（iPSC）に再プログラムする方法を紹介します。この手順は、iPSCの生成において一貫した結果と効率の向上を実証します。
主要な研究要素
科学の分野
- 幹細胞生物学
- 細胞の再プログラミング
- ウイルス学
背景
- 人工多能性幹細胞（iPSC）は再生医療に価値があります。
- 従来の方法では、しばしば安全性に懸念のあるトランスジェンの使用が含まれます。
- センダーイウイルスは、より安全な再プログラミングを可能にする非統合ベクターです。
- この方法は、体細胞からiPSCを生成する効率を向上させることを目的としています。
研究の目的
- トランスジェンなしでiPSCを生成する信頼性の高い方法を確立すること。
- 再プログラミングプロセスの効率を向上させること。
- 研究環境で容易に再現できるプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 線維芽細胞の準備と培養。
- 線維芽細胞のセンダーイウイルスによるトランスダクション。
- 感染細胞をマウス胚胎線維芽細胞フィードセルに移す。
- 免疫ラベリングとRT-PCRを通じて確認された再プログラムされた細胞の手動選択。
主要な結果
- 線維芽細胞からトランスジェンフリーのiPSCの成功的な生成。
- 複数の試行にわたる一貫した再プログラミング結果のデモンストレーション。
- 従来の方法と比較した効率の向上。
- 確立されたアッセイを通じた多能性の検証。
結論
- センダーイウイルス法は、iPSC生成のための安全かつ効果的なアプローチです。
- この技術は再生医療におけるさらなる研究を促進できます。
- 将来の研究では、これらのiPSCの様々な治療的文脈での応用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient generation of transgene-free human iPSCs using Sendai virus addresses a critical bottleneck in early discovery and disease modeling pipelines. This method enhances predictive confidence by eliminating residual transgene expression, supporting more reliable downstream differentiation and phenotypic screening. Its reproducibility and scalability position it as a foundational capability for translational research and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust generation of patient-specific iPSCs for hypothesis-driven disease modeling.
- Reduces mechanistic ambiguity by removing confounding transgene effects in functional assays.
- Supports target validation through reproducible reprogramming and marker-based confirmation.
- Facilitates portfolio triage by providing high-quality, integration-free cellular models.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, transgene-free iPSC lines for assay development and compound screening.
- Improves assay reproducibility by minimizing genetic and epigenetic artifacts.
- Enables quantitative readouts via immunolabeling and RT-PCR for pluripotency markers.
- Supports scalable workflows for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by maintaining genomic integrity.
- Reduces risk of misinterpreting disease phenotypes due to residual transgene expression.
- Aligns with requirements for preclinical model standardization and reproducibility.
Pipeline & Workflow Integration
This Sendai virus-based reprogramming method integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by generating high-fidelity iPSC models.
- Screening: Provides reproducible, transgene-free cell lines for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of pluripotency via immunolabeling and RT-PCR outputs.
- Translational Research: Maintains disease relevance and biomarker alignment for downstream studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for generating iPSCs across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in disease modeling.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of iPSC generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling reliable model systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, viral transduction, and stem cell characterization.
- Needs access to Sendai virus reagents, feeder cell infrastructure, and molecular analysis tools.
- Demands cross-team standardization of cell density, virus titer, and marker validation protocols.
- Adaptable to various human somatic cell sources with optimization of key parameters.
- Dependent on rigorous immunolabeling and RT-PCR to confirm transgene-free status and pluripotency.
