仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

この手順の全体的な目標は、センダイウイルスを使用してヒト人工多能性幹細胞を生成することです。これは、最初に形質導入する線維芽細胞を調製し、プレーティングすることによって達成されます。手順の次のステップは、細胞をセンダイウイルスに感染させることです。

次に、感染した線維芽細胞を新鮮なマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞に移します。最後のステップは、再プログラムされたものを手動で選択することです。現在、多能性幹細胞、最終的にはトランス遺伝子を使用せずに線維芽細胞細胞をI PSCに再プログラミングすることは、免疫標識とR-T-P-C-Rによって示すことができます。

既存の方法に対するこの技術の主な利点は、トランスのままで、費用対効果の高い方法で再プログラミング効率を向上させることです。FBSを使用して、これらの細胞を実験プレート用の24ウェルプレートに移し、細胞を6回の連続希釈で細胞接着に最適な密度を決定します。24ウェルプレートの各列は、1つの希釈シリーズの細胞を収容できます。

したがって、4つの細胞タイプを1つのプレートでテストし、希釈液を24時間インキュベートできます。翌日、形質導入のために3つの合流点にあるウェルを選択します。1つは80〜90%のコンフルエンス、1つは約60%のコンフルエンス、3つ目は形質導入の1時間以上前に約30%のコンフルエンスです。

形質導入融解のために、培地を300マイクロリットルの新鮮な線維芽細胞培地と交換します。仙台ウイルスチューブ1セットを摂氏37度で数秒間、その後終了します。室温で解凍します。

解凍したウイルスを6, 000 Gで10秒間遠心分離し、1本のマイクロ遠心チューブで氷上に保存します。形質導入する細胞の数に応じて計算されたウイルスの混合物を作ります。計算の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。

穏やかなピペッティングでウイルスをよく混ぜます。次に、最も密度の高い細胞に、2ボリュームのウイルスを追加します。中密度の細胞に 1 容量のウイルスを追加し、最も密度の低い選択に半分の量のウイルスを追加します。

プレートを渦巻かせ、翌日反応が起こるまで一晩インキュベートします。メディアを500マイクロリットルの新鮮な線維芽細胞メディアと交換します。これを2日後、形質導入細胞に対して行われた2回目の培地交換の3日後に再度行います。

10%FBSプレート500, 000細胞を皿ごとに含むDMEMを使用して60ミリメートル皿に覚せい剤細胞を調製し、一晩インキュベートします。翌日、覚せい剤細胞の培地を新しい培地と交換し、共培養のセットアップに進みます。まず、形質導入した線維芽細胞から培地を取り出し、DPBSで一度洗浄します。

次に、200マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTAを、形質導入した各細胞ウェルに5分以内に加えます。すべての剥離細胞を1本の15ミリリットルの円錐管にプールします。細胞を1,350Gで4分間スピンダウンします。

次に、上清を取り除き、ペレット化した細胞を約5ミリリットルの新鮮な培地で洗浄して、トリッピンを中和します。次に、1,350 G.Nextプレートでさらに4分間のスピンで細胞を収集します。ほとんどの細胞は、覚せい剤中の6つの段階希釈液として。

最初と最後の希釈は、細胞の死亡率によっては必要ない場合があります。一部の細胞をRNA抽出用に保存し、プレートを一晩インキュベートします。翌日、培地を10マイクロモルのROキナーゼ阻害剤Y 2 7 6 3 2を添加したヒトES培地と交換する。

次の日の間に細胞の生存を改善するために、培地を正常なunsu添加ヒトES培地に交換します。1週間の培養後、数日ごとに皿をチェックして、細胞塊のようなESコロニーの形成を確認します。それらが現れたら、成長を監視します。

形質導入から3週間後、ES細胞塊のコロニーは増殖の準備ができているはずです。覚せい剤フィーダーセルを24ウェルプレートに調製したのと同様に、60mmプレートに調製しました。コロニーを選ぶ前に、覚せい剤細胞の培地を10マイクロリットルのY2 7、6、3、2のES培地に交換します。

皿から一度に1つのコロニーを選びます。コロニーを15ミリリットルのチューブに移し、そこに溶液を入れます。ピペッターを使用してコロニーを分割します。

それから私を一つ覆ってください。バラバラになったコロニーとよく似ています。最終的には、各ウェルに1つの分割されたコロニーをロードし、できるだけ多くのウェルをロードします。

毎日の培地交換で細胞を維持し、6つのウェルプレート、次に60mmのディッシュに拡大します。通常、センダイウイルスに感染した線維芽細胞は、5日後まで形態変化を示さない。その後、細胞は丸い形をしており、核は大きく、細胞質は小さくなります。

この小規模プロトコルには、線維芽細胞密度、ウイルス力価、mesへのめっき密度など、最適化できるいくつかのパラメータが含まれています。異なる色で示されている異なる共流暢さの細胞の形質導入も最適化できます。メスフィーダー細胞との共培養を1週間行った後、部分的に再プログラムされた線維芽細胞は緩い形をしており、トリプシンを使用して採取するのではなく、簡単に摘み取ることができます。

完全に再プログラムされたI PSCは、部分的に再プログラムされた細胞から明確に識別できます。完全に再プログラムされた細胞は密集しており、コロニーは明確な境界を持つことができます。部分的に再プログラムされた細胞は、簡単に分離できる緩いクラスターを作ります。

IPSCクローンを数週間増殖させた後、幹細胞マーカーの染色はH nine細胞と比較して必要です。これらのIPCは、SSEA 4、OCT 4、TRA 81、nano Gなど、いくつかの予想される抗体に対して陽性であり、その多能性を裏付けています。R-T-P-C-R導入遺伝子の発現を使用した場合、ヒトIPSCクローンでは認められませんでした。

外因性OCT 4、SOX 2、klf 4、およびCmicのプライマー10個を、強力な導入遺伝子発現レベルを示したポジティブコントロールサンプルとともに使用しました。このビデオを見た後、体細胞を再プログラムして多能性幹細胞を誘導する方法と、それらを選択する方法、他の細胞から細胞を完全に再プログラムする方法をよく理解しているはずです。