Name: 定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶ 定量的RT-PCRによる個々のヒト胚性幹細胞の遺伝子発現プロファイリング手法。FACSで単細胞を分離し、細胞溶解後にcDNA合成と増幅を行い、遺伝子発現の異質性を解析します。再生医療研究に有用です。

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私たちは、原稿上で貴重な議論のためにイ·ラボのメンバーに感謝したいと思います。李研究室での作業は、細胞研究基金（TEDCO）を幹ニューヨーク幹細胞財団のロバートソン研究者賞からメリーランド州からの補助金によって支えられている。

96ウェルプレートの1の調製<ol><li> 9μlの単一細胞溶解溶液に単セルDNase1の1μLを混ぜる。 </li><li> 96ウェルPCRプレートの各ウェルに10μlの混合溶液を入れた。 </li></ol> FACS精製のために2。の切り離したhESC <ol><li>ヒトESメディアで中和し、37℃で20分間、1ミリリットルをAccutase 60 mmディッシュ、、からOCT4 :: EGFP ES細胞株を取り外します。 </li><li> FACS緩衝液1ml中に細胞集団を調製し、1×10 6細胞/ mlに細胞を調節する。 </li><li> 35μmのセルストレーナーキャップチューブを介して細胞試料を渡す。 </li><li>細胞選別の前に氷の中にチューブに保管してください。 </li></ol> 96ウェルプレートの各ウェルにおけるFACS精製した単一細胞の3。溶解<ol><li>訓練されたオペレータとのセルソーターにEGFP陽性細胞のためのサンプルをソートします。 96ウェルPCRプレートの単一のセルLysis/DNase1液に単一のセルを置く。必要に応じて、9サンプル6ウェルプレートは一月未満-80℃の冷凍庫に保存することができる。 </li><li>細胞溶解を室温でサンプルを5分間インキュベート。 </li><li>溶解反応を停止させる停止溶液1μLを加える。 </li><li>室温で2分間インキュベートする。 </li></ol> 4。逆転写<ol><li> 20μMのSMA-T15、SMA-Aの各0.5μlのアリコートに追加します。 </li><li>各ウェルに4μL5Xバッファー、2μlのDTT、1μL逆転写酵素、および1μlのdNTPを追加します。 </li><li>サーマルサイクラーに逆転写を行う。 <ol><li> 90分×42℃の熱プログラムを設定し、85℃×5分で逆転写酵素を不活性化する。 </li></ol></li></ol> 5。増幅<ol><li>各逆転写されたサンプルにExoSAP-IT試薬4を添加する。 <ol><li> ExoSAP-IT試薬を不活性化する15分間、15分間および80℃で、37℃でサンプルをインキュベートする。 </li></ol></li><li> PCR反応混合物Wを準備するSMA-P2（2 nM）のi番目</li><li>各逆転写されたサンプルにPCR反応混合物10μlを追加します。 </li><li>変性の20サイクル（30秒94°C）からなる増幅を行う、アニーリング（30秒、57°C）、及び（10分間68°C）伸長。 </li></ol> 6。定量RT-PCR性能<ol><li>各ウェルに2倍のSYBR Green PCRマスターミックス、1μLの増幅したcDNA、2 nMのプライマー、および7μlの水を10μlを加える。 <ol><li> ×40サイクル30秒、3秒、95℃に続いて、プログラムを設定し、60℃。 </li></ol></li><li>技術的なエラーのために二重に行う。 </li></ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

単一細胞遺伝子プロファイリングは、単一のセルまたは集団全体の機能性を予測するための主要なツールである可能性があります。技術的な制限により、全遺伝子プロファイリング解析は、人口の平均値に制限されています。個々の細胞亜集団との間の遺伝子発現パターンおよびレベルの変動は、誤った解釈を引き起こすことが提案されている。このような多様な細胞の側面はヒトES細胞で見つけることができますし、その異質性は多分化能と運命特定処理を維持するための微妙に異なる能力を引き起こします。 我々は開発し、個々の細胞における遺伝子発現の研究​​のために、単純でロバストな方法を提供する単一細胞の定量的RT-PCRのための検証。我々のプロトコルを検証するために、FACS精製した単一細胞の溶解物を半分に分け、精度をチェックするためにこの方法を適用した。単セルとの結果が連続的に希釈し、全RNAサンプルで確証された、我々は一貫性のある結果bを発見etween細胞溶解物の各半分（ 図4）。しかし、我々のプロトコルで、いくつかの制限があります。検出できない場合があり、我々は40以上の遺伝子の発現...

ほとんどの高等真核生物の個体数は、プールされた人口の分析をこのように不均一であり、それはそれらの細胞の機能を解釈することは困難であることが多い。集団内の個々の細胞は微妙に異なっていてもよく、これらの違いは、全人口1,2の性質及び機能に重要な影響を有することができる。特に、ヒト胚性幹細胞（hESC）は微妙に独特のやり方3、4系統の仕様に多能性と多様な電位の異なるレベルを引き起こす、不均一であることが知られている。例えば、異なる細胞表面抗原は、未分化の多能性幹細胞を分類するために使用することができ、5オースティンスミス基は、それらの形態、分化傾向と経路6シグナルの依存性をもとにして、マウス胚性幹細胞における多能性の異なるレベルを提案した。この現象は、ヒト胚に仮定されたnicの幹細胞を7。全体的な研究は、異なる幹細胞株ではなく、個々の単一の幹細胞の中で行われたのに対し、それは潜在的に全ての体細胞系統に向かって分化能力に影響を与える単一細胞レベルで多能性の異なるレベルを分析することは非常に興味深いかもしれない。 細胞および分子不均一性は、 &#39;単一細胞トランスクリプトーム」と呼ばれる、転写プロファイリングによって決定し、遺伝子発現レベルを8月10日を定量化するための新しいアプローチを強調している可能性があります。個々の細胞における遺伝子発現レベルの分析のために、我々は、単一細胞の定量的RT-PCRの、単純で堅牢なプロトコルを開発した。我々は最小限の技術的変動および相違点で、その結果、各単一細胞溶解物の半分だけでなく、ヒトES細胞の段階希釈した全RNAを比較することによって、我々のプロトコルの有効性と実現可能性を確認した。さらに、我々は均質なPを分離するために遺伝的レポーターラインを使用ジーンターゲッティングシステムを使用してhESCのopulation。 OCT4遺伝子座（OCT4-2A-EGFP-PGK-ピューロ構築物）およびTALENプラスミドの対を標的化するためのドナーベクター11を使用した。ドナーベクターとTALENプラスミドのペアは、私たちのクレオを使用してヒトES細胞（H9、WA09）に導入し、ヒトES細胞のクローン選択プロトコルおよびメンテナンスは私たちの日常的プロトコル12に基づいて実施された。我々は、この遺伝的レポーターラインは、OCT4にOCT4発現のために、EGFPを表現:: EGFPのhESCを確認した。 私たちの結果は（OCT4によって並べ替え:: EGFP強陽性細胞）は、個々のヒトES細胞は、OCT-4の発現レベルが高いが、Nanog発現の異なるレベルを保持することを実証している。したがって、我々の単一細胞の遺伝子発現アッセイは、多能性幹細胞の集団の不均一性を研究するのに有用であるべきである。

<table><tbody><tr><td>96ウェルPCRプレート</td><td>USA scientific</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Cell Lysis Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe 逆転写酵素</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNAポリメラーゼ High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix、PCR グレード</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Universal 2X Master Mix</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>FACS バッファー</td><td></td><td></td><td>45 ml PBS、5 ml a-MEM、100 &mu;l DNase、フィルター滅菌済み</td></tr><tr><td>35 &mu;m細胞ストレーナーキャップチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

定量的rt-pcrによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

幹細胞集団の不均一性は、異なる系統に向けてその分化の傾向として、幹細胞生物学の詳細な理解を妨げる。単一細胞トランスクリプトーアッセイは、個人差を解剖するための新しいアプローチすることができます。我々は、単一細胞のqRT-PCR法を開発し、この方法は、いくつかの遺伝子発現プロファイルにうまく機能することを確認した。単一細胞レベルでは、OCT4並び順各ヒト胚性幹細胞、:: EGFP陽性細胞は、OCT4高発現であるが、NANOGの発現の異なるレベルを有する。我々の単一細胞の遺伝子発現アッセイは、不均質集団に質問するのに有用であるべきである。

効率的かつ堅牢な単一細胞RNA増幅 ヒトES細胞の中で転写変動を最小限に抑えるために、我々は、OCT4を使用:: FACS精製用のEGFPのhESCクローン。 SMA-T15（GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT）プライマーを用いてSMA-A（ACATGTATCCGGATGTGGGで固定96ウェルプレートにOCT4 :: EGFP陽性細胞を選別した後、各細胞を溶解緩衝液で溶解し、完全長cDNAにポリ（A）+ RNAに変換）SMARTテンプレートスイッチング技術を用いることによって。過剰オリゴヌクレオチドは、SMA-P2とのcDNAのPCR増幅（GACATGTATCCGGATGT）13の18〜20サイクル行った後、ExoSAP-IT試薬で消化し ​​た。我々は定量RT-PCRの鋳型（ 図1）を作成するために増幅されたcDNAを使用していました。細胞の低量および単細胞3、図14、図15を用い...

単一細胞の遺伝子発現アッセイは、幹細胞の不均質性を理解するために必要とされる。

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

この手順の全体的な目的は、単一細胞定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いて、個々のヒト胚性幹細胞の遺伝子発現レベルをプロファイリングすることです。まず、フローサイトメトリー（FACS）を用いて、細胞溶解バッファーを含む96ウェルプレートの各ウェルに個々の細胞を分取します。次のステップでは、単一細胞溶解物からRNAを逆転写し、cDNAを合成します。次に、ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAを増幅させます。最終ステップとして、増幅されたcDNAに対して定量的なRT-PCRを行います。最終的に、このアッセイはヒト胚性幹細胞のような不均一な集団における遺伝子発現の研究に有用です。本手法の既存の単一細胞定量的人工血管に対する主な利点は、この手法、EEG、およびより堅牢なPrior to fax精製にあります。OCT 4 EGFPヒト胚性幹細胞（hESC）を60 mmディッシュから回収します。すべての培地を除去し、1 mLのAccutaneを加えて37 °Cで20分間インキュベートします。1 mLのヒトES培地でAccutaneを中和し、遠心分離して細胞をペレット化します。上清を廃棄した後、細胞を FACSバッファーで再懸濁し、濃度を1×10⁶ cells/mLに調整します。次に、細胞サンプルを35 µmのセルストレーナー付きチューブに通します。セルソーティングまで、チューブを氷上に保存してください。まず、1 µLのsingle cell D Ns oneと9 µLのsingle cell lysis solutionを含むマスターミックスを調製します。96ウェルPCRプレートの各ウェルに、このミックス溶液を10 µLずつ分注します。FACS解析用に、セルソーターを用いて単一のEGFP陽性細胞を96ウェルPCRプレートの各ウェルに分取するようにプログラムします。セルソーティング後、細胞溶解のため、サンプルを室温で5分間インキュベートします。溶解反応を停止させるために、1 µLのstop solutionを加え、室温で2分間インキュベートします。本手順を開始するために、まず96ウェルプレートの各ウェルに、20 µMのSMAT 15およびSMAAプライマーを含むEloqua液を0.5 µLずつ加えます。サンプルを80 °Cで5分間加熱します。その後、5xバッファーを4 µL、DTTを2 µL、逆転写酵素を1 µL、そしてdNTPsを1 µL加えます。サーマルサイクラーを用いて、各ウェルで逆転写を行います。温度プログラムを42°Cで90分間、続いて85°Cで5分間に設定します。逆転写完了後、逆転写酵素を不活化するため、各cDNAサンプルに4 µLのexo reagentを加え、37°Cで15分間インキュベートして過剰なオリゴヌクレオチドガイドを消化し、続いて80°Cで15分間インキュベートします。exo試薬を不活化するため、2 nMのSMAP 2プライマーを用いてPCR反応ミックスを調製します。各逆転写サンプルに、PCR反応ミックスを10 µL加えます。変性、アニーリング、伸長反応の20サイクルによる増幅を行い、サンプルの増幅後、R-T-P-C-Rの結果を確認するために、2枚の独立したプレートで2セットの定量R-T-P-C-R反応を実施します。2枚の96ウェルプレートの各ウェルに、10 µLの2x SYBR Green PCR master mix、1 µLの増幅済みcDNA、2種類のプライマー、および7 µLの水を加えます。プログラムを、95 °Cで3秒間、続いて60 °Cで30秒間に設定します。プライマーの誤差を低減するため、40サイクルのうちアニーリングステップを除去しました。本研究のアニーリングでは、Hessの全RNAをマイクログラム量からナノグラムおよびピコグラムレベルまで希釈し、テクニカルバリアビリティおよび低量の全RNAにおける差の検出を評価しました。10 ng/µLから0.1 pg/µLまで段階希釈した混合籾殻のmRNAを用いて、G-A-P-D-H遺伝子の定量R-T-P-C-Rを実施しました。各ドットは、段階希釈したmRNAおよび FACS でソートされた単一細胞mRNAのCT値を示しています。各サンプルとQR TPCRの結果との間に相関が認められ、複数の単一細胞で同様のCT値が示されました。OCT four EGFPレポーターHESC株から、EEG FP陽性の強い細胞を分取・選択するためにFACSを用いました。その結果、逆転写および増幅反応の異なるバッチ間での一貫性を検証したところ、陰性集団に対して約60%のEGFP陽性集団が認められました。Fax精製した単一細胞溶解液を2等分し、バッチ間の比較を行うためにそれぞれの半分にプロトコルを適用した。単一細胞溶解液の各半分におけるOCT fourのCT値の間には、有意な相関が認められた。単一ハスクの遺伝子発現をヒートマップで示したところ、OCT fourの発現レベルは一貫して強固であったが、別の幹細胞マーカー遺伝子であるNAN ogの発現レベルは変動していた。以上の結果を総合すると、本単一細胞遺伝子発現アッセイは、多能性幹細胞の集団の不均一性を研究するのに有用であることが示された。このビデオを視聴することで、単一細胞トランスクリプトームのためのQITPを適切に実施する方法について、十分な理解を得ることができます。

profiling-individual-human-embryonic-stem-cells-by-quantitative-rt-pcr

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生物学

単一細胞の発現プロファイリングは、個々の細胞の詳細な遺伝子発現解析が可能になります。我々は心筋細胞の単離のための方法を説明し、特定のターゲットの全トランスクリプトームのマイクロアレイや定量PCRのどちらかの結果のライセートを調製した。...

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

単一網膜細胞およびそれらのcDNAのその後の増幅を単離するための方法が説明されています。単一細胞トランスクリプトーム組織内に存在する細胞の不均質性の程度を明らかにし、まれな細胞集団の新たなマーカー遺伝子を発見します。付随するプロトコルは、多くの異なる種類の細胞に合わせて調整することができます。...

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ヒト胚性幹細胞におけるターゲティングジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子の強化

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三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

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私たちは、単一の哺乳類細胞を選別し、各細胞における最大96の標的遺伝子の発現を定量化する方法を説明しています。この方法には、絶対転写産物数の推定を可能にするための内部qPCR標準の使用が含まれます。...

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学ぶ 定量的RT-PCRによる個々のヒト胚性幹細胞の遺伝子発現プロファイリング手法。FACSで単細胞を分離し、細胞溶解後にcDNA合成と増幅を行い、遺伝子発現の異質性を解析します。再生医療研究に有用です。

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