定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

この手順の全体的な目標は、シングルセル定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(R-T-P-C-R)を使用して、個々のヒト胚性幹細胞の遺伝子発現レベルをプロファイリングすることです。これは、まず蛍光活性化細胞ソーティングを使用して、細胞溶解バッファーを含む96ウェルプレートの各ウェルに個々の細胞をソーティングすることによって達成されます。2番目のステップは、RNAを逆転写して、単一細胞ライセートからCDNAを生成することです。

次に、ポリメラーゼ連鎖反応によりCDNAが増幅されます。最後のステップは、増幅されたCDNAで定量的なR-T-P-C-Rを実行することです。最終的に、このアッセイは、ヒト胚性幹細胞などの不均一な集団における遺伝子発現の研究に役立ちます。

この技術の主な利点は、既存のシングルセル定量的人工血管よりも、この方法、EEGおよびより堅牢であることですファックス精製の前に。OCTの4つのEGFPのヒト胚性幹細胞またはHessは60ミリメートル皿から離れる。すべての培地を取り出し、1ミリリットルのアキュテインを加え、摂氏37度で20分間インキュベートします。

アキュテインを1ミリリットルのヒトES培地遠心分離機で中和し、細胞をペレット化します。上清を廃棄した後、細胞をFAXバッファーに再懸濁し、濃度を10倍から1ミリリットルあたり6細胞に調整します。次に、細胞サンプルを35μmのセルストレーナキャップチューブに通します。細胞選別の前にチューブを氷上に保存します。

この手順は、1マイクロリットルの単一細胞D、Ns、1、および9マイクロリットルの単一細胞溶解溶液を含むマスターミックスを調製することから開始します。それぞれについて、FAX分析プログラム用の96ウェルPCRプレートの各ウェルに10マイクロリットルの混合溶液をウェル移し、セルソーターは、細胞ソーティング後に単一のEGFP陽性細胞を96ウェルPCRプレートのウェルに選別し、細胞溶解のために室温で5分間サンプルをインキュベートする。溶解反応を停止するには、1マイクロリットルの停止溶液を加え、室温で2分間インキュベートします。

この手順を開始するには、まず96ウェルプレートの各ウェルに、0.5マイクロリットルの20マイクロモルSMAT15プライマーおよびSMAAプライマーを添加します。サンプルを摂氏80度で5分間加熱します。次に、4マイクロリットルの5 x buffer、2マイクロリットルのDTT、1マイクロリットルの逆転写酵素、および1マイクロリットルのDおよびtpsを追加します。

各ウェルに対して、サーマルサイクラーで逆転写を行います。サーマルプログラムを摂氏42度で90分間、続いて摂氏85度で5分間設定します。逆転写が完了したときに逆転写酵素を不活性化するには、各CDNAサンプルに4マイクロリットルのexo試薬を加え、摂氏37度で15分間インキュベートして過剰なオリゴヌクレオチドを消化し、続いて摂氏80度で15分間

exo試薬を不活性化するには、SMAPの2つのプライマーの2ナノモルでPCR反応ミックスを調製します。PCR反応ミックスを10マイクロリットル加えます。各逆転写サンプルに。

20サイクルの変性、ひざまずきおよび伸展からなる増幅を行い、サンプルの増幅後に2セットの定量的R-T-P-C-R反応を別々のプレートで行い、R-T-P-C-Rの結果を確認するために、2つの96ウェルプレートの各ウェルに10マイクロリットルの2×サイバーグリーンを追加します。PCRマスターミックス、1マイクロリットルの増幅CDNA、2つのプライマー、および7マイクロリットルの水。プログラムを摂氏95度で3秒間、続いて摂氏60度で30秒間設定します。

40サイクルの場合、プライマーの誤差を減らすために、ひざまずくステップが削除されます。この研究では、ヘスの全RNAのマイクログラム量をナノおよびピコグラムレベルに希釈して、技術的な変動性を評価し、G-A-P-D-H遺伝子の少量の総RNAの定量的R-T-P-C-Rの違いを検出しました。10ナノグラム/マイクロリットルから0.1ピコグラム/マイクロリットルに段階希釈されたプールされた殻のNA。各ドットは、FAXでソートされた段階希釈mRNAおよびシングルセルmRNAのCT値を示しています。

各サンプルとQR TPCRの結果との間には相関関係が観察され、いくつかの単一細胞が同様のCT値を示しました。FAXを使用して、OCT 4 EGFPレポーターHESCラインから強力なEEG FP陽性細胞を選別および選択しました。その結果、EGFP陽性集団は陰性集団と比較して約60%であり、逆転写反応および増幅反応の異なるバッチ間の一貫性を検証することが示されています。

ファックス精製したシングルセルライセートを半分に分割し、各半分にプロトコールを適用してバッチ比較を行いました。シングルセルライセートの各半分のOCT4 CT値との間には有意な相関が観察されました。シングルハスク遺伝子発現のヒートマップ表示は、OCT 4発現の一貫した堅牢なレベルを示していますが、別の幹細胞マーカー遺伝子であるNAN ogの異なるレベルを総合すると、このシングルセル遺伝子発現アッセイが多能性幹細胞の集団不均一性の研究に役立つことが示されています。

このビデオを見れば、シングルセルトランスクリプトームのQITPを適切に行う方法について十分に理解できるはずです。