ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

この手順の全体的な目的は、剪断応力が存在する条件下でヒト好中球の接着を可能にするフローチャンバーアッセイを用いて、好中球の強固な接着を測定することです。これは、まず精製された接着分子の基質、またはヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）などの内皮細胞表面を調製することによって行われます。第2のステップでは、2層のフィコリン（PHI call）遠心分離法を用いて、ヒト末梢血から好中球を分離します。

次に、分離したヒト好中球を剪断ストレス下で接着分子またはveの基質上に注入できるよう、フローチャンバーを組み立てます。最終ステップとして、フローチャンバー内での好中球の接着イベントを記録し、続いて強固な接着を慎重に定量します。最終的に、このフローチャンバーアッセイを用いて、精製された接着分子およびHX表面に対する好中球の強固な接着を実証します。

この手法は、自己免疫疾患の発症に関連することが知られている組織分子の遺伝的変異が持つ機能的重要性など、自己免疫分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。全身性エリテマトーゼ患者を対象とした遺伝学的研究により、好中球の強固な接着に関与するタンパク質であるβ2インテグリンの変異との強い関連性が示されています。私たちは、Mac-1と呼ばれるこのβ2インテグリンの遺伝的変異が強固な接着に及ぼす機能的な影響を評価するために、本アッセイシステムを開発しました。フローチャンバーで使用するための培養皿を準備します。

各35mm組織培養ディッシュにフィブリンおよびゼラチン溶液を1mL加え、プレート表面全体がコーティングされるように数回ピペッティングします。過剰なフィブロネクチンおよびゼラチン溶液を除去し、プレートを30分以上風乾させます。タンパク質マトリックス形成を最適化するため、80〜90%コンフルエンスまで培養したヒト臍帯静脈内皮細胞またはqveをtrypsin EDTAを用いて回収し、コーティング済み組織培養ディッシュに500,000個の細胞を播種します。

各ディッシュに2 mLの増殖培地を加え、37 °C、5% CO2でインキュベートします。細胞の状態を毎日目視で確認し、2日ごとに培地交換を行ってください。細胞が80～90% コンフルエントになるまで培養します。

この手順を開始するには、マーカーまたはペンを使用して、35 mmの組織培養ディッシュの中央に直径0.5 cmの円を描きます。マークした領域に、20 µg/mLのタンパク質A溶液を20 µL滴下します。ピペットチップを使用して、タンパク質A溶液を直径0.5 cmの円内の全領域に広げます。

ディッシュの表面に触れたり、傷をつけたりしないように注意してください。組織培養ディッシュを37 °Cで1時間インキュベートします。次に、各プロテインAコートプレートを1 mLのPBSで3回洗浄します。

3枚目の洗浄プレートからPBSを除去した後、プレート上の非特異的結合をブロックするために、標記領域に1%BSAを50 µL加えます。4 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、

ブロッキングしたプレートを1 mLのPBSで3回洗浄します。コーティングおよび本実験に使用するFC融合受容体リガンドキメラタンパク質溶液を調製します。ここでは、25 µg/mLのICAM-1 FC-Fcおよび0.5 µg/mLのP-selectin FC-Fcを使用します。マークした領域に基質を50 µL滴下し、組織培養皿を4 °Cで一晩インキュベートします。

ディッシュは2日以内に使用し、コーティング領域を乾燥させないでください。必要に応じて、PBSを添加してプレート上の50 µLの溶液量を維持してください。

本研究に用いる好中球は、書面によるインフォームド・コンセントを得た参加者の血液から単離します。採血により抗凝固剤入り採血管またはバキュテイナーに血液を回収した後、血液をPBSで1対1に希釈し、本手順のすべてのステップを行います。室温にて、末梢血単核細胞（pBMC）と好中球を分離するための2層のフィコリン溶液を50 mL遠心チューブに調製します。

まず、15 mLのheavy PHI callを加え、次に10 mLのlight fi callをheavy fi callの上に慎重に積層させます。light fi call層とheavy fi call層の間には、明確な境界ができるはずです。最後に、PHIを乱さないように、25 mLの希釈血液サンプルをlight fi callの上に慎重に積層させます。

チューブを室温で30分間遠心分離し、層を分離させます。遠心分離後、複数の層が形成されているはずです。赤血球が少量含まれる好中球層は、軽密度層と重密度層の間に位置します。転送ピペットを用いて好中球層を回収し、新しい50 mLチューブに移した後、PBSを加えて最終容量を50 mLにします。

225 ×gで10分間遠心分離します。遠心分離後、室温において好中球に赤血球がまだ混在している場合があります。上清を10 mLまで吸引します。

再懸濁を行う。好中球および赤血球のペレットを低速で短時間ボルテックスして懸濁させ、その後、50 millilitersのPBSで再度洗浄する。上清を吸引して混入した赤血球を除去する。ペレット化した細胞を、残ったPBSを用いて低速で短時間ボルテックスし、再懸濁させる。

25 millilitersの水を加え、10秒間緩やかにボルテックスします。赤血球を溶解させるため、25 millilitersの1.8%塩化ナトリウムを加え、直ちに225 ×gで10分間遠心分離して混合します。

混入した赤血球が溶血し、白色の好中球細胞ペレットが残っているはずです。好中球細胞ペレットをPBSで洗浄し、上清を捨てて、単離した好中球を10% FBS含有RPMI培地で再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて光学顕微鏡下で細胞濃度を測定した後、10% FBS含有完全RPMI培地を用いて細胞密度を1mLあたり500,000 cellsに調整します。

フローチャンバー接着アッセイを開始する前に、接着分子の発現をアップレギュレートおよび刺激するため、VEを20 nanograms per milliliterのヒトTNF alphaで4〜6時間プライミングします。VEの準備が整ったら、フローチャンバーを組み立てます。コンフルエントなVEを含む35 millimeterディッシュを顕微鏡ステージ上に配置します。

本ビデオでは、VEへの好中球接着のみを検討しますが、同様の手順を精製した接着分子への好中球接着の研究に適用することも可能です。パラレルプレートフローチャンバーをシリンジポンプおよび真空システムに接続し、好中球注入用に1本のラインを開けておきます。プレートの上にフローチャンバーを設置し、フローチャンバーアセンブリを固定します。顕微鏡に接続されたコンピュータでビデオ録画プログラムを開始します。

完全に成長したVEが見える、鮮明な視野が得られるまで、顕微鏡の視野とフォーカスを調整します。シリンジポンプを用いて、フローチャンバーをRPMI培地で洗浄します。チャンバー内および好中球注入ラインに気泡がないことを確認してください。

シリンジポンプを用いて、規定の速度で好中球をフローチャンバー内に注入します。好中球の接着は急速に起こるため、ビデオを記録してください。通常、接着イベントを定量化して解析するには、4〜5分間のビデオで十分です。このビデオクリップは、HU Eをコーティングしたフローチャンバーに好中球が結合する例を示しています。

接着細胞は、HU e コート表面において5秒以内に細胞径1個分未満しか移動しない細胞と定義されます。ここでは、ICAM-1 P-selectin コート表面またはuveコート表面に接着する好中球のサンプルビデオから、異なる時点におけるスクリーンショットを示します。

どちらの実験においても、好中球の流速は350 microliters per minute、好中球密度は500,000 cells per milliliterです。標準的な条件下では、4分間の記録期間中に50～70個のヒト好中球がリガンドまたはVEコーティング表面に強固に接着することが観察されました。しかし、異なるドナーを用いて同様の長さのビデオを記録した場合、好中球接着分子のアレル変異体や基質のアレル変異体によって、好中球の定量的な接着が大幅に変化する可能性があります。

好中球において、1分あたりの接着細胞数を算出することで、異なるドナー間の接着特性を比較することができます。この手順を行う際は、分離による細胞活性化に起因する細胞の凝集（クランプ）がないか、目視で確認することが重要です。さらに、フローサイトメトリーを用いて細胞活性化の状態を並行して評価することで、ドナー間および実験間での細胞の活性化状態が一致していることを確認できます。

この手法により、自己免疫疾患分野の研究者が、β2インテグリンMAC-1のCD11b鎖において異なるコーディング領域アレルを持つジェノタイプドナー由来のヒト原代細胞を用いて、細胞接着を探索する道が開かれました。これらの研究によって、ヒトの生体内におけるこれらのアレル変異の機能的影響を、慎重かつ定量的に評価することが可能となりました。