ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

好中球の接着を定量する方法が報告されている。この方法は、血管内に発生したものと同様の動的流れ環境を作成する。これは、せん断応力との生体内環境に似コンテキストで精製された接着分子（リガンド）のいずれかへの好中球の接着や内皮細胞基質（HUVEC）の調査を可能にする。

この手順の全体的な目標は、せん断応力の存在下でヒト好中球の接着を可能にするフローチャンバーアッセイを使用して、好中球の固い接着を測定することです。これは、最初に精製された接着分子の基質またはヒト臍帯静脈、内皮細胞、またはveなどの内皮細胞表面を調製することによって達成されます。2番目のステップは、遠心分離法と呼ばれる2層のPHIを使用して、ヒト末梢血から好中球を分離することです。

次に、分離されたヒト好中球をせん断応力下で接着、配位子、またはveのいずれかの基質に注入できるように、フローチャンバーを組み立てます。最後のステップは、フローチャンバー内で好中球の接着イベントを記録し、続いてしっかりとした接着を慎重に定量することです。最終的に、フローチャンバーアッセイは、精製された接着分子とHX表面に対する好中球の強固な接着を示すために使用されます。

この方法は、自己免疫の発達に関連することが知られている組織分子の遺伝的変異の機能的重要性など、自己免疫分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。全身性紅斑性眼瞼下垂症の患者を対象とした遺伝学的研究では、好中球の固い接着に関与するタンパク質である変異体およびAbeta two integrinとの強い関連が示されています。このアッセイシステムは、このベータの遺伝的変異の機能的影響を評価するために開発されました マックワンと呼ばれる内分泌 フローチャンバーで使用するための培養皿を準備するために、しっかりとした接着。

各35mm組織培養皿とピペットに1ミリリットルのフィブリンとゼラチン溶液を数回加えて、プレート表面全体がコーティングされていることを確認します。余分なフィブロネクチンとゼラチン溶液を取り除き、プレートを少なくとも30分間風乾します。蛋白質マトリックスの形成を最大限に活用するために、トリプシンEDTAの種500、各塗られたティッシュの培養皿に500、000の細胞を使用して80から90%の合流に培養された人間の臍帯静脈の内皮細胞またはqveを収穫する。

各ディッシュに2ミリリットルの増殖培地を加え、摂氏37度でインキュベートします。5%CO2細胞は、2日ごとに培地を交換しながら毎日目視検査する必要があります。細胞が80〜90%のコンフルエンスまで増殖するのを待ちます。

この手順を開始するには、マーカーまたはペンを使用して、35 mmの組織培養皿プレートの中心に直径0.5 cmの円を描きます。20 μリットル/ミリリットルのタンパク質を20マイクロリットル、マークされた領域の溶液。ピペットの先端を使用してタンパク質を広げ、直径0.5センチメートルの円内の全領域をカバーする溶液。

皿の表面に触れたり引っかいたりしないことが重要です。組織培養皿を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、各タンパク質をコーティングされたプレートを1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。

3番目の洗浄プレートからPBSを取り除いた後、マークされた領域に50マイクロリットルの1%BSAを注入して、プレート上の非特異的結合をブロックします。摂氏4度で2時間インキュベートします。2時間後。

詰まったプレートを1ミリリットルのPBSで3回洗います。コーティング用のFC接着受容体リガンドキメラタンパク質溶液を準備し、この実験とICAMで25マイクログラム/ミリリットルのFC Kyra1個と0.5マイクログラム/ミリリットルのPセレクチンFC Kyraを使用します。マークされた領域を50マイクロリットルの基質でコーティングし、組織培養皿を摂氏4度で一晩インキュベートします。

皿は2日以内に使用し、コーティングされた領域が乾燥しないようにする必要があります。必要に応じて。PBSを添加して、プレート上の溶液の50マイクロリットルを維持します。

この研究の好中球は、書面によるインフォームド コンセントを行った参加者の血液から分離されます。瀉血によって血液を抗凝固剤の採血チューブまたは真空器に採取した後、血液をPBSで1対1に希釈し、この手順のすべての手順を実行します。室温で、末梢血単核細胞またはp BMCと好中球を50ミリリットルの遠心分離管で分離するための2層phyコールを準備します。

まず、15ミリリットルのヘビーファイコールを追加し、次にヘビーファイコールの上に10ミリリットルのライトファイコールを慎重に重ねます。ライト fi コール レイヤーとヘビー fi コール レイヤーの間には、明確な境界線が必要です。最後に、PHIを乱さずに、希釈した血液サンプルの25ミリリットルをライトファイコールの上に慎重に重ねます。

遠心分離後、室温で30分間チューブを遠心分離する呼び出し層は、複数の層が存在する必要があります。赤血球が少ない好中球層は、軽いファイと重いファイの間にあります。トランスファーピペットハーベストを使用して呼び出し、好中球層を新しい50ミリリットルチューブに移し、PBSを最終容量の50ミリリットルに追加します。

Gの225倍で10分間遠心分離します。遠心分離後の室温では、好中球に赤血球が混ざっている可能性があります。上清を10ミリリットルまで吸引します。

マーク・レサス。好中球赤血球ペレットを短時間懸濁し、低速でボルテックスした後、上清を吸引する50ミリリットルのPBSで再度洗浄し、汚染された赤血球を除去します。ペレット化した細胞を残留PBSに短時間の低速渦で再懸濁します。

25ミリリットルの水を加え、10秒間静かに渦巻きます。シラミに。赤血球に25ミリリットルの1.8%塩化ナトリウムを加え、直ちにGの225倍で10分間遠心分離して混合します。

汚染された赤血球は、白い好中球細胞ペレットを残して横たわっているはずです。好中球細胞ペレットをPBSで洗浄し、上清を捨て、単離した好中球を10%FBSのRPMI培地に再懸濁します。ヘモサイトメーターを備えた光学顕微鏡で細胞濃度を決定した後、完全なRPMI 10%FBS培地を使用して細胞密度を500, 000細胞/ミリリットルに調整します。

フローチャンバー接着アッセイを開始する前に、VEをヒトTNFαのミリリットルあたり20ナノグラムで4〜6時間プライミングして、接着分子の発現をアップレギュレーションおよび刺激します。VEの準備ができたら、フローチャンバーを組み立てます。コンフルエントVEが入った35mmディッシュを顕微鏡テーブルに置きます。

このビデオでは、VEへの好中球接着のみを調べますが、精製された接着分子への好中球接着の研究にも同じ手順が適用され、平行プレートフローチャンバーをシリンジポンプと真空システムに接続し、好中球入力用に1本のラインを空けておきます。プレートの上にフローチャンバーを挿入し、フローチャンバーアセンブリを固定します。顕微鏡に接続されたコンピューターでビデオ録画プログラムを開始します。

VEが完全に成長したクリアな視野が見えるまで、顕微鏡の視野と焦点を調整します。シリンジポンプを使用して、フローチャンバーをRPMI培地ですすいでください。チャンバー内または好中球入力ライン内に気泡がないことを確認してください。

シリンジポンプを使用して、好中球を定義された速度でフローチャンバーに注入します。好中球の接着は急速に発生する可能性があるため、分析のために接着イベントを定量化するには、通常4〜5分のビデオで十分です。このビデオクリップは、HU Eコーティングされたフローチャンバーに好中球が結合する例を示しています。

接着細胞は、5秒以内に細胞の直径が1つ未満しか移動しない細胞として定義されます。HU eコーティングされた表面に。ここに示されているのは、ICAM One P selectinコーティング表面、またはuveコーティング表面に好中球が付着しているサンプルビデオとは異なる時点のスクリーンショットです。

どちらの実験でも、好中球の流速は毎分350マイクロリットルで、好中球密度はミリリットルあたり500,000細胞です。典型的な条件下では、50〜70人のヒト好中球が4分間の記録期間中にリガンドまたはVEコーティング表面にしっかりと付着することが観察されました。しかし、好中球接着分子の対立遺伝子変異体や基質中の対立遺伝子変異体は、異なるドナーで同程度の長さのビデオを録画することで、定量的な好中球接着を大幅に変化させる可能性があります。

好中球は、1分あたりの接着細胞の数を計算して、異なるドナー間の接着特性を比較できます。この手順を試みる際には、単離によって誘発される細胞活性化によって引き起こされる細胞クランプについて好中球を視覚的に確認することを覚えておくことが重要です。さらに、細胞活性化のパラレルフローサイトメトリー評価を実施して、細胞の活性化状態がドナー間および実験間で一致していることを確認できます。

この技術は、自己免疫の分野の研究者が、β 2インテグリン、MAC OneのCD 11 B鎖の異なるコード領域対立遺伝子を持つ遺伝子型ドナーからの初代ヒト細胞の細胞接着を探求する道を開きました。これらの研究により、これらの対立遺伝子変異体がヒトシステムにおける機能的影響を慎重かつ定量的に評価することが可能になりました。