Name: ヒト好フローチャンバー接着アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学ぶ好中球の流動チャンバー接着アッセイ法。せん断応力下でのヒト好中球の固着接着を定量化し、自己免疫疾患における接着分子の遺伝的変異の機能的影響を評価する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、ループス研究所（ニューヨーク州ニューヨーク）、NIH P01-AR49084、NIH R21〜DA026956およびNIH UL1-TR00165が主催しています。我々は彼の継続的な支援のためにロバートP.キンバリーに感謝します。

この研究のために募集され、すべてのドナーが書面によるインフォームドコンセントを与え、研究はバーミンガム治験審査委員会のアラバマ大学によって承認された。 1。HUVEC最初の培養およびサブカルチャー<ol><li>内皮細胞基本培地から構成される完全増殖培地中、インビトロでの培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、内皮細胞増殖因子を補充した（材料のリストを参照）。 注：この研究で使用した増殖因子には：5 ng / mlのヒト組換え上皮成長因子（hEGFは）、1.0 mg / mlのヒドロコルチゾン、50 mg / mlのゲンタマイシンおよび50 ng / mlのアムホテリシン-B（GA-1000）、2 ％ウシ胎児血清（FBS）、0.5 ng / mlの血管内皮増殖因子（VEGF）、10 ng / mlのヒト線維芽細胞増殖因子-基本ヘパリン（のhFGF-B）、20 ng / mlのヒト組換えインスリン様成長因子を有する（ R 3-IGF-1）、1μg/ mlのアスコルビン酸、および22.5μg/ mlのヘパリン。完全培地37℃で最初に調製し、次いで製剤の1カ月以内に使用するために4℃で保存することができる。 </li><li>細胞のためのフラスコを調製するために、完全増殖培地を、75cm 2の組織培養フラスコ（1ミリリットル/ 5cm 2で ）にした後、フラスコを加湿インキュベーター中、37℃/ 5％CO 2で平衡させて添加する少なくとも30分間。ヒトHUVECは、2,500〜5,000細胞/ cm 2の密度で、この平衡化した培養フラスコに直接播種する。 </li><li>メディアが平衡化されているが、すぐに37℃の水浴中でストックHUVECのクライオバイアルを解凍する。ボルテックスすることにより、元のストレージバイアル中の細胞を分散させ、次いで2,500〜5,000細胞/ cm 2の密度を達成するために事前に平衡化HUVEC完全増殖培地を含む培養フラスコに直接加える。優しく均等に細胞を分配して、インキュベーターにフラスコを返すために、フラスコを揺する。これらの細胞は、現在、1 回目の通過を表す。 </li> &lt;細胞が70〜80％コンフルエントになるまで李&gt;中2日ごとに変更する必要があります。 </li><li> HUVECを現在トリプシン/ EDTAで培養フラスコから収穫することができる。培養培地を細胞から任意の残留タンパク質およびカルシウムを除去するためにPBSでリンスし、培養フラスコから吸引される。 0.25％トリプシン-EDTA溶液を添加し、光学顕微鏡により評価されるように2-6分間の細胞の剥離の中には明らかである。 </li><li> 90％の細胞がプレートから切り上げたとき、2×トリプシンインヒビターを等量加えることによって、トリプシン処理を停止する。細胞の収穫を容易にするために、完全な増殖培地の他の同等の量を追加します。無菌15mL遠心管に分離した細胞を移す。 </li><li>室温で5分間225×gで分離した細胞を遠心分離する。上清を吸引した後、完全増殖培地を2〜3 mlの細胞を再懸濁。血球計およびトリパンブルーを用いて細胞濃度および生存率を測定。 </li><li>目を利用するE研究のための細胞、再シードさらに75 cm / cmで2万個の細胞の密度で細胞と2フラスコを採取し、2.2に進みます。あるいは、細胞は、将来の研究のために、この時点で凍結することができる。細胞凍結のために、室温で5分間、225×gでの遠心分離により細胞をペレット化。上清を吸引除去オフし、1×10 6細胞/ mlの濃度で10％DMSOを含むFBS中で細胞ペレットを再懸濁する。次いで、細胞懸濁液を、細胞凍結容器内に細胞を凍結した後凍結バイアルに移し、-80℃で保存する。 </li></ol> 2。HUVEC層準備<ol><li>凍結された2 番目の通路 HUVECの使用：復活と文化。活発に増殖する細胞を用いる場合は、2.2に進みます。 <ol><li> 37℃の水浴中で迅速にステップ1.8から2 番目の通路のHUVECを含有するクライオバイアルを解凍する。 15ミリリットル滅菌遠心管に凍結バイアルから細胞を移し、10ミリリットルの成長MEDIを追加UM。 </li><li>室温で5分間、200×gで細胞を遠心し、残留DMSOを除去し、上清を吸引除去する。 </li><li>完全な増殖培地で細胞ペレットを再懸濁し、75cm 2のフラスコに細胞を移す。総量約20〜25 mlに増殖培地を追加し、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 </li></ol></li><li>視覚的メディアとの毎日は、2日ごとに変化し、合流のための細胞培養を調べる。通常2-4日以内に、細胞は、フローチャンバーアッセイにおける使用のための準備ができ、その時点で80〜90％コンフルエンスに達する。 </li><li> （セクション5を参照）フローチャンバーで使用される培養皿を調製し、作るために、1〜10μg/ mlのフィブロネクチンmlおよび35mmの組織培養皿ピペット0.05％（w / v）のゼラチンを数回追加必ずプレート全体表面が被覆されている。タンパク質マトリックスの形成を最適化するために、少なくとも30分間、プレートを乾燥させ、過剰なフィブロネクチンとゼラチン水溶液と空気を除去。 Fibronectinゼラチン溶液を10倍まで再利用することができる。 </li><li>ステップ1.5から1.7で説明したようにトリプシン-EDTAを使用して、ステップ2.2からHUVEC細胞を収穫。各コーティングされた組織培養皿に500,000細胞を播種する。各皿に2ミリリットルの増殖培地を追加し、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 </li><li>細胞はステップ2.2のように密集するまで成長させる。細胞は、視覚的に、2日ごとに培地交換を毎日点検してください。事前のフローチャンバーアッセイと、接着分子の発現をアップレギュレートし、刺激する4-6時間にわたって20 ng / mlのヒトTNF-αでのHUVECの素数。 </li></ol> 3。精製リガンドコーティング<ol><li> 35mm組織培養皿の中央にマーカーやペンで直径0.5cmの円を描きます。 </li><li>プレートマークされたエリア内の20μg/ mlのプロテ​​インAの20μL。タンパク質を直径0.5cmの円内全域をカバーするソリューションを広めるためにピペットチップを使用してください。それは、Dの表面に触れたり傷つけたりしないことが重要ですISH。 1時間37℃でインキュベートする。 </li><li> 1mlのPBS（pH8.0）でタンパク質コートプレートの3回洗浄します。 </li><li>プレートに非特異的結合をブロックするマークされたエリア内のプレートに50μlの1％BSA。 4℃で2時間インキュベート</li><li>ステップ3.3のように、1mlのPBSでブロックし、プレート3回洗浄します。 </li><li>コー​​ティング用のFc接着受容体リガンドキメラタンパク質溶液を調製する。この実験では、25μg/ mlの少なくともICAM-1/Fcキメラ溶液とPBS中の0.5μg/ mlの少なくともP-Selectin/Fcキメラ液（pH8.0）を用いた。 </li><li>コー​​ト基板50μlとマークされたエリア。 4℃で一晩インキュベート料理は2日以内に使用されるべきであり、コーティングされたエリアは、乾燥させてはならない。プレート上の50μlのソリューションを維持するために必要な場合には、PBSを追加します。 </li></ol> 4。好中球の分離（室温で実行されるすべてのステップ） <ol><li>インフォームドコンセントを得た後、に瀉​​血によって参加者の血液を集めるnは抗凝固採血管またはバキュテナー（EDTAまたはヘパリン）。採血後、分離前のPBSで血液1:1希釈する。 </li><li> 50ミリリットル遠心管にPBMCおよび好中球を分離するための2層のFicollを準備します。最初の15ミリリットル重いフィコールを（材料のリストを参照して、ρ= 1.118から1.120）追加してから、慎重に10ミリリットルを重ね重いのFicollの上に（材料のリスト、ρ= 1.077から1.080を参照）フィコールを照らす。軽フィコールと重いフィコール層の間の鋭い境界線があるはずです。最後に、注意深くフィコール層を乱すことなく光のFicollの上に希釈された血液サンプル25mlのレイヤ。 </li><li>室温で30分間250×gでチューブを遠心分離する。注：これらのスピンは、遠心分離の終了時にローター減速中の細胞分離の可能性混乱を最小限に抑えるために遠心ローターブレーキはオフにする必要があります。遠心分離した後、（上から下へ）以下の層が存在している：トップ層は、プラズマfolloです光フィコール層の上にPBMC層によって結婚、いくつかの赤血球（RBC）と好中球の層がチューブの底に重フィコール層および赤血球続い軽鎖および重フィコールの間である。 </li><li>収穫し、室温で10分間、225×gで50ml及び遠心分離機の最終体積にPBSを追加し、移送ピペットを用いて新たな50mlチューブへの好中球層を転写する。 <ol><li>遠心分離後、依然として好中球と混合したRBCがあってもよい。ダウン10ミリリットルマークに上清を吸引除去する。チューブ（または簡単な低速ボルテックス）の穏やかな撹拌によって好中球赤血球ペレットを再懸濁し、PBS 50mlで再び洗う。 </li></ol></li><li>二回目の洗浄後、上清を吸引除去する。夾雑赤血球を除去するには、攪拌（または短いボルテックス）による残留PBS中ペレット化した細胞を再懸濁、RBCを溶解する10秒25ミリリットルのH 2 Oを、ゆっくりと渦を追加します。 <ol><li> 1.8％NaClを25ミリリットルを加え、すぐに混ぜる室温で10分間、225×gで遠心分離することによって。汚染したRBCは現在、白、好中球の細胞ペレットを残して溶解する必要があります。 </li></ol></li><li> PBSで好中球の細胞ペレットを洗浄します。 </li><li> 10％FBSを含むRPMI培地中で孤立した好中球を再懸濁し、血球計算板と光学顕微鏡下で細胞濃度を決定する。 </li><li>完全なRPMI-10％FBS培地で500,000細胞/ mlに細胞濃度を調整。 </li></ol> 5。フローチャンバー接着アッセイ<ol><li>フローチャンバーを組み立てます。顕微鏡テーブルの上にコンフルエントのHUVECまたは精製された接着性受容体リガンドを含む35mmディッシュを置きます。シリンジポンプ、真空システムと平行板フローチャンバーを接続し、好中球の入力のために開いた1行のままにします。プレートの上部にフローチャンバーを挿入し、フローチャンバアセンブリ13を固定します。 （ 図1を参照してください） </li><li> T接続されたコンピュータ上のビデオ録画プログラムを開始顕微鏡O。リガンド塗布領域内に十分に成長したHUVEC細胞またはフィールドとの明確なフィールドが表示されるまで、顕微鏡のフィールドとフォーカスを調整します。 </li><li>シリンジポンプを用いて、RPMI培地でフローチャンバーをすすぐ。チャンバー内に気泡や好中球の入力行がないことを確認してください。 </li><li>所望であれば、好中球は10分間、低用量（10 -8 M）のfMLPで下塗りしてもよい。これは異なるドナー14の間に好中球活性化の基礎レベルのマッチングを可能にする。 </li><li>定義された速度（1.5ダイン/ cm 2の剪断応力がこの研究で使用されているに等しい350μlの/分の速度）でのフローチャンバーへの好中球を注入するためにシリンジポンプを使用する。ビデオを録画。好中球の接着が急速に発生する可能性があるため、4〜5分の長さのビデオは、分析のための接着事象を定量するために通常は十分です。 </li><li>接着細胞は、1つのセル直径よりも小さいセルを移動させるように定義されるHUVECまたはリガンドでコーティングされた表面15,16上の5秒以内。このルールを使用して記録された映像に存在するフィールドで接着細胞の総数をカウントします。異なるドナーの好中球と同様の長さの動画を記録することによって、人は異なるドナーとの密着性を比較するために接着細胞/分を計算することができる。 </li></ol>

<ol><li>Harley, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+scan+in+women+with+systemic+lupus+erythematosus+identifies+susceptibility+variants%5BTitle%5D)+AND+%22in+ITGAM%2C+PXK%2C+KIAA1542+and+other%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants.</a> in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+ICAM1-ICAM4-ICAM5+Locus+Is+Associated+with+Systemic+Lupus+Erythematosus+Susceptibility+in+Multiple+Ancestry+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rheum.+Diseases%22%5BJournal%5D)">Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations.</a> Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).</li>
<li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+leukocyte+recruitment+in+the+inflammatory+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process.</a> Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).</li>
<li>Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+neutrophil-endothelial+cell+adhesion+in+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Crit.+Care%22%5BJournal%5D)">Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders.</a> J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).</li>
<li>Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+and+inflammatory+injury%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules and inflammatory injury.</a> FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).</li>
<li>Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+of+LFA-1+and+Mac-1+with+intercellular+adhesion+molecule-1+in+facilitating+adherence+and+transendothelial+migration+of+human+neutrophils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro.</a> J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).</li>
<li>Marlin, S. D., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+intercellular+adhesion+molecule-1+%28ICAM-1%29+is+a+ligand+for+lymphocyte+function-associated+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen.</a> Cell. 51 (5), 813-819 (1987).</li>
<li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates%3A+Distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65 (5), 859-873 (1991).</li>
<li>Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+steps+involved+in+the+transition+to+stationary+adhesion+of+rolling+neutrophils%3A+A+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review.</a> Microcirculation. 7, 385-394 (2000).</li>
<li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).</li>
<li>van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+a+parallel-plate+flow+chamber+for+studying+cellular+adhesion+to+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).</li>
<li>Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+flow+in+the+parallel+plate+flow+chamber%3A+Implications+for+cell+capture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies.</a> Biophys. J. 67, 889-895 (1994).</li>
<li>Kucik, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Adhesion+Under+Flow+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of Adhesion Under Flow Conditions.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Lupus+Associated+ITGAM+Variants+Alter+Mac-1+Function+on+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis.+Rheum%22%5BJournal%5D)">Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils.</a> Arthritis. Rheum. , (2013).</li>
<li>Bacabac, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shear+stress+in+parallel-plate+flow+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers.</a> J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).</li>
<li>Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. 36 (36), (2010).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J Vis Exp. (17), 745(2008).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+variations+in+absolute+wall+shear+stress+levels+within+one+species+and+between+species%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species.</a> Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).</li>
<li>Nagaoka, T., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+evaluation+of+wall+shear+stress+on+retinal+microcirculation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、全くのストレス条件下で好中球の接着を慎重に定量化のための最小限の活性化好中球の分離および単離をガイドします。好中球の接着は、炎症において重要なプロセスである。このプロセスにおける複数の分子の遺伝的変異体が自己免疫疾患の発症1,2素因が実証されているので、定量的に、ヒト好中球の強固な接着を評価することが可能なアッセイ系が必要である。このプロトコルに記載された方法は、せん断応力下での制御のin vitro環境での好中球の強固な接着性を慎重にかつ定量的な測定を可能にする。従って、この方法は、個体間の遺伝子型同定、定量好中球接着の直接的な比較は接着分子14における遺伝的変異の重要性を決定することを可能にする。 この方法にはいくつかのステップがachievを十分考慮に値するEの高い定量的かつ再現性のある結果。 HUVECの調製においては、フローチャンバーでそれらを使用する前に100％の細胞集密度を達成するために重要である。精製されたリガンドで被覆された表面を使用するため、基板の塗布面積は、リガンドの変性を避けるために完全に乾燥した許可すべきではない。さらに、ヒト好中球の調製は、実験の成功に不可欠です。血液から好中球を単離における重要な問題を穏やかに活性化を回避するためにボルテックスを最小化することによって処理し、室温で細胞を維持する（ すなわち、血液は室温で行われるべき氷および遠心分離ステップに記憶されるべきではない）と、単離および実験を完了含む可能な限り最短の時間内。また、これらのアッセイ17,18用の細胞を調製するために利用することができる追加の好中球の単離方法がある。 新たに単離されたヒト好中球を使用した実用的な観点からは、接着アッセイから<html>参加者の瀉血後3-6時間以内に開始しなければならない。好中球は取り扱いに非常に敏感であるため、採血と使用の間に長期の時間が検定結果に影響を与える可能性があります。従来のフローチャンバーアッセイに好中球細胞濃度を注意深く決定は、正確で再現性のある結果を達成することも必要である。 フローチャンバーアッセイ中に、流速が一致しており、実験期間全体にわたって乱流が存在しないことを保証するために慎重にビデオ記録を監視することが重要である。流速の変化や乱流の存在は、実験が繰り返されることを必要とするであろう。実験後は、好中球が凝集されないことを保証するために、微視的に残り、好中球を評価することも重要である。この時点での凝集は、好中球が有意に実験中の好中球の密度を変化させる可能性が活性化されたことを示すであろう。 コンテンツ&quot;&gt;フローチャンバーは、Qが=流量をチャンバ内に近い均質なせん断応力（τ=6Qμ/（WH 2）、μ=動粘度、およびフローチャンバーのW =幅、のH =高さを作成しますフローチャンバ15）。我々の研究において、我々は、1.5ダイン/ cm 2（0.25センチメートル、時間=ワットのせん断応力を作成する好中球の接着のために350μlの/分の流速を使用したが= 0.01インチ、水の粘度37℃でC（0.007ポアズ））をRMPI培地の粘度の近似値として使用した。特定のフローチャンバーは、一方が異なる生理学的条件を模倣するせん断応力の異なるレベルを達成するために流量を変更することができる。典型的な生理学的な剪断応力ヒト血管中0.5〜ダイン/ cm 13,16の間の範囲は、他の血管および他の動物におけるせん断応力は、表1 113,16,19 20に列挙したができる。 私たちの方法は、ヒトneutrophiの付着の研究に焦点を当てているがlsの、この方法は、好中球に限定されず、容易に接着または単純な変更を加えて他の細胞タイプの圧延の研究に適用することができる。また、この方法では基板は、異なる目的のために変更することができる。 このプロトコルは異なる研究に容易に適合しているが、いくつかの制限があります。ここに実装されているプロトコルは、分析のための主要な多数の細胞を必要とします。これは、小さな動物からの初代細胞の分析を排除することがあります。さらに、アクティブ/使用可能なコンホメーションで精製された接着リガンドを固定化する必要性は配位子の範囲を制限することができる。 Fc融合タンパク質の使用が大幅に板面に適切なリガンドコンフォメーションを達成する可能性を高める。それにもかかわらず、我々の方法は、接着事象の定量分析を可能にする重要な柔軟性を有する。これらの研究は、非常に私たちの接着受容体 - リガンド対の理解、および遺伝的変異の可能性のある機能の重要性を強化しますこれらのタンパク質は、ヒト疾患の病因である。

両方のβ2インテグリンおよびICAMリガンドの遺伝的変異体は現在、自己免疫疾患の1,2の発症に関連すると認識されている。これらの変異型を持つ個体に由来する細胞におけるこれらの変異体の機能的結果の決定は、これらの変異体は、自己免疫疾患の病因に寄与するかについての我々の理解のために必要である。そのような機能的研究は、天然に存在する遺伝的変異は、健康および疾患の両方における免疫応答を形成する機構の決定を可能にする。 SLEの具体例において、我々は今、ITGAMにおける変異（のCD11b）およびそのリガンド、ICAM-1、1,2強く疾患の発症に関連付けることを知っている。好中球は炎症反応で重要であるため、好中球の接着の定量的研究は、ITGAM / ICAMの炎症を変える方法遺伝的変異に機械論的な洞察を提供することがあります。 Neutrop細胞（EC）を内皮HIL強固な接着は、高度に制御されたプロセスであり、炎症反応3,4において重要な役割を果たしている。好中球の強固な接着は、ECの初期好中球の転がりとキャプチャをたどり、最終的には、生体内で輪廻する可能性があります。これらのプロセスは、内皮細胞上のICAM-1などの接着分子、ICAM-2、P-セレクチン、E-セレクチン、多くの異なる種類が関与し、好中球5-9 2インテグリンβ。このように、接着分子の異なる対立遺伝子変異体を有するドナーからの好中球の接着を慎重に定量化は、これらの遺伝的変異の機能的および病理学的結果を理解することが重要になります。 フローチャンバーの実験的使用は、 インビボ 10-12 における血管環境で観察されたものと同様の流体せん断応力を用いたin vitro環境を作成することができる。実際に、フローチャンバーアッセイは、ヒトumbiliと結合校正静脈内皮細胞（HUVEC）は、血管のin vivo環境を模倣することができる。この方法を使用すると、1は、内皮細胞に向けた全体的な細胞接着性を学ぶことができます。さらに、フローチャンバの高度に制御された環境はまた、細胞の評価は、特定の受容体 - リガンド相互作用の研究を容易にするために、例えばICAM-1などの精製された接着リガンドへの結合を可能にする。 ここでは、HUVECに、精製されたリガンドの基材に、ヒト末梢血の好中球の接着特性を研究するためのフローチャンバー接着アッセイ系を利用する方法を提示する。別の接着分子の対立遺伝子変異体を発現するドナーからの細胞を用いてこの方法を使用すると、私たちは、これらの遺伝的変異は、ヒト好中球の強固な接着を変更することができますどのように評価することができます。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン/EDTA</td><td>生命技術</td><td>25200-056</td><td>フェノールレッド</td></tr><tr><td>2x トリプシン阻害剤</td><td>生命技術</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 組織培養皿</td><td>コーニング株式会社</td><td>430165</td><td>標準組織培養処理表面</td></tr><tr><td>75 cm2 組織培養フラスコ</td><td>コーニング株式会社</td><td>430641</td><td>標準組織培養処理表面</td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>Dage-MTI</td><td>Model 300T-RC</td><td></td></tr><tr><td>細胞凍結容器&nbsp;</td><td>Biocision</td><td>BCS-045</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>(株)ロンザ</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC成長基礎培地</td></tr><tr><td>EGM-2 Bulletkit</td><td>Lonza Inc</td><td>CC-4176</td><td>基礎培地用HUVEC成長因子</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life technologies</td><td>10082-147</td><td>認定、ウ</td></tr><tr><td>シの皮膚から</td>熱不活性化<td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G9391</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>シグマ</td><td>F2006</td><td>ヒト血漿</td></tr><tr><td>フローチャンバー</td><td>Glyco Tech</td><td>31-001</td><td>35mm皿用円形フローチャンバー</td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-11191</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Heavy Ficoll</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517A</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R&Dシステムズ</td><td>720-IC</td><td>Fcキメラ</td></tr><tr><td>リンパ球分離培地メディア</td><td>テック株式会社</td><td>25072CV</td><td>Light Ficoll</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 中</td><td>寿命技術</td><td>11875</td><td>L-グルタミンとフェノールレッド</td></tr><tr><td>プロテイン A</td><td>シグマ</td><td>P6031</td><td>PBS</td></tr><tr><td>P-セレクチン</td><td>R& に再懸濁Dシステム</td>ズ<td>137-PS</td><td>Fcキメラ</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>KDサイエンティフィック</td><td>KDS270</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&#945;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>PHC3015</td>組<td>換えヒトタンパク質</td></tr><tr><td>トリパンブルーソリューション、0.4%</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

内皮細胞への好中球の強固な接着は、健康と病気の両方で炎症において重要な役割を果たしている。好中球の強固な接着の方法は、β2インテグリンファミリーのメンバーおよびICAMファミリーのカウンター受容体を含む多くの異なる接着分子を含む。最近では、両方で天然に存在する遺伝的変異は、2インテグリンβとのICAMは、自己免疫疾患と関連することが報告されています。したがって、これらの接着分子の様々な対立遺伝子型を持つ個体からの好中球の定量的接着能力は自己免疫の発生のメカニズムに関連して検討することが重要である。フローチャンバーシステムにおける接着試験は、 インビボで血管環境で観察されたものと同様の流体せん断応力を有する環境を作成することができる。ここで、我々は、ヒト末梢血の好中球の定量的な接着特性を研究するために、フローチャンバーアッセイ系を用いる方法を提示ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、精製されたリガンド基板秒。この方法では、接着受容体の異なる対立遺伝子変異体を有するドナー由来の好中球の接着能力を評価し比較することができる。この方法はまた、他の一次細胞型または細胞株の接着を評価するために修飾することができる。

好中球の例としては、精製されたリガンド（ICAM-1/P-Selectin）コーティングされたフローチャンバー（ 図2）またはHUVECコ ​​ーティングされたフローチャンバーアッセイ（ 図3）に結合する好中球への結合が示されている。図に示すように、好中球は連続的な流れの条件でコーティングされた表面またはHUVECに付着/蓄積し続ける。私たちの典型的な実験条件の下で、私たちはしっかりと4分間の記録期間中にコーティングされた表面またはHUVECに付着した50〜70人の好中球を観察することができます。しかし、好中球接着分子、または基質（精製リガンドまたはHUVEC）における対立遺伝子変異体の対立遺伝子変異体は、実質的に定量的な好中球の接着14を変化させることができる。 我々はまた、我々の研究で観察された好中球の接着のイベントの時間依存性を評価している。我々は、一定の流量条件を維持している間、それは細胞の接着特性が経時的に変化することが可能である。 However、私たちの研究では、比較的短い時間のコースにわたって、我々は時間をかけて接着力率のいずれかの一貫性の違いを観察しません。例えば、3〜4分間の時間点の間で観察さ接着と比較して1〜2分の時点での密着性の評価は、一貫して異なっていない。細胞が接着実験中に刺激されている場合はもちろん、次いで、経時的な接着特性の変化が期待できる。 我々の研究では、我々は意図的に試験前に10分間、低用量のfMLP（10 -8 M）で細胞をプライミングすることによって単離誘導好中球活性化を制御する。内皮細胞（私たちの研究でHUVEC）を、最適な白血球強固な接着のための接着分子の発現をアップレギュレートする前に活性化を必要とする。前処理の非存在下で、内皮細胞（HUVEC）は、非常に少ない好中球の接着を支援する。我々の研究では、10 ng / mlの使用前に4-6時間、TNFα治療を用いる。 IL-1β（10 ng / mlの）と<html> LPS（0.5μg/ mlの）はまた、内皮細胞を予め活性化するために使用することができる。重要なことに、未処理のHUVEC細胞接着は、特定の（受容体媒介性）好中球 - 内皮細胞相互作用によって引き起こされることを保証するためにネガティブコントロールとして使用することができる。あるいは、抗受容体抗体は、密着性の特異性を評価するために、特定の受容体を遮断するために使用することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> 顕微鏡ステージ上の図1。フローチャンバー構成は <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; 図2異なる時点（Aでコーティングされた表面をICAM-1/P-Selectinに付着した好中球のサンプルビデオからのスクリーンショット：0時点、B：1分の時点、C：2分の時点、およびD： 4分の時点）。 ICAM-1の濃度は25μg/ mlのであり、P-セレクチンは、0.5μg/ mlのである。好中球の流速は500,000細胞/ mlの好中球の密度を有する350μlの/分である。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> 図3種々の時点で、HUVECコ ​​ーティングされた表面に付着した好中球のサンプルビデオからのスクリーンショット。（A：0時点、B：1分の時点、C：2分の時点、およびD：4分の時点）。好中球の流速は500,000細胞/ mlの好中球の密度を有する350μlの溶液/である。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td>種</td><td >場所</td><td >剪断応力（ダイン/ cm 2） </td></tr><tr ><td>人間</td><td>共通caroid動脈</td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>鰓動脈</td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>総大腿動脈</td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>副腎大動脈</td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td>人間</td><td> Supraceliac大動脈</td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>浅fermoral動脈</td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>細静脈</td><td> 0.5〜5.0 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>網膜最初の細動脈</td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>網膜細動脈秒</td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>網膜最初の細静脈</td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>網膜二細静脈</td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td>犬</td><td>共通caroid動脈</td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td>ウサギ</td><td>共通caroid動脈</td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td>ラット</td><td>共通caroid動脈</td><td> 46.​​6 </td></tr><tr ><td>マウス</td><td>共通caroid動脈</td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td>犬</td><td>総大腿動脈</td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td>ウサギ</td><td>総大腿動脈</td><td> 156.8 </td></tr><tr ><td>ラット</td><td>総大腿動脈</td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> 異なる器官及び異なる種の表1。サンプルせん断応力。 *参考文献13、16、19、及び20からの集計。

好中球の接着を定量する方法が報告されている。この方法は、血管内に発生したものと同様の動的流れ環境を作成する。これは、せん断応力との生体内環境に似コンテキストで精製された接着分子（リガンド）のいずれかへの好中球の接着や内皮細胞基質（HUVEC）の調査を可能にする。

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

この手順の全体的な目的は、剪断応力が存在する条件下でヒト好中球の接着を可能にするフローチャンバーアッセイを用いて、好中球の強固な接着を測定することです。これは、まず精製された接着分子の基質、またはヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）などの内皮細胞表面を調製することによって行われます。第2のステップでは、2層のフィコリン（PHI call）遠心分離法を用いて、ヒト末梢血から好中球を分離します。次に、分離したヒト好中球を剪断ストレス下で接着分子またはveの基質上に注入できるよう、フローチャンバーを組み立てます。最終ステップとして、フローチャンバー内での好中球の接着イベントを記録し、続いて強固な接着を慎重に定量します。最終的に、このフローチャンバーアッセイを用いて、精製された接着分子およびHX表面に対する好中球の強固な接着を実証します。この手法は、自己免疫疾患の発症に関連することが知られている組織分子の遺伝的変異が持つ機能的重要性など、自己免疫分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。全身性エリテマトーゼ患者を対象とした遺伝学的研究により、好中球の強固な接着に関与するタンパク質であるβ2インテグリンの変異との強い関連性が示されています。私たちは、Mac-1と呼ばれるこのβ2インテグリンの遺伝的変異が強固な接着に及ぼす機能的な影響を評価するために、本アッセイシステムを開発しました。フローチャンバーで使用するための培養皿を準備します。各35mm組織培養ディッシュにフィブリンおよびゼラチン溶液を1mL加え、プレート表面全体がコーティングされるように数回ピペッティングします。過剰なフィブロネクチンおよびゼラチン溶液を除去し、プレートを30分以上風乾させます。タンパク質マトリックス形成を最適化するため、80〜90%コンフルエンスまで培養したヒト臍帯静脈内皮細胞またはqveをtrypsin EDTAを用いて回収し、コーティング済み組織培養ディッシュに500,000個の細胞を播種します。各ディッシュに2 mLの増殖培地を加え、37 °C、5% CO2でインキュベートします。細胞の状態を毎日目視で確認し、2日ごとに培地交換を行ってください。細胞が80～90% コンフルエントになるまで培養します。この手順を開始するには、マーカーまたはペンを使用して、35 mmの組織培養ディッシュの中央に直径0.5 cmの円を描きます。マークした領域に、20 µg/mLのタンパク質A溶液を20 µL滴下します。ピペットチップを使用して、タンパク質A溶液を直径0.5 cmの円内の全領域に広げます。ディッシュの表面に触れたり、傷をつけたりしないように注意してください。組織培養ディッシュを37 °Cで1時間インキュベートします。次に、各プロテインAコートプレートを1 mLのPBSで3回洗浄します。3枚目の洗浄プレートからPBSを除去した後、プレート上の非特異的結合をブロックするために、標記領域に1%BSAを50 µL加えます。4 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、ブロッキングしたプレートを1 mLのPBSで3回洗浄します。コーティングおよび本実験に使用するFC融合受容体リガンドキメラタンパク質溶液を調製します。ここでは、25 µg/mLのICAM-1 FC-Fcおよび0.5 µg/mLのP-selectin FC-Fcを使用します。マークした領域に基質を50 µL滴下し、組織培養皿を4 °Cで一晩インキュベートします。ディッシュは2日以内に使用し、コーティング領域を乾燥させないでください。必要に応じて、PBSを添加してプレート上の50 µLの溶液量を維持してください。本研究に用いる好中球は、書面によるインフォームド・コンセントを得た参加者の血液から単離します。採血により抗凝固剤入り採血管またはバキュテイナーに血液を回収した後、血液をPBSで1対1に希釈し、本手順のすべてのステップを行います。室温にて、末梢血単核細胞（pBMC）と好中球を分離するための2層のフィコリン溶液を50 mL遠心チューブに調製します。まず、15 mLのheavy PHI callを加え、次に10 mLのlight fi callをheavy fi callの上に慎重に積層させます。light fi call層とheavy fi call層の間には、明確な境界ができるはずです。最後に、PHIを乱さないように、25 mLの希釈血液サンプルをlight fi callの上に慎重に積層させます。チューブを室温で30分間遠心分離し、層を分離させます。遠心分離後、複数の層が形成されているはずです。赤血球が少量含まれる好中球層は、軽密度層と重密度層の間に位置します。転送ピペットを用いて好中球層を回収し、新しい50 mLチューブに移した後、PBSを加えて最終容量を50 mLにします。225 ×gで10分間遠心分離します。遠心分離後、室温において好中球に赤血球がまだ混在している場合があります。上清を10 mLまで吸引します。再懸濁を行う。好中球および赤血球のペレットを低速で短時間ボルテックスして懸濁させ、その後、50 millilitersのPBSで再度洗浄する。上清を吸引して混入した赤血球を除去する。ペレット化した細胞を、残ったPBSを用いて低速で短時間ボルテックスし、再懸濁させる。25 millilitersの水を加え、10秒間緩やかにボルテックスします。赤血球を溶解させるため、25 millilitersの1.8%塩化ナトリウムを加え、直ちに225 ×gで10分間遠心分離して混合します。混入した赤血球が溶血し、白色の好中球細胞ペレットが残っているはずです。好中球細胞ペレットをPBSで洗浄し、上清を捨てて、単離した好中球を10% FBS含有RPMI培地で再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて光学顕微鏡下で細胞濃度を測定した後、10% FBS含有完全RPMI培地を用いて細胞密度を1mLあたり500,000 cellsに調整します。フローチャンバー接着アッセイを開始する前に、接着分子の発現をアップレギュレートおよび刺激するため、VEを20 nanograms per milliliterのヒトTNF alphaで4〜6時間プライミングします。VEの準備が整ったら、フローチャンバーを組み立てます。コンフルエントなVEを含む35 millimeterディッシュを顕微鏡ステージ上に配置します。本ビデオでは、VEへの好中球接着のみを検討しますが、同様の手順を精製した接着分子への好中球接着の研究に適用することも可能です。パラレルプレートフローチャンバーをシリンジポンプおよび真空システムに接続し、好中球注入用に1本のラインを開けておきます。プレートの上にフローチャンバーを設置し、フローチャンバーアセンブリを固定します。顕微鏡に接続されたコンピュータでビデオ録画プログラムを開始します。完全に成長したVEが見える、鮮明な視野が得られるまで、顕微鏡の視野とフォーカスを調整します。シリンジポンプを用いて、フローチャンバーをRPMI培地で洗浄します。チャンバー内および好中球注入ラインに気泡がないことを確認してください。シリンジポンプを用いて、規定の速度で好中球をフローチャンバー内に注入します。好中球の接着は急速に起こるため、ビデオを記録してください。通常、接着イベントを定量化して解析するには、4〜5分間のビデオで十分です。このビデオクリップは、HU Eをコーティングしたフローチャンバーに好中球が結合する例を示しています。接着細胞は、HU e コート表面において5秒以内に細胞径1個分未満しか移動しない細胞と定義されます。ここでは、ICAM-1 P-selectin コート表面またはuveコート表面に接着する好中球のサンプルビデオから、異なる時点におけるスクリーンショットを示します。どちらの実験においても、好中球の流速は350 microliters per minute、好中球密度は500,000 cells per milliliterです。標準的な条件下では、4分間の記録期間中に50～70個のヒト好中球がリガンドまたはVEコーティング表面に強固に接着することが観察されました。しかし、異なるドナーを用いて同様の長さのビデオを記録した場合、好中球接着分子のアレル変異体や基質のアレル変異体によって、好中球の定量的な接着が大幅に変化する可能性があります。好中球において、1分あたりの接着細胞数を算出することで、異なるドナー間の接着特性を比較することができます。この手順を行う際は、分離による細胞活性化に起因する細胞の凝集（クランプ）がないか、目視で確認することが重要です。さらに、フローサイトメトリーを用いて細胞活性化の状態を並行して評価することで、ドナー間および実験間での細胞の活性化状態が一致していることを確認できます。この手法により、自己免疫疾患分野の研究者が、β2インテグリンMAC-1のCD11b鎖において異なるコーディング領域アレルを持つジェノタイプドナー由来のヒト原代細胞を用いて、細胞接着を探索する道が開かれました。これらの研究によって、ヒトの生体内におけるこれらのアレル変異の機能的影響を、慎重かつ定量的に評価することが可能となりました。

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 -...

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。...

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

このビデオでは、オールオンチップ法を使用した好中球走化性アッセイを実演しています。この方法では、免疫磁気陰性選択とそれに続くマイクロ流体チップ上の走化性アッセイにより、全血から好中球を直接分離できます。...

全血を用いた迅速な好中球走化性分析のためのマイクロ流体チップベースの方法

このビデオでは、白血球と内皮細胞などの細胞パートナーとの相互作用を特徴付ける層流ベースのアッセイを実演しています。この方法は、血管細胞の無傷で合流する層に灌流した場合の白血球の接着、接着解除、および転走に関する動的な洞察を提供します。...

白血球と内皮細胞との間の相互作用を研究するための層流ベースのアッセイ

このビデオは、白血球の動員に対する間質細胞の影響を調査する方法を示しています。パラレルプレートフローチャンバーモデルでは、炎症誘発性サイトカインが内皮細胞による接着受容体の発現を誘導し、好中球の動員と移動を促進します。間質細胞と内皮細胞との間のクロストークは、内皮細胞への好中球動員を減少させます。...

白血球動員に及ぼす間質細胞の影響に関するIn vitroフロー調査

感染部位における活性化内皮への好中球の順守は、ホストの炎症反応に不可欠なコンポーネントです。を可能にした好中球結合アッセイは、この報告書に記載...

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

このプロトコルは、堅牢で再現性の全血の1滴からヒト好中球走化性を測定するように設計分析について詳しく説明します。このアプローチは、好中球の分離のための必要性を回避し、アッセイ準備時間のほんの数分を要する。サンプル量が限られているマイクロ流体チップは、乳幼児や小さな哺乳類では時間の経過とともに好中球走化性の反復測定を可能にします。...

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

肝臓への白血球の動員は、固有の肝臓類洞内皮細胞で裏打ちされている肝正弦波の特殊なチャネル内に発生します。生理学的な剪断応力の条件下でヒト肝臓シヌソイド内皮を通過する白血球動員の位相差顕微鏡は、このプロセスの根底にある分子機構の解明を容易にすることができる。...

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

白血球は、傍細胞または経細胞経路を用いて内皮単層を横切る。私たちは、内因性の接合部の分布がVE-カドヘリンおよびPECAM-1を白血球経内皮移行中に生理的な流れの下2移住ルートを区別するために従うように、単純なアッセイを開発した。...

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

この記事では、全血からのチップ上の好中球単離と、単一のマイクロ流体チップ上の走化性試験とを統合することにより、迅速な好中球走化性アッセイを行う詳細な方法を提供する。...

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。...

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

学ぶ好中球の流動チャンバー接着アッセイ法。せん断応力下でのヒト好中球の固着接着を定量化し、自己免疫疾患における接着分子の遺伝的変異の機能的影響を評価する手法です。

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

さらに動画を探す