抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化

ウイルス感染に対する自然防御は、パターン認識受容体またはprrsによって引き起こされます。感染中に自然免疫系の細胞に存在します。細胞質PRRS、リグアイ、およびPKRは、ウイルスシグネチャーRNAに結合し、すべてのリーガアイを変化確認し、抗ウイルスシグナル伝達を活性化してリグアイとPKRの確認変化を監視し、すべての靭帯化in vitroヒトA 5 49細胞がリフトバレー熱ウイルスに感染しています。

クローン13をクローン化してPRRの活性化を促します。次に、コントロール細胞と感染細胞の細胞ライセートを調製して、リグアイとPKRの確認変化を分析します。限定的なトライイン消化が行われます。

タンパク質構造の確認的な変化が起こった場合、タンパク質は消化に対してより抵抗性があり、バンドは、オールガスネイティブページの形成を分析するためのウェスタンブロッティング分析が行われ、続いてウェスタンブロッティング分析が行われます。すべての靭帯化がより高い方で発生した場合、すべてのliga rig eyeとPKR複合体が見られます。リミテッドプロテアーゼ消化とネイティブページの主な利点は、これらの技術がregaとPKRの活性化の直接測定を容易にすることです。

これらの方法は、リグアイやPKRの活性化に関連するRNA種の正確な性質や起源など、自然免疫の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。これらの方法により、リグアイとPKRアゴニストに関する洞察を得ることができます。また、MDA fiveなどの他の細胞質センサータンパク質にも適用することができ、この手順を始める前に、私の研究室の博士課程の学生であるMila Vivaが手順を実証しています。

リフトバレー熱ウイルスクローン13(以下CL13と呼ぶ)は弱毒化ウイルス変異体であり、ドイツではBSLの2つの条件下で、PBS無血清培地および5%FCSを含む細胞培養培地を予温して取り扱う必要があることに注意してください。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブの水浴に入れます。CL13の1ミリリットルあたり1.25倍〜7分の1のPFUを無血清培地に調製し、10〜6分の2.5に感染させる。

感染の多様性またはMOIが5の5 49細胞は、ピペッティングエラーを考慮するために必要以上の約10%を準備します。インキュベーターからA 5 49細胞を取り出し、培地を吸引し、10ミリリットルのPBSスワールを追加するか、培養フラスコを傾けて細胞を洗浄し、PBSを取り除きます。次に、希釈したCL 13を1ミリリットル加えるか、または未感染の対照または模擬感染用

1ミリリットルの無血清培地を加え、15分ごとに1時間インキュベートします。フラスコを慎重に傾けて、媒体が均等に分布するようにします。感染の1時間後、無眼球を取り外してください。

5mLのプレウォーム細胞培養培地を5%FCSで加え、5時間インキュベートします。0.5%トリットン×100のPBSを調製し、摂氏4度に置きます。シリアのプロテアーゼ阻害剤を追加しないでください。

次に、細胞を冷たいPBSで洗浄し、10ミリリットルの新鮮なPBSを追加します。次に、セルスクレーパーを使用して、セルを皿から取り外します。細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、Gの800倍で室温で5分間遠心分離します。

スピン後、上清を除去し、細胞ペレットを0.5%Triton X 100で30マイクロリットルのPBSに再懸濁します。ライセートを新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移し、氷上で少なくとも10分間インキュベートします。ライセートをGの10, 000倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。

遠心分離後、清澄化した細胞溶解物を新しいチューブに移します。マイナス20°Cで清澄化された細胞溶解物の貯蔵中のタンパク質濃度を決定するためにブラッドフォードアッセイを実行するか、またはすぐに試みて消化するか、またはパターン認識受容体の確認変化のためのアッセイにネイティブページを進めます最初に希釈L one tosto chloro、メチルケトン処理またはPBS中のTPCKトリプシンを、各条件の2つの新しいチューブでミリリットルあたり2マイクログラムの最終作業濃度に希釈します。 CL 13 および非感染制御タンパク質溶解物の最終タンパク質濃度を PBS で 9 マイクロリットルの最終体積で 25 マイクログラムに調整し、1 セットの溶解物をインプット コントロールとして使用し、もう 1 セットを未処理のコントロール チューブに TPCK トリプシンで処理します。残りの2本のチューブに1マイクロリットルのPBSを追加します。

マイクロリットルあたり2マイクログラムの1マイクロリットルを追加します TPCKトリプシン 最終濃度をマイクロリットルあたり0.2マイクログラムにします。ピペッティングで反応を混合します。ライセートを摂氏37度で25分間インキュベートします。

5 x 変性サンプルバッファーを添加し、95°Cで5分間煮沸して反応を停止します。トリプシンのインキュベーション時間を延長しないことが重要です。トリプシン消化の正確なタイミングは、耐性タンパク質が検出されない場合、または多すぎる場合、バックグラウンドなしで耐性フラグメントを検出するために重要であることに注意してください、消化の持続時間を調整します。だから。

沸騰後、サンプルをマイナス20°Cで保存するか、サンプルを2つのドカル硫酸ナトリウムにロードします。12%の分解能のゲルの上に5%スタッキングゲルからなるポリアクリルアミドゲル。ブロモフェノールブルーがなくなるまで、ゲルあたり25ミリアンペアでタンパク質を分離します。

ゲルを泳動した後、タンパク質を一方のゲルからポリバインフッ化物膜に移し、リグアイに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングで分析し、他方のゲルをクマシブリリアントブルーG two 50でPKR染色する。次に、ゲルを25%エタノール、8%酢酸、および4%グリセロールに摂氏4度で保存するか、イメージングと分析に進みます。パターン認識受容体のオリゴマー状態を解析するには、PBSを使用して最終容量10マイクロリットルに50マイクログラムの細胞溶解物を調製し、最終濃度1××に5×サンプルバッファーを添加します。

すぐにサンプルを、5%スタッキングゲルと8%分離ゲルのネイティブポリアクリルアミドゲルにロードします。遅延すると、ネイティブコンプレックスが失われます。ゲルを1ゲルあたり20ミリアンペアで摂氏4度で泳動させます。

ブロモフェノールブルーバンドがゲルを離れてから45分後に、合計約1.5〜2時間後に電気泳動を停止し、添付文献に記載されているようにリグアイおよびPKRに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングを行い、リグアイまたはPKRによるウイルスアゴニストの認識により誘導される確認スイッチングおよびオリゴのアッセイを行い、このビデオに記載されているように限定的なプロテアーゼ消化およびネイティブページを行った。 模擬感染細胞ライセートのトリプシン消化はリグアイの急速な分解をもたらしましたが、クローン13の感染は30キロダルトンの耐性リグアイフラグメントの生成をもたらしました。PKRはまた、感染したサンプルのトリプシン消化に対して部分的な耐性を示し、これはリン酸化と一致し、トリプシン消化ゲルをkumasi brilliant blue G two 50で染色したトリプシン消化ゲルの効率と特異性を監視します。未処理のサンプルでは、モックにかけた同量のロードタンパク質が示され、C 13細胞ライセートをトリプシン消化にさらすと、全体的なタンパク質量が同等に減少します。

これは、トリプシン処理が非感染細胞の模擬サンプルとCL 13感染サンプルで同じ効率を持つことを示しています。追加のコントロールとして、R EYEとPKRのモノマーのみが検出された。転写因子IRF 3が含まれていましたが、これはモノマーとして存在しますが、R Eyeを介して活性化すると二量体化することが知られています。

クローン13に感染すると、塗抹標本の形でリグアイオリゴマー複合体が強く蓄積し、PKRおよびIRFの3つの二量体またはオリゴマーが定義されたタンパク質バンドとして蓄積します。これらの結果は、消化とネイティブページの限られたトリップが、感染時のリグアイとPKRの確認変化とオリゴ形成を監視するための有用なツールであることを示しています。このビデオを見れば、WIC アイと PKR の確認の切り替えと取得をマスターした後で、監視する方法を十分に理解できるはずです。

この手順の2日後にこの手法を実行できます。プロアッセイのような方法として、その開発後に刺激的なリガンドと安定した相互作用があるかどうかなどの追加の質問に答えるために、アッセイを行うことができます。この技術は、自然免疫の分野の研究者がウイルス刺激細胞のパターン認識受容体の活性化状態を調査する道を開きました。