Name: 抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 学ぶRIG-IとPKRの制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEによる活性化モニタリング法。A549細胞を用いてウイルス感染時のパターン認識受容体のコンホメーション変化とオリゴマー化を解析し、自然免疫応答のメカニズム解明に貢献します。

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私たちは、反リフトバレー熱ウイルスの血清を提供するためのCISA-INIAからアレハンドロ·ブランに感謝します。私たちの研究室での作業はForschungsförderung宝石でサポートされています。 2腹筋を§。 3 KooperationsvertragUniversitätsklinikumギーセンウントマールブルグ、新興ウイルス性疾患のためのライプニッツ研究科（EIDIS）、DFG Sonderforschungsbereich（SFB）1021、およびDFG Schwerpunktprogramm（SPP）1596。

感染のA549細胞の1。シーディング<ol><li>細胞培養培地中でCO 2、37℃でA549細胞をT75フラスコを育成し、5％（DMEM、10％FCS、526.6ミリグラム/ lのL-グルタミン、50.000 U / lのペニシリン、および50mg / Lのストレプトマイシンを補充した）。 </li><li>細胞を回収し始める前に、37℃に加熱した水浴中で細胞培養培地、PBSおよび0.05％トリプシン-EDTAを温める</li><li>培地を除去し、10mlのPBSで細胞を洗浄。再びPBSを削除します。 </li><li>トリプシン-EDTAの3ミリリットルを加え、フラスコ内に均等に分配する。 37℃のインキュベーターにフラスコを移し、5％のCO 2。 </li><li>すべてのセルが切断されるときに、細胞培養培地7mlの投稿、細胞を再懸濁し、15mlのファルコンチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> RTで5分間、800×gで細胞を遠心し、上清を除去し、10mlの新鮮な細胞培養培地中でペレットを再懸濁する。 </li><li>カウンティングチャンバーで細胞を数える。 </li><li> 2 T25フラスコ中の各細胞培養培地5mlに2.5×10 6個の細胞を加える。 37℃で16時間インキュベートし、5％CO 2。一つのフラスコを模擬対照とCl 13感染症の1のために提供しています。 </li></ol>リフトバレー熱ウイルスクローン13（CL 13）と2。感染<ol><li>注：Clで13は、ドイツでのBSL-2の条件下で処理することができる弱毒化ウイルスの変異体である。該当する国のガイドラインを参照してください。他の典型的なインターフェロン誘導物質は、センダイウイルス（菌株Cantell）またはニューカッスル病ウイルスだろう。 </li><li> 5％FCSを含有するプレ暖かいPBS、無血清培地および細胞培養培地。 </li><li> 5の感染多重度（MOI）で2.5×10 6個のA549細胞を感染させるために無血清培地中でClで13の1.25×10 7 PFU / mlに調製する。を考慮するために必要とされるよりもわずかに（約10％）より多くの量を準備ピペットのエラー。 </li><li> 1.3で説明したように、PBSで細胞を洗浄。 </li><li> Clで13希釈液1ミリリットルを追加したり、無血清培地（未感染の対照、モック）細胞に、37℃で1時間、5％CO 2でインキュベートする。それぞれ、Clで13希釈および無血清培地の平等な分配を確保するために、15分毎に丁寧にフラスコを移動します。 </li><li>感染の1時間後、接種物を除去し、5％FCSで予め温めておいた細胞培養培地5mlを追加し、37℃で5時間、5％CO 2でインキュベート。 </li></ol>細胞溶解物の3。準備<ol><li> 4℃でPBS / 0.5％トリトンX-100を調製セリンプロテアーゼ阻害剤を追加しないでください。 </li><li>冷PBSで細胞を洗浄し、新しいPBSの10ミリリットルを追加。 </li><li>細胞を掻き、ファルコンチューブに細胞懸濁液を移し、RTで5分間800×gで遠心する。 </li><li>上清を除去し、30μlのPBS / 0.5％トリトンX-100で細胞ペレットを再懸濁します。新しい1.5 mlチューブにライセートを移し、4℃で少なくとも10分間インキュベート</li><li> 10.00で溶解液を遠心分離0〜4℃で10分間xgで新しいチューブに清澄化した細胞溶解物（上清）を転送する。 </li><li>他の場所で説明したように33 Bradfordアッセイによりタンパク質濃度を決定します。 </li><li> -20℃で保存するか、トリプシン消化（4.1）またはネイティブPAGE（5.1）に進みます。 </li></ol>パターン認識受容体の構造変化4。決定<ol><li>細胞溶解物のTPCK-トリプシントリートメント<ol><li> 2μgの/μLの最終作業濃度にPBS中に、L-1-トシルアミド-2 - フェニルエチルクロロメチルケトンで処理​​した（TPCK）トリプシンを希釈する。 </li><li> 2本の新しいチューブにPBSで9μlの最終体積（モックまたはCl 13）各タンパク質溶解物の25μgの最終タンパク質濃度を調整します。したがって、25μgの溶解物それぞれ、2回モックと2回Clで13に感染した4本のチューブである必要があります。一つは、入力コントロール（未処理）およびTPCK-トリプシンを用いた治療のための1セットとして設定してください。 </li><li> （未処理）のPBS 1μl加えまたは12μgの/μLTPCK-トリプシン（最終濃度0.2μgの/μL）のμL細胞溶解物にピペッティングにより反応を混ぜる。それは、消化の効率が損なわれるため、TPCK-トリプシン分量を凍結融解しないでください。 </li><li> 25分間37℃で溶解物をインキュベートする。 5×変性サンプル緩衝液（250mMのトリス-HCl、pH6.8、10％SDS、50％グリセロール、25％のβ-メルカプトエタノール、0.5％ブロモフェノールブルー）と95℃で5分間煮沸を添加することにより反応を停止それは、トリプシンインキュベーション時間を延長しないことが重要です。何プロテアーゼ耐性断片が検出されない場合には、トリプシン消化の時間を短縮する必要があります。 </li><li>煮沸後、サンプルを-20℃で保存することができる</li></ol></li><li> SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）およびウェスタンブロッティング<ol><li> 12％分離ゲル上の5％スタッキングを含有するドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル上でサンプルをロードする。まで、ゲルあたり25ミリアンペアでタンパク質を分離ブロムフェノールブルーがなくなる。 </li><li>メタノールを用いてポリフッ化ビニリデン（PVDF）で30秒間膜を活性化し、転送バッファに入れ（48 mMトリス、39 mMのは、1.3mMのSDS、20％メタノールをグリシン）。 </li><li>セミドライブロッティングシステムとブロッティングを準備し、1時間10 Vでのタンパク質の移動を可能にします。メンブレンを取り出して水で簡単にそれをすすぎ、それが乾燥させます。 </li><li>まもなくメタノール中に移すことによって、膜を再活性化。 TBSで5分間洗浄します。 RTでまたは4℃のCO / Nで1時間、TBSが10％スキムミルクでブロック5分、TBSでそれぞれの膜3回洗浄します。 </li><li>表1で推奨されるように、抗体希釈液を調製し、室温でまたは4℃のCO / Nで1時間膜をインキュベート</li><li> TBS-Tで10分間ずつの膜3回洗浄します。 TBS中の1％スキムミルク中の1:20,000の希釈で西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した適切な二次抗体を加える。室温で45分間インキュベートする。 </li><li> 10分、TBS-Tでそれぞれの膜3回洗浄し、OTBSでNE追加の時間。 </li><li>信号検出のため、市販の化学発光キットとデジタルゲル画像システムを使用しています。 </li></ol></li><li>クマシーブリリアントブルーG-250染色<ol><li> 4.2.1で説明したように、SDS-PAGEを実行します。ブロモフェノールブルーがなくなるまで負荷SDSポリアクリルアミドゲル上のサンプルとは、ゲルごと25ミリアンペアでゲルを実行します。 </li><li> RTでクマシーブリリアントブルーG-250染色を行う。一定の振盪しながら全てのインキュベーションを行います。 </li><li> 30分間、40％メタノールおよび10％酢酸を含有する定着液にゲルを移し。 </li><li>脱色液（25％エタノール、8％酢酸）にバッファーを交換し、5分間インキュベートする。 </li><li> 1時間、40％メタノールおよび10％酢酸中の0.2％クマシーブリリアントブルーG-250のゲルを染色。 </li><li>脱色液でゲルを脱色し、10分、30分、および60分後にバッファーを交換する。 </li><li> 4℃で25％エタノール、8％酢酸、および4％グリセロール中でゲルを記憶する</lI&gt; <li> 4.2.8で説明したように画像化し、分析を行う。 </li></ol></li></ol>パターン認識受容体のオリゴマー状態の5。分析<ol><li>未変性PAGE <ol><li> PBSで最終容量10μl中で、細胞溶解物の50μgのを準備し、最終濃度を5×ネイティブ試料緩衝液（250mMのトリス-HCl、pH6.8、青色1％デオキシコール酸ナトリウム、50％グリセロール、0.5％ブロモフェノール）を追加1X。 </li><li>スタッキングとして5％、ゲルの解決など、8％ネイティブポリアクリルアミドゲルすぐにサンプルをロードします。任意の遅延は、ネイティブの複合体34が失われます。 </li><li> 50mMのTris-NaOHでpHを9.0と4℃でゲルあたり20 mAでゲルを実行し、384 mMのアノード及び50mMのTris、pH8.3、384 mMのグリシン、陰極バッファーとして1％デオキシコール酸ナトリウムなどのようなグリシン。 1.5〜2時間後の電気泳動が終了した（ブロモフェノールブルーバンドは、約45分以前の、ゲルを残している）。 </li></ol></li><li>ウエスタンブロット法<ol><li> polyvをアクティブメタノールで30秒間inylidene化ビニリデン（PVDF）膜とトービン緩衝液（25mMトリス、192mMグリシン、0.1％SDS、20％メタノール）に入れて下さい。 </li><li>メーカーの指示に従って、ウェットブロットチャンバーを組み立て、Towin緩衝液でタンクを埋める。 </li><li> 4℃で1.5時間、250ミリアンペアでブロッティングを行う</li><li>ブロッティングした場合は、上の4.2.3から説明したように進んで終了する。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

利害の対立が宣言されていません。

ウイルスや私は、システムをIFNの抗ウイルスタイプの活性化の存在を感知すると、成功した自然免疫応答22に重要である。ウイルス検出することにより迅速な応答および抗ウイルス防御機構の活性化を可能にする、RIG-IおよびPKRなどの病原体認識受容体（PRR）によって媒介される。ここでは、直接RIG-IおよびPKRの活性化状態を評価するために二つの方法を記載している。 RIG-Iと、PKRの立体構造変化を監視するためのツールとして、限られたプロテアーゼ消化は、まず、それぞれM·ゲイル·ジュニアと藤田6,17、およびJLコール30のグループによって記述されていた。これは、コンフォメーション変化によって引き起こされる、トリプシン処理し、感度の変化を評価するために高感度の方法を表しています。ウイルス感染細胞溶解物のトリプシン処理は耐RIG-I断片をトリプシンにつながったのに対し、トリプシン消化を適用し、我々は、疑似感染試料では、RIG-Iと、PKRの急速な低下を検出しました。 Similアルリー、トリプシン耐性のPKR断片はCl...

抗ウイルス宿主防御において重要な出来事は、いわゆるパターン認識受容体（PRR） の1,2による病原体の迅速な検出である。 RNAウイルス感染の細胞内検出は、2細胞質RNAヘリカーゼ、RIG-I（レチノイン酸誘導性遺伝子I）およびMDA5（メラノーマ分化関連タンパク質5）3-5に依存している。 RIG-Iは、2つのN-末端カスパーゼ動員ドメイン（カードなど）、中枢DECHボックス型RNAヘリカーゼドメイン、およびC末端ドメイン（CTD）4,6とから構成されている。 CTDおよびヘリカーゼドメインが非自己（ウイルス）RNAの認識に必要で​​あるのに対し、カードが抗ウイルスホストのステータスの確立につながる下流のシグナル伝達を仲介する。 RIG-Iが無音状態である場合、 すなわち、特定のRNAリガンドの非存在下で、第二のCARDは、中央ヘリカーゼドメインと相互作用し、自己阻害コンフォメーション7-11にRIG-Iを保つ。 RIG-Iは、短い二本に結合する5&#39;-三リン酸（5&#39;PPP）、長いdsRNA、およびポリU / UC豊富なRNA、多くのRNAウイルス12から16のゲノム上に存在する古典的な署名の構造を持つ鎖（DS）のRNA。 RIG-I活性化の二つの主要な特徴は、閉じたコンフォメー6,17およびホモオリゴマー6,18,19に切り替えている。コンフォメーションスイッチは、RNAが結合を増強下流のシグナル伝達のためのカードを公開し、活発なATPアーゼサイト8,9,11,20を再構成する。オリゴマーRIG-I複合体の形成は、抗ウイルスシグナル伝達のためのプラットフォーム11を形成するために、下流のシグナル伝達アダプター分子の増強された動員をもたらす。 RIG-I-調節されたシグナル伝達鎖は、最終的にアップレギュレーションインターフェロン（IFN-alpha/beta）遺伝子、完全な抗ウイルス応答21,22インターフェロン刺激遺伝子（ISGの）の、従って遺伝子発現のための転写因子IRF-3を活性化する。最も特徴ISGの一つは、RNA活性化proteiですNキナーゼ（PKR）23。 PKRは、真核生物翻訳開始因子2アルファ（eIF2αリン）キナーゼのファミリーに属し、N末端の二本鎖RNA結合ドメインおよびC-末端キナーゼドメインから構成される。キナーゼドメインは、PKR活性化のための二量体化界面が重要で構成しており、タンパク質の触媒機能を実行する。ウイルスのdsRNAのPKRの結合は、他の残基の間のThr 446で二量体化および自己リン酸化を可能にする、そのコンフォメーション変化をもたらす。 PKRは、それによってウイルスmRNA 23〜27の翻訳をブロックする、eIF2αリンのリン酸化を仲介する。 RIG-IおよびPKRの両方は、主要な構造再配列を受けるオリゴマー複合体を形成し、翻訳後リン酸化/脱リン酸化およびユビキチン化10,11,19,23,24,26-29によって修飾される。ウイルスのRNA構造がRIG-IおよびPKRを活性化している（どのような段階でウイルスのアンタゴニストをbの可能性がより良い理解のためにe）に干渉し、それは正確に活性化状態を決定することが重要である。両方のPRRのために、予め活性化は、トリプシン耐性タンパク質断片6,17,30及び高次オリゴマー6,18,19の出現をもたらすことが記載されている。しかし、抗ウイルス宿主応答1,2,24のこれらの重要な要因に関する文献が豊富に与えられ、直接法の適用は比較的まれと思われる。より広範な使用状況を刺激するのを期待し、我々は強固に、RIG-Iと、PKRの活性化状態を分析するために便利で敏感なプロトコルを提供する。 IFN有能なヒト細胞株A549は、RIG-IおよびPKR弱毒リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL 13）31,32の確立された活性化因子に感染している。単純な溶解手順の後、感染細胞の抽出物は、コンホメーションのスイッチングを評価するために、制限されたトリプシン消化/ウェスタンブロット分析によって試験され、青色ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）/ウェスタンブロットによるanalysオリゴマーの形成を測定することである。

<table><tbody><tr><td colspan="4">細胞培養</strong</td></tr><tr><td>>Dulbecco'修正されたイーグル」s medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985-47</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td></td><td>PAA 25030-024</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>PAA</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>PAA</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Chemicals</td></tr><tr><td>L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) トリプシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-804-849-C100</td><td>WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td></tr><tr><td>Mouseモノクローナル抗PKR(B10)</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-6282</td><td>WB:TBS</td></tr><tr><td>ウサギモノクローナル抗P-PKR(Thr446)</td><td>エピトミクス</td><td>1120-1</td><td>WB:TBS</td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗IRF-3</td>サンタ<td>クルーズ</td><td>sc-9082</td><td>WB:TBS</td></tr><tr><td>ウサギモノクローナル抗P-IRF-3(Ser386)</td><td>IBL</td><td>og-413</td> WB:TBSウサギの1%スキムミルクで1:100で1%スキムミルクTBSウサギのモノクローナル抗P-IRF-3(Ser386)IBL og-413 <td>WB:TBS</td></tr><tr><td>の1%スキムミルクで1:100ウサギ抗RVFV高免疫血清「C2」(MP-12)</td><td>Alejandro Brun CISA-INIA</td><td></td><td>WB提供:TBS</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗β-アクチン(8H10D10)</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3700</td><td>WB:TBS</td></tr><tr><td>ポリクローナルペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>0031460 1892914</td> WBの1:20,000 in 1%スキムミルクTBSポリクローナルペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギWB<td>:TBS</td></tr><tr><td>中の1%スキムミルクで1:20,000ポリクローナルペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>0031430 1892913</td><td>WB:TBS中の1%スキムミルクで1:20,000</td></tr></tbody></table>

抗ウイルスパターン認識受容体rig-iとpkrによって制限プロテアーゼ消化とネイティブpageの監視をアクティブ化

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

ウイルス感染に対する宿主防御は、自然免疫系のパターン認識受容体（PRR）による迅速な検出に依存している。細胞質内に、PRRは、RIG-IおよびPKRは、特定のウイルスRNAリガンドに結合する。これは、最初のコンホメーションのスイッチングおよびオリゴマー化を媒介し、その後、抗ウイルスインターフェロン応答の活性化を可能にします。抗ウイルス宿主遺伝子発現を測定するための方法は十分に確立されているが、直接、RIG-IおよびPKRの活性化状態をモニターする方法は、部分的にのみであり、以下で十分に確立。 ここでは、確立されたインターフェロン誘導剤、リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL 13）の感染の際に、RIG-IおよびPKR刺激を監視するために二つの方法を説明します。限られたトリプシン消化は、PRRはの立体構造変化を示す、プロテアーゼ感受性の変化を分析することができます。 RIG-IとPKR、whereaの急速な劣化を模擬感染細胞の結果から溶解物のトリプシン消化S Clで13感染はプロテアーゼ耐性RIG-I断片の出現につながる。また、PKRは、Thr 446で、その特徴的なリン酸化と一致し、トリプシン消化にウイルス誘導部分の抵抗を示している。RIG-IとPKRオリゴマーの形成は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により検証された。これらのタンパク質は疑似感染サンプル中の単量体として残るのに対し、感染の際に、RIG-IとPKRのオリゴマー複合体の強力な蓄積がある。 限られたプロテアーゼ消化し、ネイティブPAGE、ウェスタンブロット分析に連結された両方が、RIG-IとPKR活性化の2多様な段階の感度で直接測定を可能にします。これらの技術は、実行するのが比較的容易かつ迅速であり、高価な装置を必要としない。

RIG-IまたはPKRによるウイルス薬の認識は、コンホメーションのスイッチング6,17,30およびオリゴマー6,18,27をトリガします。我々は、それぞれ、限られたプロテアーゼ消化およびネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって、これら二つの活性化マーカーをアッセイした。 ヒトA549細胞は、IFNアンタゴニストのNS 35,36の突然変異により特徴付けられるリフトバレー熱ウイルスクローン13（13 Clで）に感染させた。により、機能のNSS存在しないために、クローン13が強く、細胞12,31,32,37における堅牢な抗ウイルス状態の確立につながる、RIG-IおよびPKRを誘導する。 RIG-Iの急速な分解における疑似感染細胞溶解物の結果のトリプシン消化とCl 13感染が30kDaの耐性、RIG-Iフラグメント図1Aの発生につながるのに対し。また、PKRは、ホスホンと一致する、感染した...

ウイルス感染に対する自然の防御はパターン認識受容体（PRR）によってトリガされます。ウイルスシグネチャのRNA、変更高次構造、オリゴマー化する2細胞質のPRR、RIG-IおよびPKRに結合し、抗ウイルスシグナル伝達を活性化する。方法は、都合のコンホメーションスイッチングと、これらの細胞質のPRRのオリゴマー化をモニタリングすることを可能にする記述されている。

抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

ウイルス感染に対する自然免疫防御は、パターン認識受容体（PRR）によって誘発されます。これらは感染時に自然免疫系の細胞に存在します。細胞質PRRであるRIG-IおよびPKRは、ウイルスのシグネチャーRNAに結合して構造変化を起こし、リガンド結合および抗ウイルスシグナルの活性化を行います。RIG-IおよびPKRの構造変化とリガンド結合をin vitroでモニターするため、ヒトA549細胞にリフトバレー熱ウイルスを感染させます。PRR活性化を刺激するためにクローン13を導入します。その後、コントロール細胞および感染細胞の細胞溶解液を調製し、RIG-IおよびPKRの構造変化を解析します。限定的なトリプシン消化を行います。タンパク質構造に共形変化が起こっている場合、タンパク質は消化への耐性が高まり、Western blotting解析でバンドが確認されます。全天然状態のPAGE（native PAGE）を行い、続いてWestern blotting解析を行うことで、複合体形成を分析します。完全なリガンド結合（ligamentization）が起こっている場合、より高分子のRIGAおよびPKR複合体が検出されます。限定的プロテアーゼ消化とnative PAGEの主な利点は、これらの手法によりRIGAおよびPKRの活性化を直接測定できることです。これらの手法は、RIG-IおよびPKRの活性化に関連するRNA種の正確な性質と起源など、自然免疫分野における重要な疑問への回答に役立ちます。また、これらの手法はRIG-IおよびPKRアゴニストに関する知見を提供します。さらに、MDA5などの他の細胞質センサータンパク質にも適用可能です。なお、本手順を開始する前に、私の研究室の博士課程学生であるMila Vivaが手順を実演します。以降、CL 13として言及されるリフトバレー熱ウイルスクローン13は弱毒化ウイルス変異株であり、ドイツではBSL-2条件下で取り扱う必要があることに留意してください。PBS無血清培地および5% FCS含有細胞培養培地を予熱します。これらを1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、恒温槽に置きます。2.5 × 10⁶個の細胞に感染させるため、無血清培地を用いて1.25 × 10⁷ PFU/mLのCL 13を調製します。感染多重度（MOI）5でA 5 49細胞を感染させます。ピペッティング誤差を考慮し、必要量より約10%多めに準備してください。インキュベーターからA 5 49細胞を取り出し、培地を吸引して10 millilitersのPBSを添加します。培養フラスコを回旋または傾けて細胞を洗浄し、その後PBSを除去します。次に、希釈したCL 13、または非感染コントロール（模擬感染）用の1 milliliterを添加します。無血清培地を1 mL加え、15分おきに1時間、インキュベートします。培地が均等に分散するように、フラスコを慎重に傾けます。感染から1時間後、接種液を除去します。5% FCSを含む予温した細胞培養液を5 mL加え、5時間インキュベートします。0.5% Triton X 100を含むPBSを調製し、4 °Cで保存します。 Syrian protease阻害剤は添加しないでください。次に、細胞を冷PBSで洗浄し、新鮮なPBSを10 milliliters加えます。その後、セルスクレーパーを用いて、ディッシュから細胞を剥離させます。細胞懸濁液を15 milliliterコニカルチューブに移し、室温で800 times Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を取り除き、0.5% Triton X 100含有PBS 30 µLで細胞ペレットを再懸濁します。ライセートを新しい1.5 mLチューブに移し、氷上で少なくとも10分間インキュベートします。ライセートを4°Cで10,000 ×g、10分間遠心分離します。遠心分離後、清澄化した細胞溶解液を新しいチューブに移します。ブラッドフォード法を用いて、清澄化した細胞溶解液中のタンパク質濃度を決定します。−20 °Cで保存するか、直ちに trypsin 消化または native PAGE に進み、パターン認識受容体の構造変化を解析します。まず、PBS中で、クロロメチルケトン処理済み trypsin または TPCK trypsin を最終的な使用濃度 2 µg/mL に希釈し、各条件につき2本の新しいチューブに分注します。CL 13 および非感染コントロールのタンパク質溶解液の最終タンパク質濃度を、PBSを用いて最終容量 9 µL で 25 µg に調整します。溶解液の一セットはインプットコントロールとして使用し、もう一セットは TPCK trypsin で処理します。未処理のコントロールチューブには、PBSを 1 µL 加えます。2 µg/µL TPCK trypsinを1 µL加え、最終濃度を0.2 µg/µLにします。ピペッティングにより反応液を混合します。溶解物を37 °Cで25分間インキュベートします。5倍濃度の変性サンプルバッファーを添加し、95 °Cで5分間加熱して反応を停止させます。トリプシンのインキュベーション時間を延長しないことが重要です。耐性断片をバックグラウンドなしで検出するためには、トリプシン消化の正確なタイミングが極めて重要であることに注意してください。耐性タンパク質が検出されない場合、または検出数が多すぎる場合は、適宜、消化時間を調整してください。煮沸後、サンプルを-20 °Cで保存するか、5%のスタッキングゲルと12%の分離ゲルで構成される2枚のSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルにロードします。ブロモフェノールブルーが泳動しきるまで、ゲル1枚あたり25 mAでタンパク質を分離します。ゲル電気泳動後、一方のゲルのタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に転写し、RIG-IおよびPKRに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析します。もう一方のゲルはクマシーブリリアントブルーG-250で染色します。その後、ゲルを25%エタノール、8%酢酸、4%グリセロールの混合液中で4°Cで保存するか、イメージングおよび分析に進みます。パターン認識受容体のオリゴマー状態を分析するために、細胞ライセート50 µgをPBSで最終容量10 µLに調製し、5xサンプルバッファーを最終濃度1xになるように添加します。サンプルを、5%のスタッキングゲルと8%の分離ゲルを含むネイティブポリアクリルアミドゲルに直ちにロードしてください。時間を置くと、ネイティブ複合体が消失します。ゲルを4°C、1ゲルあたり20mAで電気泳動します。ブロモフェノールブルーのバンドがゲルから流出した45分後、合計で約1.5時間から2時間後に電気泳動を停止させます。その後、RIG-IおよびPKRに対する抗体を用いて、添付文書に記載されている方法でウェスタンブロッティングを行い、RIG-IまたはPKRによるウイルスアゴニストの認識に誘発されるコンフォメーション変化を分析します。限定プロテアーゼ消化およびNative-PAGEは、本ビデオに記載の方法で実施しました。模擬感染させた細胞ライセートのトリプシン消化では、RIG-Iが急速に分解されましたが、clone 13感染では30 kDaの耐性RIG-Iフラグメントが生成されました。PKRもまた、感染サンプルにおいてトリプシン消化に対する部分的な耐性を示し、これはPKRのリン酸化と一致しています。トリプシン消化の効率と特異性をモニターするため、ゲルをCoomassie Brilliant Blue G-250で染色しました。未処理のサンプルでは、ロードされたタンパク質量が等量であることを示しています。模擬感染およびC13細胞ライセートをトリプシン消化させると、全般的なタンパク質量が同程度に減少します。これにより、非感染細胞において、トリプシン処理がモックサンプルとCL 13感染サンプルの両方で同等の効率を持つことが示されました。追加のコントロールとして、R EYEおよびPKRのモノマーのみが検出されました。転写因子のIRF3も含まれており、これはモノマーとして存在しますが、R Eyeを介した活性化時に二量体化することが知られています。クローン13の感染により、RIG-Iのオリゴマー複合体がスメア状に強く蓄積し、PKRおよびIRF3のダイマーまたはオリゴマーが明確なタンパク質バンドとして認められます。これらの結果は、限定的なトリプシン消化とネイティブPAGEが、感染時のRIG-IおよびPKRの構造変化およびオリゴマー形成をモニタリングするための有用なツールであることを示しています。このビデオを視聴することで、RIG-IおよびPKRの構造転換とオリゴマー化をモニタリングする方法を十分に理解できるはずです。この手法は、以下の手順に従い2日間で完了させることができます。刺激リガンドの導入後、そのリガンドとの間に安定した相互作用があるかなど、追加の疑問を解決するために、プロアッセイなどの手法を実施することが可能です。この技術により、先天性免疫分野の研究者が、ウイルス刺激細胞におけるパターン認識受容体の活性化状態を探索する道が開かれました。

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、モデルヘルペスウイルス、ガンマヘルペスウイルス68（γHV68）の溶菌複製における宿主シグナル伝達分子の重要な役割を識別するためのプロトコルを記述します。 γHV68溶菌レプリケーション用に遺伝子改変されたマウス系統と胎児線維芽細胞を利用して、プロトコルは、表現型の特徴とウイルス溶解複製におけるウイルス -...

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

我々は、ヒトのカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）、およびエプスタイン-バーウイルス（EBV）に密接に関連しているモデルヘルペスウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス68（γHV68）に感染したマウスにおける抗ウイルスサイトカイン産生を測定するためのプロトコルを記載している。遺伝的に改変されたマウス系統およびマウス胚線維芽細胞（MEF）を利用して、我々は、in vivoおよびex vivoの両方の抗ウイルス性サイトカイン産生を評価した。レンチウイルス形質導入によるノックアウト胚性線維芽細胞における自然免疫成分の発現を「再構成」、我々はさらに、特定の自然免疫の分子を特定し、差別的な抗ウイルスサイトカイン産生を調節する重要なシグナル伝達事象を分析。...

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

ここでは、IRF3転写因子のリン酸化依存性活性化の詳細な分析を可能にする手順について説明します。これは、高分解能のSDS-PAGEとネイティブPAGEを組み合わせ、複数のリン酸化特異的抗体を用いたイムノブロットと組み合わせることで実現されます。...

IRF3のリン酸化依存性活性化を監視するために、高解像度の方法

二本鎖 RNA ウイルス RNA の複製中に生産は、生来の免疫応答を誘導するパターン認識受容体によって認識できます。否定的な感覚の RNA のウイルスの低レベルの dsRNA と PRRs の相互作用は不明します。アレナ ウイルス科 dsRNA と個々 の細胞における PRR...

二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

HeLa 細胞を用いた哺乳類細胞周期中に二本鎖 RNA 結合蛋白質キナーゼ rna (PKR) 勉強 RNA インターアクターのための実験的アプローチを提案します。このメソッドは、クロスリンク RNA PKR 錯体と PKR バインド Rna を豊かにする免疫沈降にホルムアルデヒドを利用しています。これらの Rna は、高スループット シーケンスまたは qRT PCR...

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

この原稿では、tdTomatoおよびeGFPを発現する双方向レポータープラスミドをトランスフェクトしたHEK293T細胞を用いてBK-ポリオマウイルス転写活性のFACSベースの測定を行うプロトコルが提示される。この方法はさらに、ウイルス転写に対する新規化合物の影響を定量的に決定することを可能にする。...

フローサイトメトリーによるBKポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性の測定

CAL-1血漿細胞性樹状細胞株における内因性インターフェロン調節因子5ダイアライゼーションを分析するためのネイティブウェスタンブロット法が記載されている。このプロトコルは、他のセルラインにも適用できます。...

内因性IRF5ダイメネレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析

ウイルス性ポリタンパク質に埋め込まれた相同な宿主病原体タンパク質配列(SSHHPS)の短いストレッチを同定するための一般的なプロトコルを提示する。SSHHPSはウイルスプロテアーゼによって認識され、いくつかのグループIVウイルスによって特定の宿主タンパク質の標的破壊を指示する。...

インビトロ法とインシリコ法を用いた第IV族ウイルスSSHHPSの解析

このプロトコルは、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシス、およびパンノプトーシスなどの細胞死経路の開始を決定するための感染、無菌の侮辱、および癌のin vitro および in vivo...

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

免疫蛍光染色中のチラミドシグナル増幅により、HSV-1感染後のZBP1誘発ネクロトーシス中のリン酸化RIPK3およびMLKLの高感度検出が可能になります。...

ヒト細胞におけるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのZBP1依存性リン酸化の免疫蛍光染色のためのチラミドシグナル増幅

学ぶRIG-IとPKRの制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEによる活性化モニタリング法。A549細胞を用いてウイルス感染時のパターン認識受容体のコンホメーション変化とオリゴマー化を解析し、自然免疫応答のメカニズム解明に貢献します。

抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化

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