抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化

ウイルス感染に対する自然免疫防御は、パターン認識受容体（PRR）によって誘発されます。これらは感染時に自然免疫系の細胞に存在します。細胞質PRRであるRIG-IおよびPKRは、ウイルスのシグネチャーRNAに結合して構造変化を起こし、リガンド結合および抗ウイルスシグナルの活性化を行います。RIG-IおよびPKRの構造変化とリガンド結合をin vitroでモニターするため、ヒトA549細胞にリフトバレー熱ウイルスを感染させます。

PRR活性化を刺激するためにクローン13を導入します。その後、コントロール細胞および感染細胞の細胞溶解液を調製し、RIG-IおよびPKRの構造変化を解析します。限定的なトリプシン消化を行います。

タンパク質構造に共形変化が起こっている場合、タンパク質は消化への耐性が高まり、Western blotting解析でバンドが確認されます。全天然状態のPAGE（native PAGE）を行い、続いてWestern blotting解析を行うことで、複合体形成を分析します。完全なリガンド結合（ligamentization）が起こっている場合、より高分子のRIGAおよびPKR複合体が検出されます。限定的プロテアーゼ消化とnative PAGEの主な利点は、これらの手法によりRIGAおよびPKRの活性化を直接測定できることです。

これらの手法は、RIG-IおよびPKRの活性化に関連するRNA種の正確な性質と起源など、自然免疫分野における重要な疑問への回答に役立ちます。また、これらの手法はRIG-IおよびPKRアゴニストに関する知見を提供します。さらに、MDA5などの他の細胞質センサータンパク質にも適用可能です。なお、本手順を開始する前に、私の研究室の博士課程学生であるMila Vivaが手順を実演します。

以降、CL 13として言及されるリフトバレー熱ウイルスクローン13は弱毒化ウイルス変異株であり、ドイツではBSL-2条件下で取り扱う必要があることに留意してください。PBS無血清培地および5% FCS含有細胞培養培地を予熱します。これらを1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、恒温槽に置きます。2.5 × 10⁶個の細胞に感染させるため、無血清培地を用いて1.25 × 10⁷ PFU/mLのCL 13を調製します。

感染多重度（MOI）5でA 5 49細胞を感染させます。ピペッティング誤差を考慮し、必要量より約10%多めに準備してください。インキュベーターからA 5 49細胞を取り出し、培地を吸引して10 millilitersのPBSを添加します。培養フラスコを回旋または傾けて細胞を洗浄し、その後PBSを除去します。次に、希釈したCL 13、または非感染コントロール（模擬感染）用の1 milliliterを添加します。

無血清培地を1 mL加え、15分おきに1時間、インキュベートします。培地が均等に分散するように、フラスコを慎重に傾けます。感染から1時間後、接種液を除去します。

5% FCSを含む予温した細胞培養液を5 mL加え、5時間インキュベートします。0.5% Triton X 100を含むPBSを調製し、4 °Cで保存します。 Syrian protease阻害剤は添加しないでください。

次に、細胞を冷PBSで洗浄し、新鮮なPBSを10 milliliters加えます。その後、セルスクレーパーを用いて、ディッシュから細胞を剥離させます。細胞懸濁液を15 milliliterコニカルチューブに移し、室温で800 times Gで5分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を取り除き、0.5% Triton X 100含有PBS 30 µLで細胞ペレットを再懸濁します。ライセートを新しい1.5 mLチューブに移し、氷上で少なくとも10分間インキュベートします。ライセートを4°Cで10,000 ×g、10分間遠心分離します。

遠心分離後、清澄化した細胞溶解液を新しいチューブに移します。ブラッドフォード法を用いて、清澄化した細胞溶解液中のタンパク質濃度を決定します。−20 °Cで保存するか、直ちに trypsin 消化または native PAGE に進み、パターン認識受容体の構造変化を解析します。まず、PBS中で、クロロメチルケトン処理済み trypsin または TPCK trypsin を最終的な使用濃度 2 µg/mL に希釈し、各条件につき2本の新しいチューブに分注します。CL 13 および非感染コントロールのタンパク質溶解液の最終タンパク質濃度を、PBSを用いて最終容量 9 µL で 25 µg に調整します。溶解液の一セットはインプットコントロールとして使用し、もう一セットは TPCK trypsin で処理します。未処理のコントロールチューブには、PBSを 1 µL 加えます。

2 µg/µL TPCK trypsinを1 µL加え、最終濃度を0.2 µg/µLにします。ピペッティングにより反応液を混合します。溶解物を37 °Cで25分間インキュベートします。

5倍濃度の変性サンプルバッファーを添加し、95 °Cで5分間加熱して反応を停止させます。トリプシンのインキュベーション時間を延長しないことが重要です。耐性断片をバックグラウンドなしで検出するためには、トリプシン消化の正確なタイミングが極めて重要であることに注意してください。耐性タンパク質が検出されない場合、または検出数が多すぎる場合は、適宜、消化時間を調整してください。

煮沸後、サンプルを-20 °Cで保存するか、5%のスタッキングゲルと12%の分離ゲルで構成される2枚のSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルにロードします。ブロモフェノールブルーが泳動しきるまで、ゲル1枚あたり25 mAでタンパク質を分離します。

ゲル電気泳動後、一方のゲルのタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に転写し、RIG-IおよびPKRに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析します。もう一方のゲルはクマシーブリリアントブルーG-250で染色します。その後、ゲルを25%エタノール、8%酢酸、4%グリセロールの混合液中で4°Cで保存するか、イメージングおよび分析に進みます。パターン認識受容体のオリゴマー状態を分析するために、細胞ライセート50 µgをPBSで最終容量10 µLに調製し、5xサンプルバッファーを最終濃度1xになるように添加します。

サンプルを、5%のスタッキングゲルと8%の分離ゲルを含むネイティブポリアクリルアミドゲルに直ちにロードしてください。時間を置くと、ネイティブ複合体が消失します。ゲルを4°C、1ゲルあたり20mAで電気泳動します。

ブロモフェノールブルーのバンドがゲルから流出した45分後、合計で約1.5時間から2時間後に電気泳動を停止させます。その後、RIG-IおよびPKRに対する抗体を用いて、添付文書に記載されている方法でウェスタンブロッティングを行い、RIG-IまたはPKRによるウイルスアゴニストの認識に誘発されるコンフォメーション変化を分析します。限定プロテアーゼ消化およびNative-PAGEは、本ビデオに記載の方法で実施しました。模擬感染させた細胞ライセートのトリプシン消化では、RIG-Iが急速に分解されましたが、clone 13感染では30 kDaの耐性RIG-Iフラグメントが生成されました。PKRもまた、感染サンプルにおいてトリプシン消化に対する部分的な耐性を示し、これはPKRのリン酸化と一致しています。トリプシン消化の効率と特異性をモニターするため、ゲルをCoomassie Brilliant Blue G-250で染色しました。未処理のサンプルでは、ロードされたタンパク質量が等量であることを示しています。模擬感染およびC13細胞ライセートをトリプシン消化させると、全般的なタンパク質量が同程度に減少します。

これにより、非感染細胞において、トリプシン処理がモックサンプルとCL 13感染サンプルの両方で同等の効率を持つことが示されました。追加のコントロールとして、R EYEおよびPKRのモノマーのみが検出されました。転写因子のIRF3も含まれており、これはモノマーとして存在しますが、R Eyeを介した活性化時に二量体化することが知られています。

クローン13の感染により、RIG-Iのオリゴマー複合体がスメア状に強く蓄積し、PKRおよびIRF3のダイマーまたはオリゴマーが明確なタンパク質バンドとして認められます。これらの結果は、限定的なトリプシン消化とネイティブPAGEが、感染時のRIG-IおよびPKRの構造変化およびオリゴマー形成をモニタリングするための有用なツールであることを示しています。このビデオを視聴することで、RIG-IおよびPKRの構造転換とオリゴマー化をモニタリングする方法を十分に理解できるはずです。

この手法は、以下の手順に従い2日間で完了させることができます。刺激リガンドの導入後、そのリガンドとの間に安定した相互作用があるかなど、追加の疑問を解決するために、プロアッセイなどの手法を実施することが可能です。この技術により、先天性免疫分野の研究者が、ウイルス刺激細胞におけるパターン認識受容体の活性化状態を探索する道が開かれました。