Name: アラート、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular監視とローカリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶ頭部拘束ラットの皮質下脳構造における単一ニューロンのジャクスタセルラー記録法。布製ソックスによる体拘束と手術的ヘッドプレート埋め込みにより、覚醒状態での神経活動モニタリングと解剖学的局在特定を可能にする。

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これらの研究に資金を提供してくださったカナダ衛生研究所（助成金MT-5877)、国立衛生研究所NS058668（助成金およびNS066664）、および米国・イスラエル二国間財団（助成金2003222）に感謝いたします。

連邦政府が定める動物の管理と使用ガイドラインに従って - （350gの250）とカリフォルニア大学サンディ​​エゴ校で施設内動物管理使用委員会によって承認された実験的なプロトコルでは、女性のロングEvansラットで行った。 1.ボディ拘束へのラットを順応注：制限食でラットを置きます。拘束（後述）にラットを順応さただちに各毎日の取り扱いセッションの後一日一回のラットを養う。その初期重量の80％で動物を維持するための十分な供給を提供する。この量は、250グラムのメスのロングエバンスラットのための一日あたりの飼料の約6グラムである。 <ol><li>人間によって処理されることにラットを順応さ。ゆっくりと約5秒ごとに30秒の期間の手でラットを拘束。 2日連続で15分間日のためにこれを行います。訓練期間中のストレスの徴候について毎日ラットを監視します。兆候は苦労私を含む拘束、発声、および歯チャタリングn個の応答。 </li><li> 3 日目には、2日連続で15分間、一日のために（ 図1）身体を拘束布靴下にラットを置く。 </li><li> 5日目に、靴下の中にラットを置き、実験的な治具（ 図4）に剛性管の内側に靴下を置く。 2日連続で15分間の日にチューブでラットのままにしておきます。 </li><li>各トレーニングセッションの直後にラットを養う。最後のセッション（6 日目 ）の終わりに、食品への無制限のアクセスを与える。移植のために最後の訓練の日に過度のストレスの兆候を示していないだけで、これらのラットを選択します。 注：注入用ラットの選択は主観的であるが、我々の手で、ラットの90％以上が慣れに応じて、移植を受けることができることが見出された。 </li></ol> 2.録音商工頭部拘束機構を注入<ol><li>再を作るピンコネクタに裸のステンレス鋼線を半田付けすることによりフェレンスワイヤー。 3〜5ミリメ​​ートルは、ピンによって発見されたままであるようにワイヤーをカット。すべての手術のツールと​​一緒に、参照線をオートクレーブ。 </li><li>ケタミン/キシラジン麻酔を管理します。 95ミリグラム/腹腔内に5 mg / kgをキシラジンと混合kgのケタミンを管理します。初期投与量は1.5〜2時間持続する。必要に応じて、すべての30〜45分間、その後、麻酔を補足する。眼軟膏で動物の目に注油。 </li><li>麻酔の平面を決定するために、そのTOE引っ込め反射を確認し、必要に応じて麻酔を維持。 </li><li>耳バー付きの定位保持枠にラットを置きます （ 図3A）。頭の毛を剃るとポビドンヨード（10％溶液）で創傷部位を消毒する。彼らは鼓膜を損傷しないように適切に耳バーを挿入するように注意してください。鈍ヒントを耳バーが好ましい。 </li><li>メスapproxiで切開するmately耳の後ろに目の吻側 - 尾側レベルから頭蓋の正中線に沿って。切開の両側の皮膚2-3 mmのストリップをカットし、削除するにはハサミを使用してください。 </li><li>横方向の尾根に出て頭蓋の表面を露出させる骨膜を削り取る。瞬間接着剤の薄層で暴露頭蓋をカバーしています。 </li><li> ½直径ドリルバリ（ 材料の項を参照）を使用して、0〜80のネジよりもわずかに小さい直径で、小さな穴を開けます。ネジが下よりも横方向のトップで行くことができるように、ブレグマ縫合糸が横尾根を満たしている場所に後方、および30〜45°の角度で頭蓋にすぐに穴を開けます。 </li><li> 30〜45°の角度で、穴（約3回転）に0-80平底小ネジにねじ込みます。基盤となる脳組織の損傷を防ぐために、あまりにも深くでネジしないように注意してください。 </li><li>示した構成にさらに6本のネジに対してこの手順を繰り返し<strong&gt;（ 図3B）。すべてのネジのベースに瞬間接着剤を適用します。 </li><li> stereotaxマニピュレータにおける注射針を配置します。基準マークとして、外部の目的の開頭の場所のブレグマ縫合糸から測定し、近くに針で頭蓋内凹みを作るが、。 注：このデモでは、マークの定位座標は、3ミリメートルの後部とブレグマ縫合に横方向の1ミリメートルである。 </li><li>永久的なマーカーで凹みをマークします。その定位基準点となるように、マークの定位座標を注 （ 図3B）。 </li><li>希望する座標（3ミリメートルの後部と、この例ではブレグマへ横3ミリメートル）を中心に開頭術を行います。無傷の硬膜のままにしておきます。修正された人工脳脊髄液（125ミリモルのNaCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、3.1のCaCl 2、1.3のMgCl 2、pH7.4）中13（ 図3C）との開頭術を覆う。 </li&gt; <li> 4に0.2ミリリットルの遠心管をカット - 長さ5mm、およびキャップを切断。頭蓋上にチューブを置き、開頭の上にセンター。 </li><li>頭蓋にチューブのベースをシールするために、チューブの底を中心に歯科用セメントを適用します。暴露開頭術（ 図3D）にセメントが漏れないように注意してください。 </li><li>反対側の頭蓋プレート内（直径約1/2）別の小さな穴を開け、慎重に参照線を挿入します。ワイヤの端に記録アンプ（ 設備の項を参照）とのインタフェースピンをハンダ付けして基準線を構築します。それが脳に入ると、これは損傷の原因となり、基準線を移動しないでください。 </li><li>ワイヤが挿入された穴に瞬間接着剤を適用します。これは一時的に所定の位置にピンとワイヤーをシールします。 </li><li>ほぼ等しい部分に（ 材料の項を参照）シリコーンゲルキットの2つの部分を混ぜる。混合およびFILのために2分待ちゲルとの完全なL遠心管約⅓。 </li><li>ヘッドレストバーに（ 材料の項を参照）直角ポストクランプを取り付けます。プレートの底を動物の鼻に向かっているように、45°のピッチ角の保持バー（ 図2B）、ヘッドプレート（ 図2A）を取り付ける。これは、実験的な治具（ 図4）と一致するようにピッチ角を設定する傾斜計を使用することが有用である。 </li><li>バーは耳の棒と平行になるようにstereotaxマニピュレータアームに保持バーを取り付けます。プレートは尾最もネジにラムダ縫合糸と前の後部になるようにバーとプレートを下げます。 </li><li>ねじの頭がダウンして、動物の尾の方に向くように、援助の手アームとクランプで約45°の角度で（ 材料の項を参照、8-32スタッドまたはネジ）フロントヘッドボルトをつかみ。それはアリに触れるようネジを下げるerior 0-80ネジ （ 図3F、G）。 </li><li>歯科アクリルのある場所にボルトとプレートを固定します。歯科用骨ネジの頭の周りにアクリル、リファレンス·ピン、および遠心管の側面の周りを適用します。歯科アクリルを乾燥するのに約10分を待ちます （ 図3H）。 </li><li>インプラントに皮膚を接合し、歯科アクリルのエッジの周り歯科用セメントの層を適用します。セメントを乾燥するのを待ちます。 </li><li>遠心管のキャップにいくつかの穴を突く、チューブのキャップを配置します。 </li><li>援助の手クランプを取り外します。その後、慎重にstereotaxからヘッド保持バーを削除してから、バー（ 図3I）からヘッドプレートを取り外します。 </li><li> stereotaxから動物を削除し、術後ケアとモニタリング、該当するすべての規則に従って、規制、法律（ 例えば、ブプレノルフィン0.02 mg / kgを、24の最小ごとに8-12時間を管理する時間）。炎症はインプラントの縁の周りを開発する場合、解決まで毎日患部に抗生物質軟膏の薄い層を適用する。 </li></ol>ニューロンユニットの3 Juxtacellularモニタリング<ol><li>炭酸ガスレーザーマイクロピペットプラー上の石英キャピラリーチューブを引っ張る1μm未満（ 図5A）の先端径を有する（ 機器の項を参照）。 注：加熱パラメータは、特定の機器に応じて変化する、必要なネック径は、関心のある脳構造に依存して変化すること。ラットの視床における記録のために、マイクロピペットは5〜7ミリメートルまでの首を持っている。 </li><li>長作動距離の目標を装備した微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡下で所定の位置にピペットを固定します。顕微鏡のステージ上で所定の位置にピペットを保持するためのモデリング粘土を使用してください。 </li><li> makのに使用されるガラス片;厚さ1cm - ゆっくりガラスブロック（0.5を移動ウルトラミクロトームナイフをると、ピペットチップで視野に）便利です。ステージマイクロマニピュレーターを用いて、そっとガラスにピペットチップに触れ、それを破る原因。ピペットチップ外径が1-3ミクロンの間になるまで、必要に応じて繰り返します （ 図5B、C）。これらのマイクロピペットは、約5〜15MΩ間のインピーダンスを有していることを確認してください。 </li><li>細胞外生理食塩水（135のNaCl、5.4のKCl、1.8のCaCl 2、1mMのMgCl 2、5mMのHEPES、NaOHでpH7.2）で8を準備し、シカゴスカイブルー（w / v）の2％を追加します。 30 G針または小さなシリンジを使用して、溶液をピペットの後端を埋める。あるいは、単一セルjuxtacellular標識のためにシカゴスカイブルーの代わりに生理食塩水に2％（w / v）のNeurobiotinまたはビオチン化デキストランアミン（BDA-3000またはBDA-10000）を追加します。 </li><li>適切な実験治具に剛性チューブの内側の布の靴下の中にラットを置きます （ <stronG&gt;図4）頭部拘束治具に動物を配置する前に、手術後72時間の最小値を.WAIT。気道の閉塞を回避するために、むしろ首よりも、上方の胸骨の周りにドローストリングを締めます。呼吸が苦しいまたは妨げていると思われる場合は、引き紐を緩めるか、後方に移動します。ラットがアラートである間は、この手順を行ってください。 </li><li>ジグの対応ピースにラットにヘッド拘束プレートを取り付けます。これを行うには、最初の場所でヘッド拘束プレートをピンしてから、4-40ネジを使用して固定します。動物が頭に過大なトルクを加えないようにするために穏やかになるまで待つようにしてください。次に、ラットに移植されたヘッド·拘束ボルトに8-32ナットを配置します。その後、ヘッドボルトのねじステンレス製の棒にねじ込みます。それが所定の位置に締め付けることができるような方法で実験的な治具（ 図4）にロッドを固定。 注：ヘッドボルトならびに頭拘束プレート分で動物を保​​護する装置の曲げimizesと記録安定性を向上させる。ほとんどの場合、記録は、動物が頭抑制され、初日に開始することができる。動物が過度にそわそわまたは発声場合は、すべての録音を開始する前に、ヘッド拘束馴化訓練の一日を提供する。この場合は、15分間の治具に動物を残して、そのケージに戻ってそれを配置します。次の日、この手順を繰り返し、プロトコルを続行。 </li><li>記録チャンバーを開き、シリコーンゲルを削除します。組織は開頭で再成長してきた場合には罰金ピンセットを用いて開頭術を清掃してください。 </li><li>電動マイクロマニピュレーターにピペットを取り付け、ヘッドステージ前置増幅器に接続します。 注：本デモンストレーションでは、ヘッドステージに小さなリレー回路は、増幅器のリード線と高いコンプライアンス（ 図6A-C）と外部電流源を切り替えるために使用される。いくつかのアンプが内蔵され、適切な高コンプライアンス源を持っていることに注意してください（ ディスカッション · 材料のセクションを参照してください）。 </li><li>記録チャンバー内定位的に識別マークにピペットの先端を移動するための電動マイクロマニピュレーターを使用してください。この場所の座標を注意してください。頭蓋にピペットの先端を壊さないように注意してください。 </li><li>後部-前方および内外方向の軸で所望の記録位置にピペットを移動します。それが意図された記録場所に約500μmの背側になるまで続いて硬膜を通して腹側にピペットを進める。 </li><li>ピペットチップと基準線との間で記録された増幅された電圧のオーディオモニター上のイベントをスパイクするために聞きながらゆっくりピペットを進める。一度スパイクイベントが識別され、約500μVが観察されているよりも大きな正方向の電圧偏位までピペット0-100ミクロンを移動し続ける。 注記：電極抵抗は、約1.5〜10のwh倍に増加するこれが発生したEN。 </li><li>ユニットは、関心のあるすべての他の行動や生理的な対策とともに、3.11ステップに従ってとして単離されたら録音を開始。現在のデモンストレーションでは、自己生成された感覚毛の動きは（ 材料の項を参照）、高速ビデオ撮影で監視されている。 </li><li>記録サイトにラベルを付けるには、電極は、電流源に接続するためにつながる切り替える。手動で、内蔵アンプの電流源、または（ 図6D、ステップ3.8および考察を参照） -いくつかのリレー回路（C図6A）のいずれかを使用してこれを行う方法がある。通過-4μAを2秒パルスで4分間、50％のデューティサイクルでイオン泳動ピペットを通してシカゴスカイブルーを注入する。 </li><li>標準的な慣行に従って、いくつかの標識方法の後に動物を殺し、灌流。第記録SITの解剖学的位置を特定するために、必要に応じて脳と対比E。 14あたりとしてシトクロム酸化酵素反応のための組織を対比。代替的に、蛍光顕微鏡を用いてシカゴスカイブルー沈着を識別する。 注：正確には、すべてのラベルはラベル間のピペットをアンクランプすることなく、同じ日に同じピペットを用いて作られていることが重要である異なるラベルのユニットを区別するために。この場合、記録部位は（ステップ3.9参照）、各サイトの注目マニピュレータ座標とともに事後​​組織学におけるそれらの相対的な位置によって区別す​​ることができる。明確な同定のために、互いに離れて少なくとも200ミクロン、及び脳領域あたりせいぜい3-5のラベルをラベルをマークします。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

実験的な治具の構築 それは、様々な方法で構築することができるように、実験治具（ 図4）を構築するために使用される機械部品の説明は、プロトコルから省略されている。このデモでは、標準的な光学機械部品とサポートクランプは（ 材料の項を参照）ヘッドレストバーと身体拘束チューブを取り付けるために使用されている。類似の光学機械部品、電動マニピュレーターに電極ホルダを取り付けるために使用することができる。これは、冶具上のヘッドレストバーは、手術中に頭部拘束板を移植するために使用されるバーと同じピッチ角度で取り付けられていることが重要である。電極は、標準的な定位軸に沿って移動させる場合（、その後電極のx軸は、頭部拘束バーに平行に移動する必要があり、地面にラムダとブレグマと平行を含む平面に垂直なz軸<strong&gt;図4）。 適切なアンプと電流源の種類 <p class="...

積極的に行動のタスクに従事し、アラート、動物における神経活動の監視は、神経系の機能と組織を理解するために重要です。シングルニューロンユニットからの電気的活動の細胞外記録は、長いシステム神経科学の定番ツールとなって、現在で使用されて広くまだいる。電極の種類とさまざまな構成は、特定の実験の科学的·技術的な要求に応じて利用可能です。慢性移植マイクロドライブまたは電極アレイは、多くの場合、鳥類、げっ歯類、非ヒト霊長類を含む1-4、自由に動物を移動させる際に使用される。また、外部のマイクロマニピュレーターを経由して金属やガラス微小電極を伴う急性の貫通部は、多くの場合、麻酔をかけたり頭拘束動物から記録するために使用されます。ガラスマイクロピペット電極は、それらが明確に隔離するjuxtacellularまたは「細胞添付」構成で使用することができるという利点を有する5ソート事後スパイクの合併症のない単一ニューロンの活動。これらは、色素または神経解剖学的トレーサーの小さな堆積物を注入するために、または個々のセルを記録充填するために使用することができるようにこれらの電極はさらに、解剖学的に同定された細胞または場所から記録を可能にする。この構成は、正常に、ラット、マウス、鳥類6-10に適用されている。現在記載の技術は、juxtacellular監視や警告における細胞外の色素沈着、頭部拘束ラットに焦点を当てています。埋めjuxtacellular単一のセルとは異なり、これらの色素の沈着は細胞形態または軸索突起11についての情報を提供していないが、彼 ​​らは約50μmの正確な解剖学的局在を有効にし、批判的に、アラートの動物では有意に高い収量を持っていることに注意してください。それにもかかわらず、解剖学的標識のための代替戦略として提供されて埋めjuxtacellular単一セルに関する情報。 要するに、プロトコルは3主要な段階で構成されています。第一段階では、ラットを6日間にわたって布靴下（ 図1）身体拘束に順応される。第2段階では、ヘッドレスト装置（ 図2）および記録チャンバーは、外科的に、ラットは、複数の次の記録セッション（ 図3）の間に定位面内に維持することができるように注入される。この手順は、標準的な参照が12を座標に基づいて、電気生理学的研究のために、脳の特定のサブ皮質領域を標的とするように実験者が可能になります。第三相は、確実に1つのユニット6-9を分離juxtacellularニューロンの記録を、（ 図5）石英キャピラリー管から電極を構成し、行動および電気生理学的実験（ 図4）を行って製造するための適切な治具にラットを配置することを含む、および解剖locatiマーキングシカゴスカイブルー色素（ 図6および7）と記録部位の上。録音は、同時行動の監視を行っている。しかし、行動の技術的な詳細は、各実験の科学的な目標に依存し、単一のプロトコルの範囲を超えてこのようにある。複数の日に繰り返すことができる実験手順の完了後、動物を安楽死させる。脳は、明視野または蛍光顕微鏡のいずれかを使用して、標準的な神経解剖技術に従って抽出され、処理される。

<table><tbody><tr><td>Ketaset(ケタミンHCl)</td><td>Fort Dodge</td><td>N / Anased</td><td></td></tr><tr><td>(キシラジン溶液)</td><td>ロイド研究所</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>ベータダイン(ポビドン-ヨウ素)</td><td>CVS薬局</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>Grainger Industrial Supply</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cpシアノアクリレート</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>グリップセメント粉末</td><td>デンツプライ</td><td>Intl 675571</td><td>記録室の基部用</td></tr><tr><td>グリップセメント液</td><td>デンツプライ</td><td>675572</td><td>録音室の基部用</td></tr><tr><td>シリコーンゲル</td><td>ダウ コーニング</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>ジェット 義歯修理アクリル粉末</td><td>ラングデンタルマニュファクチャリング</td><td>N/A</td><td>頭部拘束装置を頭蓋に固定するため</td></tr><tr><td>オルソジェット 歯列矯正アクリル樹脂液</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>頭部拘束装置を頭蓋骨に固定するため</td></tr><tr><td>シカゴ・スカイブルー</td><td>シグマ</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>158127</td><td>灌流・組織固定用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマ</td><td>P3813</td><td>灌流・組織固定用</td></tr><tr><td>シトクロムC</td><td>シグマ</td><td>C2506</td><td>シトクロムオキシダーゼ染色用、<ストロング>図7</td></tr><tr><td>ジアミノベンジジン</td><td>シグマ</td><td>D5905</td><td>シトクロムオキシダーゼ染色用、Figure 7</td></tr><tr><td>ラットソックス</td>縫<td>うエレガント(カリフォルニア州サンディエゴ)</td><td>N / A</td><td>カスタムメイド、図1、4</td></tr><tr><td>PVCチューブ2&frac12;"</td><td>U.S.プラスチック社</td><td>34108</td><td>Figure 4</strong</td></tr><tr><td>>Subminiature D pins & sockets</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Stainless steel music wire 0.010" diameter Precision</td><td>Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>固定装置</td>用固定装置フレーム <td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Stereotaxic イヤーバー</td><td>Kopf</td><td>Instruments Model 957</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Stereotaxic Manipulator</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 960</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>&frac12;mmドリルバリ</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>静か空気歯科ドリル</td><td>中西部歯科</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼 0-80 &frac18;&rdquo;ねじ</td><td>ファスナー スーパーストア</td><td>247438</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>0.2 ml 遠心分離管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Custom ヘッドホールディングバー</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>カスタムメイド、Figure 2 - 4</td></tr><tr><td>Custom Headholding plate</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>カスタムメイド、Figures 2 - 4</td></tr><tr><td>ライトアングルポストクランプ</td><td>Newport</td><td>MCA-1</td><td>Figure 3, 4; 実験治具の標準オプトメカニカルパーツ(Figure 4)もNewport Corp.製です。</td></tr><tr><td>8-32 &frac34;&rdquo;ネジ</td>ファスナー<td>スーパーストア</td><td>240181</td><td>ヘッド拘束用、図3</td></tr><tr><td>4-40&frac14;&rdquo;ネジ</td><td>ファスナー スーパーストア</td><td>239958</td><td>頭部拘束用、<強>図3、4</強力></td></tr><tr><td>石英キャピラリーチューブ</td><td>サッターインスツルメン</td>ツ <td>QF-100-60-10</td><td><ストロング>フィギュア5</ストロング</td></tr><tr><td>>二酸化炭素レーザープーラー</td><td>サッター計器</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>電動マイクロマニピュレーター</td><td>サッター計器</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>微小電極増幅器</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td>代替部品:Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Microelectrode amplifier head stage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>代替部品:HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>分離パルス刺激装置</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2100</td><td>代替部品:HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>オーディオモニター</td><td>ラジオシャック</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>ピペットホルダー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td> <td>#MEW-F10T</td><td>代替部品:Discussion、図6A</td></tr><tr><td>電極リード線</td><td>クーナー</td><td>ワイヤーNEF34-1646</td><td>(オプション)、Figure 6D</td></tr><tr><td>リレーアンプヘッドステージ</td><td>COTOテクノロジー</td><td>#2342-05-000</td><td>を参照してください(オプション)カスタムメイドのプリント回路基板(UCSD Physics Electronics Shop)と併用)、Figure 6A-C</td></tr><tr><td>デジタルビデオカメラ</td><td>Basler</td><td>A602fm</td><td>(オプション) 行動モニタリング用、Figure 7</td></tr><tr><td>Puralube vet ointment</td><td>Amazon.com, Inc</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

アラート、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのjuxtacellular監視とローカリゼーション

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

単一のニューロンユニットの細胞外活動を監視するためのさまざまな技術があります。しかし、行動する動物の脳深部構造からこの活動を監視することは、特に構造を定位的に標的にする必要がある場合、依然として技術的な課題です。このプロトコルは、動物の頭部を定位固定面に維持し、単一ニューロンのスパイク活動を明確に分離する便利な外科的および電気生理学的技術を説明しています。このプロトコルは、警戒げっ歯類のヘッドレスト、マイクロピペット電極による傍細胞モニタリング、およびイオントフォレティック色素注入を組み合わせて、ポストホック組織学におけるニューロンの位置を特定します。これらの技術はそれぞれそれ自体で十分に確立されていますが、このプロトコルでは、1つの実験でそれらを組み合わせて使用する方法の詳細に焦点を当てています。これらの神経生理学的および神経解剖学的手法は、行動モニタリングと組み合わされています。本例では、組み合わせた技術を用いて、体性感覚視床内のニューロンの活動において、自己生成した振動運動がどのようにコードされているかを決定する。より一般的には、ラット、マウス、およびその他の動物のさまざまな行動課題と関連してニューロン活動を監視するために、このプロトコルを適応させることは簡単です。重要なことに、これらの方法の組み合わせにより、実験者は解剖学的に同定された神経生理学的シグナルを行動に直接関連付けることができます。

<html>エンコード視床腹側後部内側（VPM）におけるニューロンユニット自己生成15,16を泡立てる時の感覚毛運動の段階。ラットが積極的に泡立てるされる。 図7Bは、スパイクのヒストグラムを示す。図7（a）は、VPM視床単位のサンプルスパイク活性を示す感覚毛の運動17の瞬時位相に合わせ回。泡立ての収縮期の間、よりスパイクがある。 図7Cに示すように記録した後、ユニットの位置は、シカゴスカイブルー染料のイオントフォレーシスを介して標識した。組織は、VPMの視床の神経解剖学的境界を明らかにするために、シトクロム酸化酵素活性のために対比される。このプロトコルに類似した内容が、最近、特定の脳幹核18で泡立てる関連のマルチユニット神経活動（10〜20μmの直径のピペットチップ）を監視するために適用した。 <html> 1再 &quot;SRC =&q...

このプロトコルは、警戒心の強いラットの皮質下脳構造のニューロン活動を監視するための頭部拘束機構の設計と外科的移植を説明しています。 これは、傍細胞構成の単一ニューロンを分離し、それらの解剖学的位置を効率的に特定する手順を説明しています。

アラート、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular監視とローカリゼーション

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

本手順の目的は、覚醒状態で頭部を固定したラットの皮質下脳構造内における単一ニューロンの活動をモニタリングし、局在化することである。まず、布製ソックスを用いてラットを身体拘束に慣らす。次に、頭部固定装置と記録チャンバーを外科的に植え込み、その後の複数回の記録セッションにおいてラットを定位面で維持できるようにする。次に、行動実験および電気生理学的実験を行うための適切なジグにラットを固定し、細胞近接記録（juxtacellular recording）を行います。このプロセスにより、単一ユニットの明確な分離が可能になります。最後のステップとして、シカゴスカイブルー染料を用いて記録部位の解剖学的位置を標識し、事後の組織学的な可視化ができるようにします。金属マイクロ電極を用いた細胞外記録などの一般的に用いられる手法に対する本手法の主な利点は、単一ユニットからのスパイクを一意に分離できること、および記録部位を事後の組織学的解析によって特定できることです。この手順を開始するには、ケタミン・キシラジン注入により動物を麻酔します。足指の逃避反射を確認して麻酔深度を判定し、麻酔薬を追加投与して麻酔状態を維持します。必要に応じて、頭部の除毛を行い、ポビドンヨードで手術部位を消毒します。その後、ラットを脳定位固定装置の保持フレームにセットし、イヤーバーで頭部を固定します。メスを用いて、両眼の中点から耳の後方にかけて、頭蓋骨の正中線に沿って切開します。次に、切開線の両側で2〜3mm幅の皮膚を切り除きます。骨膜を掻き出し、外側隆起まで頭蓋骨を露出させます。その後、露出した頭蓋骨を瞬間接着剤の薄い層で覆います。次に、bgma縫合線が外側隆起と接する部位の直後方に、頭蓋骨に対して30〜45度の角度で小さな穴をドリルで開けます。その後、0-80の平底マシンネジを30〜45度の角度で穴にねじ込みます。この際、下層の脳組織を損傷しないよう、深くねじ込みすぎないように注意してください。この構成でさらに6本のネジに対して同じ手順を繰り返します。その後、すべてのネジの根元に瞬間接着剤を塗布します。次に、シリンジ針をステレオタキシス操作器に装着します。針で頭蓋骨に小さなくぼみを作り、適切な基準位置をマークします。次に、そのくぼみを油性マーカーで印付けします。その後、目的の座標を中心として開頭術を行い、硬膜はそのまま保持します。開頭部位を修正人工脳脊髄液で覆います。次に、0.2 mL用遠心チューブを4〜5 mmの長さに切り、キャップ部分を切り捨てます。このチューブを頭蓋骨上に配置し、開頭部位の中央に合わせます。次に、チューブの底辺に歯科用セメントを塗布し、チューブの基部を頭蓋骨に密封します。この際、露出した開頭部にセメントが漏れ込まないように注意してください。続いて、反対側の頭蓋板に別の小さな穴をあけます。ピンコネクタに半田付けした参照電極線を慎重に挿入します。その後、ピンと電線を固定するため、電線を挿入した穴に瞬間接着剤を塗布します。次に、シリコーンゲルキットの2つの成分を等量ずつ混合します。2分間待機し、遠心チューブにゲルを満たします。チューブの約3分の1まで満たされた時点で、ヘッドプレートをヘッド拘束バーに取り付けます。ここでは、バーを直角ポストクランプに45度のピッチ角で取り付けています。続いて、ポストクランプを使用してホールディングバーをステレオタキシス・マニピュレーターアームに取り付け、バーがイヤーバーと平行になるようにします。バーとプレートを下げ、プレートがラムダ縫合の後方かつコドルモススクリューの前方に位置するように調整します。次に、クランプを用いてフロントヘッドボルトを約45度の角度で掴み、スクリューの頭部が下向きかつ動物の尾側を向くようにします。その後、スクリューを下げて頭蓋骨に接触させます。次に、歯科用アクリル樹脂を用いてボルトとプレートを固定します。歯科用アクリル樹脂の周囲にデンタルセメントを塗布し、皮膚をインプラントに接着させます。セメントが乾燥した後、遠心チューブのキャップに数箇所穴を開け、チューブにキャップを装着します。次にクランプを取り外します。ステレオタキシス装置から頭部固定バーを慎重に取り外してください。その後、バーからヘッドプレートを取り外します。最後に、動物をステレオタキシス装置から取り出し、術後のケアとモニタリングを行います。この手順では、二酸化炭素レーザーマイクロピペットポラーに石英キャピラリーチューブを備えたポロピペットを使用します。その後、長作動距離対物レンズを備えた微分干渉コントラスト顕微鏡の下で、ピペットを所定の位置に固定します。ピペットチップを用いて、ガラスブロックをゆっくりと視野内に移動させます。ステージマイクロマニピュレーターを使い、ピペットチップをガラスにそっと接触させて先端を折ります。ピペットチップの先端が適切になるまで、この操作を繰り返します。外径は1〜3 µmの間です。次に、細胞外生理食塩水を調製し、2% Chicago sky blueを添加します。30ゲージの針を装着したシリンジを用いて、ピペットの後端に溶液を満たします。次に、ラットを布製ソックスに入れ、その布製ソックスを適切な実験用治具上の硬質チューブに移動させます。ラットに取り付けられた頭部固定プレートを、治具上の対応するパーツに固定します。続いて、ラットに植え込まれている頭部固定ボルトに 8 32 ナットを取り付けます。続いて、ヘッドボルトにネジ付きステンレス棒をねじ込みます。その後、記録チャンバーを開き、シリコンゲルを除去します。微細ピンセットを使用して、開頭部位を清掃します。開頭部位に組織が再生している場合は、必要に応じて本工程中にイソフルラン麻酔を使用してください。次に、ピペットを電動マイクロマニピュレーターに取り付けます。ピペットを前後軸および内外側軸に沿って、目的の記録位置まで移動させます。次に、ピペットを硬膜を通して腹側に進め、目的の記録部位から背側に約500 µmの位置まで移動させます。増幅された記録電圧をオーディオモニターで聴取しながら、ゆっくりとピペットを進めます。スパイクイベントが確認されたら、正の電圧偏向が約500 µVを超えるまで、ピペットをさらに0～100 µm程度移動させます。記録部位を標識するには、電流源を-4 µAに設定し、デューティサイクル50%で2秒のパルスを与え、アイオノフォアに4分間電流を流した後、ピペットからシカゴスカイブルーを注入します。実験後、標準的な手順に従って動物に灌流を行います。その後、脳を切片化し、必要に応じて対比染色を行い、示された記録部位の解剖学的位置を特定します。ラットが能動的にウィスキングを行っている際の、VPM視床ユニットのサンプルスパイク活動を以下に示します。ここでは、Vibra運動の瞬時位相に合わせたスパイク時間のヒストグラムを示しています。ウィスキングの後退相において、より多くのスパイクが観察されます。記録後、本ユニットの位置をシカゴスカイブルー染料の電気泳動によって標識しました。ここに示すように、組織をシトクロムオキシダーゼ活性で対比染色し、視床後内側腹側核（VPM）の神経解剖学的境界を明らかにしています。このビデオを視聴することで、動物の頭部を定位面に保持し、単一ニューロンのスパイク活動を明確に分離するための手術および電気生理学的手法について、十分に理解できたはずです。

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

自由に動物を移動させるの異なる脳領域における細胞外神経伝達物質レベルのモニタリングは、神経伝達物質の放出と行動の間のリンク上の洞察を提供しています。および基底神経伝達を薬理学的または生理学的操作によって変更される方法については、電気化学検出と相まって生体微量透析に優れた解剖学的および化学的分解能を提供します。...

げっ歯類で存続可能な定位手術

麻酔ラットのシリコンプローブを用いた神経活動の細胞外記録について説明する。この技術は、同時に100以上のニューロンからの複数の脳領域間で情報を得ることができる。それは、複数の局所回路における神経細胞のアンサンブルのダイナミクスについての単一細胞の解像度で情報を提供します。...

麻酔ラットのシリコンプローブで大規模なニューロンアンサンブルの録音

このビデオは、麻酔をかけたラットを複数の部位からの脳活動の電気生理学的記録のために準備するための詳細な手順を示しています。頭皮を解剖して頭蓋骨にアクセスし、電極を取り付けて固定するために正確な位置に穴を開けます。次に、タングステンマイクロワイヤ電極を目標位置に挿入してデータを記録します。...

ラットの複数の部位からの脳活動のin vivo電気生理学的記録

出典: Maruoka, H., et.al. 覚醒マウスにおけるミクログリアダイナミクスとニューロン活動の同時イメージング J. Vis. Exp.

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

出典:Moore, J. D., et al. 警戒心、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons.J. Vis.

覚醒ラットの神経活動の精密マッピングのための傍細胞記録と染色

出典: Lai, J., et al. げっ歯類脳における電気生理学的記録と抑制剤のマイクロインジェクションの同時投与J. Vis.

ラットにおける神経活動の阻害とその電気生理学を用いた検出

神経回路網の構造を理解するために、個々のニューロンの機能的および形態学的特徴付けが必要である。ここで、我々はまだ、細胞内で樹状および軸索建築の事後再構築のために、ニューロンを標識する能力を維持し、細胞外の構成で電気生理学的記録を可能にするjuxtasomalビオシチンラベルを示しています。...

Juxtasomalビオシチン標識は、個々の皮質ニューロンの構造機能相関を研究するために、

この方法では、マウスは顕微鏡イメージングや動物の頭をしっかり固定を必要とする単一セルの電気生理学的記録、中に移動し、探索するための具体的な、使い慣れた環境を作成します。...

フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法

この研究では、方法論は、ウレタン麻酔下での超指向経路からのマルチサイトインビボ電気生理学的記録をどのように行うかについて提示されている。...

急性<em&gt;インビボ</em&gt;麻酔ラットにおけるHyperdirect経路からの局所場ポテンシャルとマルチユニット活性の電気生理学的記録

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。...

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

新皮質の主要な感覚野は、発達中に独特の自発的な活動を示します。この記事では、 in...

新生児マウス感覚皮質における自発的活動の単一ニューロン分解能でのin vivo可視化

学ぶ頭部拘束ラットの皮質下脳構造における単一ニューロンのジャクスタセルラー記録法。布製ソックスによる体拘束と手術的ヘッドプレート埋め込みにより、覚醒状態での神経活動モニタリングと解剖学的局在特定を可能にする。

アラート、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular監視とローカリゼーション

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