Name: 細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 46 s
Description: 学ぶ単細胞応答の複雑な異方性二軸機械変形への反応を調べる新規ストレッチングプラットフォームを用いた方法。C2C12細胞とマウス大動脈組織を用いて生体組織の機械的特性を定量化し、細胞力学と組織工学への応用を示す。

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DTは、ル·フォン·ド·ルシェルシュ·デュ·ケベックネイチャーらテクノロジーズ（FQRNT）とMITACS昇格戦略的フェローシップからのポスドク学生の身分によってサポートされていました。 CMCは、ル·フォン·ド·ルシェルシュアンサンテ·デュ·ケベック（FRSQ）とアーネストオタワ心臓研究所の大学からマーガレットフォード心臓病恵まれ研究フェローシップからのポスドク学生の身分によってサポートされていました。 EOBは、オンタリオ州の心臓と脳卒中財団から健康の研究（CIHR）およびT6335のためのカナダの協会からの補助金のMOP80204を操作することでサポートされていました。 CIHRとメドトロニックは、集合の査読研究議長（URC＃57093）でEOBを提供しています。 AEPは、自然科学と工学研究評議会（NSERC）ディスカバリーグラント、NSERC Discovery Acceleratorのサプリメントによって資金を供給し、感謝してカナダのリサーチチェア（CRC）プログラムとオンタリオ州からの早期リサーチャー賞のサポートを認めている。

単一細胞の1。機械的変形<ol><li>組み込み蛍光ビーズとPDMS基板の作製 基板の製造の前に、水溶液中の蛍光マイクロスフェアは、その疎水性の性質に起因PDMSにおけるビーズ混合を促進するためにイソプロパノール中に再懸濁する。 <ol><li>ピペット10分間16200×gで1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機への蛍光マイクロスフェアの500μL。 </li><li>上澄み液を捨て、ボルテックスの5分で、その後のイソプロパノール500μlを添加する。堆積物に任意の大きな粒子の凝集を可能にするために暗闇の中で一夜放置バイアルを置きます。 </li><li>翌朝、慎重にきれいな微量バイアルに上清を除去。このビーズ溶液を5つ以上の基板を製造するために使用することができる。注：ビーズ溶液は、次の3日間、沈降していきます。ペレットを再懸濁ないように注意してください。 </li><li>提供硬化剤0.5グラムを注ぐ1.5mlのマイクロバイアル中のPDMSキットは、科学的なバランスを使用した。連続した工程により、各添加間の1分間ボルテックス、（6 15μlの添加で）ビーズの90μlの合計を追加します。置いておきます。 </li><li> PDMS 10gを秤量し、蛍光ビーズを補充した硬化剤0.5gを、少なくとも12分間混合する。 </li><li>製造者の指示に従って標準的なフォトリソグラフィ技術を用いてSU-8 2050断面形状の金型を製作する。使用した金型は、320μmで13.4 cm 2で（ 図3）の領域の高さを有している。金型は428μLまたはPDMSの440ミリグラムを含むことができます。 </li><li> 80℃で2時間、トランスファーピペットおよび硬化を用いたクロス形状の金型内にビーズをPDMS 400mgの流動硬化後、金型（ 図5A）から基板をはがし。基板は、その機械的特性の有意な変化を示すことなく2週間室温でペトリ皿に維持することができる。 </李&gt; <li>直径約4mmの最終的な大きさのペトリ皿に80℃（ 図5B）で2時間逆さにそれらを治す：PDMSの滴（1:20の比率で、PDMS硬化剤）を注ぐ。これらの機能は、アンカー週間ペトリ皿に保つことができる。注：硬化プロセス中に平坦化から落下しないように逆さまにお皿を維持します。 </li><li>エアープラズマトリート（30 Wで30秒）基板および8アンカー機能。基板（ 図5C）上に存在する正方形のくぼみから4ミリメートルの距離で基板の両端に機能的に結合する。 </li></ol></li><li>クランプ上に膜を取り付け<ol><li>クランプの溝付き円筒部の周囲の基板のそれぞれの端部を包み、上から2止めネジ（ 図2B及び図5D-E）で固定します。 </li><li>クランプホルダーに4クランプをねじ込み、使い捨てのTを使用して、PDMS（比率1:20）注ぐ基板とクランプの溝付き円筒部との界面での順伝達ピペット。 1.5mmの六角レンチを使用して、溝付き円筒部の周囲に、未硬化のPDMSを広げた。 </li><li>完全に毛細管現象によって充填され、2時間後（ 図5F）、80℃でアセンブリを治すまで溝に、PDMS（1:20）注ぐ。 </li></ol></li><li>膜上で細胞を播種<ol><li>エアープラズマトリート（30 Wで30秒）コラーゲンコーティングを可能にするために基板を殺菌し、機能化、アセンブリ全体。 </li><li>細胞を、1時間室温でラット尾部コラーゲンの16μg/ mlのを補充した0.02 M酢酸1mlで播種される基板の面積を官能。所望の最終コラーゲン濃度は、5μgの/ cm 2である。 </li><li>リン酸緩衝液で基板3回すすぎ、それは、室温で乾燥を少なくとも10分間のためにしてみましょう。 </li><li> 10％ウシ胎児干せるを添加した培養培地を40μl加えmおよび1cm 2の （セル密度：20細胞/ mm 2）の面積を覆うように基板の中心部に2,000細胞を含有する1％ペニシリン-ストレプトマイシン。細胞密度は、実験の要件に応じて変更することができる。 </li><li>基板は、その上に細胞を含む培養液滴の上にして、標準的な細胞培養インキュベーター内で、アセンブリ全体を置きます。注：アセンブリは、細胞がしっかりとそれを添付することを可能にするために、少なくとも3時間、上に向けて基板を保持する必要があります。蒸発を防ぐために、暖かい培養培地の30μlを、基板上の液滴で3時間毎に45分間に添加する。 </li><li> 3時間後、基板を浸して、細胞が増殖することを可能にするために一晩インキュベートし、新鮮な培養培地で満たされたペトリ皿に、アセンブリ全体を反転させる。 </li><li>次の日、HEPES緩衝塩溶液（HBSSを準備し、ヘペス、NaClを120 mMの塩化カリウムの5.3mmで、 硫酸マグネシウムの0.8 mMのCaCl 2を 1.8 mmであり、デの11.1 mMと20 mMのxtrose）。 pHを7.4に調整する。 NOTE：HBSS溶液を毎日調製し、実験の間37℃に維持されなければならない。この生理学的溶液を、正常組織/血液の環境を模倣することによって、顕微鏡ステージ上の細胞を維持するために使用される。 </li><li>倒立位相差または蛍光顕微鏡マウントBAXSプラットフォームおよびモータのクランプ基板アセンブリ上のセットアップをマウントします。 HEPES緩衝液（ 図2D）でシャーレヒーター内部のペトリ皿を埋める。 </li></ol></li></ol>小口径血管の2。剛性測定<ol><li>準備<ol><li>クレブス生理的溶液：118.1のNaCl、11.1 mMのD-グルコース、25 mMの炭酸水素ナトリウム、4.7のKCl、1.2のMgSO 4、1.2mMのKH 2 PO 4、および2.5mMのCaCl 2の溶液を調製する。 pHを7.4に調整し、30分間カーボゲン医療ガス（95％O 2/5％CO 2）で溶液に酸素。注：クレブスsolutiには、実験中毎日調製し、37℃に維持されなければならない。この生理学的溶液を、正常組織/血液の環境を模倣することによって生きている組織を維持するために使用される。 </li><li>外科はさみ、曲がったピンセット、マイクロはさみ、外科解剖顕微鏡、50ミリリットルのポリプロピレン遠心管、および10ミリリットル血清学的ピペット：解剖と大動脈血管の機械的な評価のための計測機器を収集します。外科的および実験手順は、任意の無菌状態を必要としません。あらかじめロードセルとともにBAXSプラットフォームのクランプを取り付けます。 </li></ol></li><li>組織分離と解剖 実験動物に関連するすべての実験手順は国の利用者の実験動物の管理と使用に関する健康ガイドに準拠機関、「利用者の動物実験委員会によって承認されなければならない。 <ol><li> 99パーセントのCO 2の吸入（7 PSI）で、マウスの安楽死を実行するプレキシグラス室（ 図6A）内。 </li><li>開いたマウスの腹部とマウスを出血する胸部大動脈を切った。 </li><li>横隔膜、胸郭および肺葉（ 図6B）を取り外します。注：組織を損傷する危険性を最小限に大動脈に装着心を保ち、直接容器に触れないように、心臓を使って操作します。 </li><li>そっと容器と背骨の間切断することにより、心臓、大動脈根および胸部大動脈を削除します。注：完全な組織（ 図6C）の内部構造を維持するために、切除の際に容器内のいずれかの伸長を誘導しないでください。 </li><li>すぐに浸すとクレブス液中の心臓と大動脈を保つ。 </li><li>カットして慎重に血の塊を取り除くためにクレブス液中に大動脈を洗う。マイクロハサミ、ピンセット、外科解剖顕微鏡（ 図6D-E）を使用して結合組織を除去します。注：すべての血管長を保持し、AORを使用容器の向きを決定するために、TICルート。 </li></ol></li><li>血管寸法判別の取付け 容器の剛性を決定するために、アンロードされ、容器の寸法は必要とされ、較正された顕微鏡を用いて決定することができる。 <ol><li>長さ約2mmの大動脈輪を切断して、正確に（ 図6F-G）を設定するキャリブレーション顕微鏡を用いて、長さを測定します。クレブス液中にわきこのセグメントを置く。 </li><li> 2ミリメートルのセグメント（ 図6F）の各々の間の可能な限り小さく、他の大動脈のリングをカット。ルーメンを上にして顕微鏡スライドガラス上にこの小さなセグメントを入れて、校正された顕微鏡の設定（ 図6H）を使用して、壁の厚さを測定します。 </li><li>クレブス溶液でBAXSプラットフォーム上でペトリ皿を記入します（ 図4（c）に挿入図）引っ張ってピンの2ミリメートルの大動脈リングセグメントを挿入します。 </li></ol></li></ol> GE = &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> 図5。PDMS基板の製造および硬化の後、A）を搭載 、基板を慎重に、SU-8 2050金型から剥離し、シャーレに脇に置くされています。） は、PDMSで作られた機能を係留し、基板を固定するのに役立つクランプ4に搭載された基板の基板は、次いで、クランプホルダに取り付けられているクランプ4、（挿入図を参照）に取り付けられている。D）を取り付けるための準備機能を有する固定クランプ。C）基質。E）詳しい画像。F基板の下の溝に、PDMSを注ぐの）手順。矢印は、ゆっくりと、毛細管現象により溝を埋めるPDMSを示しています。 454fig6highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; 図6。準備および胸部大動脈の単離A）の縦方向の腹部切開を通して手術器具や安楽死マウス。B）を製造、胸郭および肺のLOBが削除されます。C）大動脈を慎重に操作するために心を用いて除去される組織。D）に心臓と大動脈をクレブス生理的溶液に入れられる。大動脈は、すべての結合組織を除去して洗浄される。E）心臓および大動脈を示す詳細な絵。F厚さ測定に使用される小さなセグメントに沿って剛性評価のために使用される）大動脈セグメント。GH）正確な長さ（G）及び厚さ（H）各血管セグメントは、逆顕微鏡および分析プログラムを用いて評価される。

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで紹介するBAXSプラットフォームは、組織全体に対する単一の細胞の調査から、メカノの研究に多くの実験を容易にします。また、プラットフォームは、多数の機械的刺激実験や多軸引張試験を可能にし、非常に柔軟で設定可能です。プラットフォームはまた、生理学的条件下で細胞および組織の維持を可能にし、延伸実験の間、同時顕微鏡検査を可能にする。取り付けクランプの適切なセットを使用するときに、前のセクションで説明2の実験はBAXSプラットフォームの汎用性を示しています。モジュラーとカスタマイズ可能なサンプルマウントシステム、光アクセスおよび追加のセンサ（例えば、ロードセル）を追加する可能性が、実行されるべき実験の追加のタイプのための多数の可能性を開く。 上記のプロトコルが実行されなければならない多くの重要な手順が含まれていますdequately最良の結果を生成するために。プロトコルを伸ばし、細胞内では、クランプに上のPDMS基板をマウントする繊細で正確な操作が要求されます。 PDMS基板はよく延伸時の基板の不要な横方向の動きを回避するために、...

機械的な微小環境は、組織の発生及び恒常性にし、また疾患1-6に大きな影響を与えるような、増殖、遊走、および分化のような多くの細胞機能において重要な役割を果たしている。長年にわたって、多数の実験的なツールは、機械的に細胞または組織を刺激し、基本的なメカノの我々の理解を高め、疾患6-17の発症および進行を研究することを目的として生体組織の機械的特性を測定するために使用されてきた。しかし、一つは、多くの場合、特定の研究の目標を達成するために、いくつかの異なる実験のデバイスに依存しなければならない。この記事では、機械的特性や機械的な力を全組織長さスケールに細胞内で生物学に果たす役割を調べる研究を可能にし、単一の、多機能、二軸延伸（BAXS）プラットフォームを提供します。 BAXSプラットフォームはquantificatioのためにできるだけでなく単離された組織の機械的特性のn個ではなく、単純に適用する能力を容易にし、複雑で、動的歪み場すなわちインビボで起こる延伸への応答を理解するために、生きた細胞である。 BAXSプラットフォームは、細胞や組織に機械的試験と摂動中に生細胞顕微鏡を実行する能力を維持している。 BAXSプラットフォームは、細胞レベルでの基板変形の影響を調査し、生物学的組織（ 図1A）上に引張試験を行うために使用することができる特注の装置である。アルミニウムヒーターは、標準的な10cmのペトリ皿を収容し、温度制御器およびカプトンヒーター（ 図1B）を用いて、37℃で、任意の生理学的溶液を維持するように作製した。このBAXSプラットフォームは、倒立位相差顕微鏡および/ ​​または蛍光顕微鏡上に集積し、同時イメージング（ 図1C）を可能にすることができる。要するに、BAXSプラットフォームは、可動部品が直交する二軸（ 図1D）に沿って配向されたスライド軸受ミニチュア直動ボールに搭載された4本の直線状のボイスコイルモータで構成されている。線形位置決めステージ（ 図1E）に使用されるクランプシステムの垂直移動を可能にするために4つのモータのそれぞれに取り付けられている。各モータの位置は、500nmの分解能（ 図1F）を有する光学式エンコーダによって監視される。すべての4つのモータは、独立して動作コマンド（ 図1G）を実行するための光学エンコーダフィードバックを用いたモーションコントローラで制御される。 LabVIEWのインターフェースは、細胞または組織試料の、完全にカスタマイズ可能な静的および動的変形を生成するために、変位量、速度、及び各モータの加速度を完全に制御できる。 細胞における変形を誘導するために使用される技術は、単にallowinにより達成されるG細胞は、しっかりと柔軟で透明基材に付着した後、BAXSプラットフォームの4つのモータを使用して、この基板を延伸。 BAXSプラットフォームは、ボイスコイルモータ基板を取り付けるクランプのいずれかのカスタム設計されたセットの装着を可能にする。この目的のために、我々は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）からなる可撓性透明基板は、（ 図2A-C及び図3）を結合させることができるクランプのセットを設計した。クランプは生理学的溶液に暴露されるように、すべての部品は、滅菌を可能にするために、ステンレス鋼から機械加工した。これらのクランプは慎重に（ 図2D）が延伸中に基板へのストレスを最小限に抑えつつ、画像品質を向上させるために顕微鏡対物レンズにできるだけ近接して基材をもたらすように設計されている。 同じBAXSプラットフォームは、ADAPとクランプの適切なセットを用いて、小さな組織試料の剛性を定量化するために使用することができるテッドは軍を監視するための組織サンプルとロードセルのためサポートしています。いくつかのアプローチがBAXSプラットフォームモータに組織をマウントするために撮影することができます。この場合には、ステンレス鋼昆虫minutiensピンは、引張試験（ 図4A-B）を実行するために、血管組織の開口部を通してフックできる。代替的に、自然の開口部のない厚さの組織について、組織の縁部は、いずれかのボイスコイルモータに取り付けられた、または生物学的接着剤の小さなガラススライドに接着し、クランプでモータに取り付けられたクランプを所定の位置に保持することができる。引張りを行うために、小型ロードセルが必要とされるテストし、容易にBAXSプラットフォームモータに組み込ま延伸サイクル（ 図4C）の間に組織に作用する力を測定するために使用することができる。 BAXSプラットフォームは4つのモータから構成されているように、第二のロードセルの導入は、いずれか2つの直交方向に沿って引張試験を行うことができる。この能力は、1がquantifすることができますYと同じ実験中の2つの垂直な方向に沿った単一組織の機械的剛性。 重要なことに、すべての構成で、目的の細胞または組織サンプルは、常にユーザがアクセス可能な恒温槽内に維持される。この能力は、試料の時間応答を調べるために、延伸試料中の薬理学的物質の導入を可能にする。倒立顕微鏡の光軸が遮られないままであるさらに、顕微鏡のすべての形態は、まだユーザーが使用できる。 BAXSプラットフォームのすべての4つのモータが独立しているように、最終的に、関心対象の試料に高度に構成可能な歪み場を適用することが可能である。 インビボ細胞および組織が ​​暴露された複合体とは対照的に、それはこのプラットフォームでは、より適切に模倣することができる延伸異方性伝統的な一軸延伸プラットフォーム7,13,15,18,19へ。また、物理的特性歪み場の実験中にオンザフライで変更することができる。これらの能力は、ユーザが時間的に非常に複雑な、異方性の広い数、および空間的に変化する歪み場に対する細胞および組織レベルの応答を調べることを可能にする。この記事では、利点と制限BAXSプラットフォームのだけでなく、その設計、動作原理、および単一セルおよび全組織実験のための実験の詳細を説明しています。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。BAXSプラットフォームの概要。 37℃Cで細胞および組織を維持するために使用ペトリ皿加熱ヒータのA）は、4つのボイスコイルモータを示すBAXSプラットフォームの上面図である。B）詳細ピクチャ）プラットフォームは、ライブを実行するために倒立顕微鏡に装着することができるストレッチ実験中の細胞イメージング。D）ボイスコイルモータの詳細な絵;プラットホームの可動部分。E）クランプシステムの垂直方向の変位を可能にする線形位置決めステージの詳細な絵。F）モーションコントローラにモータの実時間位置を提供する光学式エンコーダの詳細な絵。G）詳細画像4つの音声コイルモータ、4つの光エンコーダ入力および電力出力を示すモーションコントローラ。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。実験を伸ばすセル用のクランプシステム。基板は、そのアンカーfeaturとクランプの円筒部に巻き付けられる。C）を延伸するためのボイスコイルモータにPDMS基板を取り付けるために使用されるクランプの詳細を示すAB）の画像ES上部の溝に座って。次いで、基板を上部溝に特徴をアンカー/基質をプッシュ止めねじを用いて固定されている。クランプが所定の位置に基板を保持するとともにBAXSプラットフォームのD）イラストレーション。挿入図は、それだけでカバースリップと顕微鏡の対物レンズの上に座っているに付着した細胞を有する基板の詳細図を示す。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> 図3膜及びそのクランプシステムの部品表。細胞延伸実験を行うために二軸プラットフォームに集積主要部の寸法を示す図面。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。例クランプシステムの小口径血管の剛性評価のためのクランプシステムの十分。AB）の詳細な写真は直径1mm、マウスの大動脈の変形を誘導するために使用。ステンレス製のピンを慎重に船が両方のピンにスライドすることができるように、オープン三角形に成形した。固定されたモータと左クランプとの間に取り付け、容器とロードセルを保持するクランプを備えたBAXSプラットフォームのC）のイラスト。挿入図は、ピンの上に取り付けられた容器の詳細な平面図を示している。

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>このプロトコルで使用されるベースとクロスリンカーの比率は20:1です。ほこりがあなたの&nbspを汚染するのを防ぐために、層流フードを混ぜます。</td></tr><tr><td>FluoSpheres 蛍光マイクロスフィア</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>光を避けてください。</td></tr><tr><td>リニアボイスコイル</td><td>Moticont</td><td>LVCM-051-051-01</td><td>モトロは2つの部分(磁石とコイル)で提供されます。機能するには、ボールベアリングシステムに取り付ける必要があります。</td></tr><tr><td>ボールベアリングスライド</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>NT37-360</td><td>ミニチュア・スモール・リニア・モーション ボールベアリング・スライド</td></tr><tr><td>リニアポジショニングステージ</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>38-960</td><td>センタードライブ 1.25インチ スクエア リニア トランスレーションステージ</td></tr><tr><td>光学式エンコーダ</td><td>GSI microEシステム</td><td>マーキュリーII 1600S-0.5um分解能</td>の<td>反射型インクリメンタルエンコーダ。</td></tr><tr><td>モーションコントローラ</td><td>ガリル</td><td>DMC-2143(DIN)-DC48 AMP-20440</td><td>4軸コントローラ付き 4軸アンプ</td></tr>付き <tr><td>ロードセル</td><td>ハネウェル社</td><td>製 31 低</td><td>ミニチュアロードセル 0-150 g</td></tr><tr><td>昆虫の微細なピン (0.20 mm)</td><td>ピン サービス Austerlitz 昆虫ピン</td><td></td><td>開いた三角形の形に曲げられたステンレス鋼ピン</td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>マイクロケム</td><td>SU-8 2050</td><td>永久エポキシネガフォトレジスト。熱や光から遠ざける</td></tr><tr><td>エアプラズマ処理システム</td><td>Glowresearch</td><td></td><td>Autoglow 酸素プラズマシステム</td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>コラーゲン I, ラットテール 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>DNA特異的蛍光色素.冷蔵庫に保管してください。</td></tr><tr><td>カプトン(ポリイミドフィルム)絶縁フレキシブルヒーター</td><td>omega.ca</td><td>KHLV-0504/(10)-P</td><td>28Vフレキシブルヒーター、24V</td></tr><tr><td>1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers</td><td>omega.ca</td><td>CN63200-R1-LV</td><td>温度コントローラー、24V供給</td></tr>可能<tr><td>DMEM培地</td><td>Hyclone</td><td>SH3024301</td><td>Dulbecco's モディファイド 30 イーグル ミディアム。4 &#176 に保ちます。C</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ハイクロン</td><td>SV30010</td><td>在庫を冷凍保存します。4&#176;Cで作業溶液を維持します。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>ハイクロン</td><td>SH3039603C</td><td>冷凍保存します。</td></tr><tr><td>トリプシン0.05%</td><td>ハイクロン</td><td>SH30236.02</td>冷凍<td>保存。継代培養のための細胞付着タンパク質の消化</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Wisent Inc</td><td>330-050-EL</td><td>HEPES緩衝塩溶液&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>HEPES緩衝塩溶液 / クレブス生理液</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>HEPES緩衝塩水 / クレブス生理液</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td>HEPES緩衝塩水 / クレブス生理液</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C614-500</td><td>HEPES緩衝塩溶液 / クレブス生理液</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP220-1</td><td>HEPES緩衝塩水 / クレブス生理液</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td>クレブス生理液</td></tr><tr><td>KH2PO4</sub</td><td>>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>クレブス生理液</td></tr><tr><td>カルボゲン95%O2/5%CO2</td><td>Lindle</td><td>DIN:02154749</td><td>クレブス生理液酸素化</td></tr><tr><td>ノコダゾール</td><td>シグマ</td><td>M1404</td>微<td>小管解重合剤</td></tr><tr><td>サイトカラシン-D</td><td>シグマ</td><td>C8273</td><td>アクチンフィラメント解重合剤</td></tr><tr><td>アンチアルファ;-SMA-FITC</td><td>Sigma</td><td>F3777</td><td>平滑筋細胞含有量の染色および定量に使用</td></tr><tr><td>ピクロシリウスレッド染色</td><td>フルーカ</td><td>43665</td><td>コラーゲン含有量の染色および定量に使用</td></tr></tbody></table>

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

細胞や組織、またはそれに機械的な力の適用は、生体組織の機械的特性を定量化することができるためのツールは、基本的なメカノの理解に劇的に貢献してきた。これらの技術は、広く様々な疾患の発症および進行を頻繁に機械的な手がかりの影響を受けているかを示すために使用されている。この記事では、機械的に、単一の細胞を刺激するか、組織の機械的剛性を定量化するか多機能二軸延伸（BAXS）プラットフォームを提供します。 BAXSプラットフォームは独立して制御することができる4つのボイスコイルモータで構成されている。単一細胞ひとつ、複雑な動的、および空間的に変化する歪み場に細胞を露出することを可能にモータに取り付けることができるフレキシブル基板上に培養することができる。逆に、力ロードセルを組み込むことによって、人はまた、それらが変形サイクルにさらさ​​れているように、一次組織の機械的特性を定量化することができる。両方の場合において、クランプの適切なセットを設計しなければならないし、しっかりとフレキシブル基板または目的の組織を保持するためにBAXSプラットフォームモータに取り付けられた。 BAXSプラットフォームは、延伸実験の間、試料の構造的または生化学的反応を調べるために同時の透過光および/または蛍光イメージングを実行するために倒立顕微鏡に装着することができる。この記事ではBAXSプラットフォームの設計と使用法の実験の詳細を提供し、単一の細胞や組織全体の研究の結果を提示します。 BAXSプラットフォームは、歪みを基板へと単離したマウス大動脈の剛性を測定するために応じて、単一のマウス筋芽細胞における核の変形を測定するために使用した。 BAXSプラットフォームは、細胞内、細胞および全組織レベルでの新たなmechanobiologicalな洞察を提供するために、様々な光学顕微鏡法と組み合わせることができる汎用性の高いツールです。

細胞体を伸ばす BAXSプラットフォームは、25％の基板変形に露出シングルマウス筋芽細胞（C2C12）における核の機械的応答を調べるために使用した。筋芽細胞は、筋肉組織に見出され、常に生体内で機械的伸張および圧縮に曝される。細胞核の形状及び機械的特性は、遺伝子発現および転写活性20,21の制御に、また、発達障害や、ハッチンソン-ギルフォード早老症症候群（HGPS）、エメリー等の種々の疾患において主要な役割を果たすことが示されている·ドレフュス型筋ジストロフィー（EDMD）、拡張型心筋症、早期老化やがん22〜25。そのため、外部の機械的微小環境からの力が核の構造と機能をどのように影響するか理解することは、極端な関心事である。 BAXSプラットフォームは、マイルからの力の伝達を調べた<html>その長又は短軸に平行な基板を延伸することにより核にcroenvironment。 図7A-Fは、2つの直交する方向に沿って基板の変形を誘発するためのプラットフォー...

我々は、この資料に複雑な異方性軸の機械的変形に単一細胞応答を調査し、生物学的組織の機械的特性を定量化するために使用することができる新規な延伸プラットフォームを提示する。

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

この手順の全体的な目的は、単一細胞の複雑な機械的変形への応答を調査し、生物組織の機械的特性を定量化するために使用できる等方的ストレッチングプラットフォームの新規性を実証することです。これは、まず柔軟なメンブレンを作製し、このメンブレンを一連のクランプに取り付けることで達成されます。次のステップとして、C2C12細胞をメンブレン上で一晩培養し、翌日にクランプをストレッチングプラットフォームに取り付けます。次に、2回目の実験セットにおいて、マウスモデルから胸部大動脈組織を摘出し、結合組織を除去します。その後、大動脈組織を別のクランプを用いて伸展プラットフォームに取り付けます。最終的に、この伸展プラットフォームを使用して、倒立顕微鏡で定量可能な、2つの直交方向への細胞の変形を誘導します。あるいは、組織の剛性を測定するために、ストレッチ装置に力変換器（フォーストランスデューサー）を組み込みます。単軸または二軸の細胞ストレッチなどの既存の手法と比較したこの技術の主な利点は、細胞が付着している透明なメンブレン上の直交する2方向の変形を独立して制御できることであり、これにより生細胞イメージングが可能になります。また、顕微鏡観察のためには、異なる一組のクランプを慎重に設計する必要があります。プラットフォームに4本のストリングユーザーを統合することで、生体組織の10細胞試験を実施し、その機械的特性を定量化することが可能になります。本ビデオでは、細胞レベルでの基質の変形の効果を調査し、生体組織の引張試験を行うために使用されるカスタムメイドの装置である、バイアクシャルストレッチングプラットフォームを紹介します。バイアクシャルストレッチングプラットフォームの設計と機能は、付随する論文に詳しく記載されています。単一細胞の機械的変形の影響を調査するためには、まず細胞が付着可能な柔軟で透明な基質を作製する必要があります。本手順を開始するには、蛍光マイクロスフィア溶液 500 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブにピペットで分注し、16,200 ×gで10分間遠心分離します。上清を捨ててイソプロパノール 500 µLを加え、5分間ボルテックスします。バイアルを暗所で一晩静置し、大きな粒子凝集体を沈殿させた後、翌朝に上清を新しいマイクロ遠心バイアルに慎重に移します。このビーズ溶液は、その後3日間にわたって沈殿が続くため、5個以上の基板作製に使用することが可能です。Resusがペレットを懸濁させないようにすることが重要です。PDMSキットに付属している硬化剤0.5 gを、1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。蛍光ビーズ15 µLを加え、1分間ボルテックスします。この操作をさらに5回繰り返し、計90 µLのビーズを添加し、置いておきます。10 gのPDMSを量り取り、0.5 gの硬化剤を加え、さらに蛍光ビーズを添加して、少なくとも12分間混合します。次に、トランスファーピペットを用いて、ビーズ入りのPDMS 4 mgを、標準的なフォトリソグラフィー技術を用いて事前に作製したSUH 2050の十字型モールドに分注します。モールドの高さは320 micrometers、面積は13.4 square centimetersであり、428 microlitersまたは440 milligramsのPDMSを充填できます。PDMSを80 °Cで2時間硬化させます。硬化後、モールドから基板を剥がします。この基板は、室温で2週間ペトリ皿に保管しても、その機械的特性に顕著な変化は見られません。ペトリ皿に、最終的な直径が約4 millimetersになるようにPDMSを滴下し、逆さまの状態で80 °Cで2時間硬化させます。硬化プロセス中にドロップが平坦になるのを防ぐため、皿は必ず逆さまに保持してください。これらのアンカリング構造は、ペトリ皿内で数週間保存することが可能です。基板と8つのアンカリング構造をエアプラズマ処理し、膜をクランプに固定するため、基板上の正方形のくぼみから4 mm離れた基板の両端に構造体を結合させます。基板の両端をクランプの溝のある円筒部分に巻き付け、上部にある2本のセットスクリューで固定します。クランプホルダーに4つのクランプをネジで固定します。次に、基板とクランプの溝付き部分の界面にPDMSを注ぎます。1.5 mmの六角レンチを使用して、未硬化のPDMSを溝付きの円筒部分の周囲に広げます。毛細管現象によって完全に満たされるまで、溝にPDMSを注ぎ、膜に細胞を播種する前に、アセンブリを80 °Cで2時間硬化させます。エアプラズマ処理を行い、アセンブリ全体を滅菌し、コラーゲンコーティングを可能にするために基材を機能化します。細胞を播種する基質の領域を、16 µg/mLのラット尾コラーゲンを添加した0.02 M酢酸1 mLを用いて、室温で1時間機能化させます。目標とする最終コラーゲン密度は5 µg/cm²です。1時間後、基質をリン酸緩衝液で3回洗浄し、室温で10分以上乾燥させます。10%胎児牛血清および1%ペニシリンを添加した培養液40 µLを加えてください。基質の中心部分の1平方センチメートルの領域を覆うように、2000個の細胞を含むストレプトマイシンを添加します。この例では、細胞密度は1平方センチメートルあたり20個となります。ただし、細胞密度は実験上の要件に応じて変更可能です。アセンブリ全体を、細胞を含む培養液のドロップを載せた基材を上にした状態で、標準的な細胞培養インキュベーターに入れます。蒸発を防ぎ、細胞を基材にしっかりと付着させるため、アセンブリは基材を上にした状態で少なくとも3時間保持する必要があります。その後、基材上のドロップに30 µLの温めた培養液を加えます。3時間後から、45分ごとにアセンブリ全体を新鮮な培養液を満たしたペトリ皿に反転させ、基材を浸漬して一晩インキュベートし、翌日に細胞を増殖させます。装置を倒立位相差顕微鏡または蛍光顕微鏡に設置します。クランプ基材アセンブリを2軸ストレッチングプラットフォームに装着し、ペトリ皿ヒーター内のペトリ皿に、調製直後のHEPs緩衝生理食塩水を満たします。この生理食塩水は、正常な組織の血液環境を模倣することにより、顕微鏡ステージ上の細胞を維持するために使用されます。同じ二軸延伸プラットフォームを使用して、小さな組織サンプルの剛性を定量化することも可能です。本デモンストレーションでは、単離したマウス大動脈を使用します。安楽死させたマウスから、組織を損傷させるリスクを最小限に抑えるため、横隔膜、胸郭、および肺葉を除去します。心臓は大動脈に付着させたままにし、血管に直接触れないように注意しながら心臓を操作します。血管と脊髄の間を慎重に切断して、組織の内部構造を維持したまま、心臓、大動脈根および胸部大動脈を取り出します。切開時に血管を伸展させないよう注意してください。取り出した心臓と大動脈は、直ちにKrebs溶液に浸し、保存します。なお、Krebs溶液は毎日調製し、実験中は37 °Cに保持してください。外科用解剖顕微鏡下で、大動脈を切り出し、Krebs液で慎重に洗浄して血栓を除去します。マイクロ scissorsとピンセットを用いて結合組織を取り除きます。血管の全長を保持すること、および大動脈根を用いて血管の方向を判断することが重要です。血管の剛性を決定するには、負荷なしの状態での血管寸法が必要です。約2 mmの長さの大動脈リングを切り出し、校正済みの顕微鏡設定を用いてその長さを正確に測定します。このセグメントはKreb溶液に入れておきます。次に、2 mmのセグメントを除去した後に残った大動脈の切片から、小さな大動脈リングを2つ切り出します。1つは2 mmのセグメントより前の部位から、もう1つは2 mmのセグメントより後の部位から切り出します。両方の大動脈リングを、管腔を上にして顕微鏡用スライドガラスに置き、校正済み顕微鏡の設定を用いて壁厚を測定します。大動脈壁の厚さをこれら2つのリングを用いて測定し、平均値を算出します。二軸伸展プラットフォーム上のペトリ皿にKrebs溶液を満たし、2 mmの大動脈リングセグメントをプルピンに挿入します。本プロトコルでは、25%の変位変形という基質変形にさらされた単一マウス筋芽細胞の核の機械的応答を調べるために、二軸伸展プラットフォームを使用しました。標準的な一軸延伸および純粋な一軸延伸を実施した際の関係が、これらの代表的な結果に示されています。ビデオの最初のフレームで蛍光ビーズを手動で選択し、水平方向および垂直方向に最大延伸に達するまで、フレーム間で追跡を行います。MATLABスクリプトを用いて各フレームのグリーン歪みテンソルの成分を自動的に算出し、モーターの変位に対する歪みの検量線を作成します。これらのグラフにおいて、青線と赤線はそれぞれ、緑色の歪みヒートマップの水平方向および垂直方向の成分に対応しています。これらの結果は、2つの直交する方向に基板に歪みを誘起させることができる、二軸延伸プラットフォームの能力を示しています。標準的な単軸または等方性二軸歪み場に加えて、二軸延伸プラットフォームは基板内に複雑な歪み場を誘起することが可能です。パネルGは、基質をx軸方向に4 mm、y軸方向に1.5 mm（赤色で強調）わずかに伸長させると、基質に圧縮変形を伴わない純粋な一軸場が形成されることを示しています。パネルHは、基質の垂直軸方向の両端を固定した状態でx軸方向に3.5 mm伸長させると、25%の変形と7%の圧縮変形が生じることを示しており、これが赤色で強調されています。伸長中のライブセル顕微鏡イメージングを可能にするため、核をDNA結合性のライブセル蛍光染料で染色し、ここに示すように各直交伸長軸に沿って25%ずつ伸長させました。各伸長サイクルのフェーズ間で、未変形および変形した核のコントラスト像とエピ蛍光像を取得しました。未変形状態、および核を長軸・短軸方向に順次伸長させた際の核の長軸および短軸の長さは、ImageJプラグインを用いて決定し、長さの相対的変化の算出に使用しました。この棒グラフの各軸において、X軸（長軸）は青色で、y軸（短軸）は赤色で示されています。核の変形能は機械的な異方性を示し、長軸に比べて短軸方向の変形能が有意に高いことが分かっています。アクチンフィラメントまたは微小管を、それぞれCyto DおよびNocodazoleを用いて選択的に脱重合させ、核の変形能の調節におけるアクチンおよび微小管細胞骨格の役割を検討しました。その結果、アクチンフィラメントまたは微小管を脱重合させると、核の異方的な変形能が消失することが明らかになりました。これらの結果は、細胞骨格成分が基質から核へ力を伝達し、核の自然な力学的挙動を維持するためにも不可欠であるという知見を支持しています。変形過程において、バイアクシャルストレッチングプラットフォームを用いて、熱ショックタンパク質27（HP 27）の慢性的過剰発現が血管の剛性に及ぼす影響を評価しました。動脈硬化好発マウスモデルにおいて、A POEホモ接合体ネガティブは、内膜平滑筋細胞およびコラーゲン含有量を増加させることで、動脈硬化病変の組織学的組成を変化させます。この組織学的リモデリングが血管の機械的特性に及ぼす影響を決定するため、大動脈の剛性を測定するためにストレッチングプラットフォームを使用した。このグラフは、大動脈をストレッチした際に得られた典型的な応力-ひずみ曲線を示しており、剛性はひずみ30%において算出されている。剛性は、曲線に対する赤線で示された接線の傾きである。HSP 27過剰発現マウスの大動脈セグメントの剛性は、対照マウスモデルと比較して41%有意に増加していることが判明しました。以上の結果から、機械的評価を血管およびプラークの組織学的評価と組み合わせることで、HSP 27の過剰発現は血管剛性の増加およびコラーゲン含有量と平滑筋細胞含有量の増加によって特徴付けられることが実証されました。これらの結果は、HSP 27がアテローム性動脈硬化病変の安定性を高め、それによって病変形成後のプラーク破裂のリスクを低下させる可能性があることを示唆しています。この手法は、バイオエンジニアリング分野の研究者が、メカノバイオロジーへの応用に向けて、複雑かつ異方的な機械的変形に対する細胞応答を探索することを可能にするだけでなく、疾患における生体組織の力学的な挙動をモニタリングするための新たな道を開くものです。

a-novel-stretching-platform-for-applications-cell-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの製作、そしてどのようにこの基盤技術は2次元と3次元の両方の文化の中でハイスループット機械的にダイナミックな細胞培養を実施するように変更することができますを示していますパラダイム。...

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。...

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

細胞分化は、マトリックス組成物と基板材料の特性の両方を含む微小環境因子の宿主によって調節されます。ここでは細胞分化および微小環境のコンテキストの関数としての生体力学的な細胞 - 基質相互作用の両方を評価するための牽引力顕微鏡と組み合わせて、細胞マイクロアレイを利用した技術が記載されています。...

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

ここでは、ギャップ接合コネクシン43を破壊する力学ベースのプロトコルを提示し、トラクションと細胞間応力の観察を通じて内皮バイオメカニクスに及ぼすその後の影響を測定する。...

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

提示された方法は、ライブ共焦点顕微鏡を可能にしながら、シリコーンゴムに埋め込まれた3Dソフトヒドロゲルの単軸ストレッチを含む。繊維のアライメントと同様に、外部および内部ヒドロゲル株の特性評価が実証されている。開発された装置およびプロトコルはさまざまなひずみのレジームに対する細胞の応答を査定できる。...

ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

本研究では、細胞質内に送達される磁気マイクロビーズを介して細胞核に直接力を加え、生細胞蛍光イメージングを同時に行うための新しいプロトコルを提示します。...

3D磁力アクチュエータと多機能蛍光イメージングを組み合わせて核メカノバイオロジーを研究

ここでは、メカノノード細孔センシング(mechano-NPS)と呼ばれるエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を機械的に表現型化する方法を示します。このプラットフォームは、細胞の弾性と粘性の両方の生物物理学的特性を測定しながら、1〜10細胞/秒の中程度のスループットを維持します。...

メカノノードポアセンシング:マルチパラメータシングルセル粘弾性測定のための迅速でラベルフリーのプラットフォーム

ここでは、空気圧で作動し、高解像度顕微鏡法と互換性のある汎用性の高い等二軸ストレッチデバイスを紹介します。...

高倍率生細胞共焦点蛍光顕微鏡用等二軸延伸装置

ここでは、細胞に対して等方的および一軸のひずみ波形を適用しつつ、基質上で培養を支持し、剛性を調整可能かつタンパク質行列をカスタマイズ可能な新しい装置として紹介します。このシンプルで経済的なプラットフォームにより、研究者は基礎研究から疾患関連の文脈において、機械的な手がかりがどのように細胞機能を調節するかを調査できます。...

in vitro 細胞の伸縮および画像診断のための新しいプラットフォーム

金の長鎖アルカンチオールから形成された自己組織化単分子層（SAM）は、蛋白質のパターンとセルの閉じ込めを形成するための明確に定義された基質を提供しています。ポリジメチルシロキサン（PDMS）グリコール終端アルカンチオールの単量体との埋め戻しに続いてスタンプを使用してhexadecanethiolのマイクロコンタクトプリンティングは、タンパク質や細胞の吸着のみスタンプhexadecanethiol地域にパターンを生成します。...

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

学ぶ単細胞応答の複雑な異方性二軸機械変形への反応を調べる新規ストレッチングプラットフォームを用いた方法。C2C12細胞とマウス大動脈組織を用いて生体組織の機械的特性を定量化し、細胞力学と組織工学への応用を示す。

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

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