細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

この手順の全体的な目標は、複雑な機械的変形に対する単一細胞応答を調査し、生体組織の機械的特性を定量化するために使用できる等方性ストレッチプラットフォームの新規性を実証することです。これは、最初にフレキシブルメンブレンを製造し、このメンブレンを一連のクランプに取り付けることによって達成されます。第2ステップは、C 2つのC 12細胞をメンブレン上で一晩培養し、翌日、クランプをストレッチプラットフォームに取り付けます。

次に、2番目の実験セットでは、胸部大動脈組織をマウスモデルから拒絶し、結合組織から洗浄します。次に、大動脈組織は、別のクランプセットを使用してストレッチプラットフォームに取り付けられます。最終的に、ストレッチングプラットフォームを使用して、倒立顕微鏡を使用して定量化できる2つの直交方向に沿って細胞に変形を誘導します。

あるいは、力変換器をストレッチ装置に統合して、組織の硬さを測定することもできます。この技術の主な利点は、ユニアクタルまたは二軸細胞延伸などの既存の技術と比較して、細胞が付着している透明な膜内の2つの直交方向の変形を独立して制御できるため、生細胞イメージングが可能になることです。顕微鏡検査も、クランプの異なるセットの慎重な設計。

プラットフォームに4ストリングのユーザーを統合することで、生体組織に対して10個の細胞試験を行い、その機械的特性を定量化することができます。このビデオでは、細胞レベルでの基板変形の影響を調査し、生体組織に対して引張試験を行うために使用できる特注の装置であるBiaxial Stretchingプラットフォームを紹介しています。二軸延伸プラットフォームの設計と特徴は、単一細胞の機械的変形の影響を調査するための添付の原稿で詳しく説明されており、細胞が接着できる柔軟で透明な基板を最初に製造する必要があります。

この手順を開始するには、蛍光マイクロスフェア溶液の500マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペットで移し、16,200Gで遠心分離します10分間、スーパーナトを廃棄し、500マイクロリットルのイソプロパノールを加え、続いて5分間のボルテックスを行います。翌朝に大きな粒子凝集体が沈殿するのを防ぐために、バイアルを暗闇で一晩脇に置き、SNATを清潔なマイクロ遠心分離バイアルに慎重に移します。このビーズ溶液は、ビーズ溶液が次の3日間沈殿し続けるため、5つ以上の基板を製造するために使用できます。

Resusがペレットを吊り下げないようにすることが重要です。PDMSキットに付属の硬化剤0.5gを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機バイアルに注ぎます。15マイクロリットルの蛍光ビーズと渦を1分間加えます。

これをさらに5回繰り返して、合計90マイクロリットルのビーズを取っておきます。10グラムのPDMSを秤量し、0.5グラムの硬化剤を加え、蛍光ビーズを添加し、少なくとも12分間混合します。次に、トランスファーピペットを使用して、ビーズ入りPDMSの4ミリグラムを、以前に標準的なフォトリソグラフィー技術を使用して作製したSUH 2050十字型モールドに移します。

金型の高さは320マイクロメートル、面積は13.4平方センチメートルで、428マイクロリットルまたは440ミリグラムのPDMSを含めることができ、摂氏80度で2時間PDMSを硬化させます。基板を金型から剥離して硬化させた後、基板をペトリ皿に室温で2週間保持しても、大きな変化やその機械的特性を示すことはありません。直径約4mmの最終サイズのシャーレにPDMSの液滴を注ぎ、摂氏80度で2時間逆さまに硬化させると、硬化プロセス中に液滴が平らになるのを防ぐために、ディッシュを逆さまに維持する必要があります。

これらの固定機能は、ペトリ皿に数週間保持できます。エアプラズマは、基板と8つの固定機能を処理し、基板上に存在する正方形のくぼみから4ミリメートルの距離で基板の両端の特徴を結合して、クランプにメンブレンを取り付けます。基板の両端をクランプの溝付き円筒部分に巻き付け、上から2本の止めネジで固定します。

clをねじ込みますamp ホルダーに。次に、基板とクランプの溝付き部分との間の界面にPDMSを注ぎます。未硬化のPDMSを1.5mmの六角レンチを使用して、溝のある円筒形部品の周りに広げます。

毛細管現象によって完全に満たされるまでPDMSを溝に注ぎ、膜上に細胞を播種する前に、アセンブリを摂氏80度で2時間硬化させます。空気プラズマ。アセンブリ全体を処理して、コラーゲンコーティングを可能にするために基材を滅菌および機能化します。

細胞に1ミリリットルの0.02モル酢酸を播種する基質の領域に、室温で11時間、ラットテールコラーゲン1ミリリットルあたり16マイクログラムを補充します。望ましい最終的なコラーゲン密度は、1平方センチメートルあたり5マイクログラムです 1時間後、基質をリン酸緩衝液で3回すすぎ、室温で少なくとも10分間乾燥させます。10%ウシ胎児血清と1%ペニシリンを添加した40マイクロリットルの培地を加えます。

ストレプトマイシンは、基質の中央部分に2000個の細胞を含み、1平方センチメートルの領域をカバーします。この例では、セル密度は 1 平方センチメートルあたり 20 セルです。ただし、細胞密度は実験要件に応じて変更できます。

アセンブリ全体を標準的な細胞培養インキュベーターに入れ、基質を上にして、その上に細胞を含む培養培地を滴下します。アセンブリは、蒸発を防ぐために細胞が基板にしっかりと付着できるように、基板を上に向けて少なくとも3時間保持する必要があります。30マイクロリットルの温かい培地を基質上の液滴に加えます。

3時間後、45分ごとに、アセンブリ全体を新鮮な培養培地で満たされたペトリ皿にひっくり返し、基質を一晩インキュベートして、翌日に細胞が増殖できるようにします。セットアップを逆位相差顕微鏡または蛍光顕微鏡に取り付けます。クランプ基板アセンブリを二軸ストレッチプラットフォームに取り付け、モーターがシャーレヒーター内のシャーレに新たに調製されたHEPs緩衝塩溶液を充填します。

この生理学的溶液は、正常組織の血液環境を模倣することにより、顕微鏡ステージ上の細胞を維持するために使用されます。同じ二軸ストレッチングプラットフォームを使用して、小さな組織サンプルの剛性を定量化することもできます。このデモンストレーションでは、単離されたマウス大動脈を使用します。

安楽死させたマウスから横隔膜、胸郭、肺葉を取り外して、組織を損傷するリスクを最小限に抑えます。心臓を大動脈に取り付けたままにし、血管に直接触れて操作しないようにします。心を使う。

血管と脊椎の間を優しく切って心臓、大動脈基部、胸部大動脈を切除し、組織の内部構造を損なわないようにします。切開時に血管に伸びを誘発しないように注意してください。心臓と大動脈を、毎日調製され、実験中に摂氏37度に保たれるクレブス溶液にすぐに浸して保管します。

動脈をクレブス溶液で切断して慎重に洗浄し、外科用解剖顕微鏡で機能する血栓を取り除きます。マイクロハサミとピンセットを使用して結合組織を取り除きます。すべての血管の長さを保ち、大動脈基部を使用して血管の向きを決定することが重要です。

無負荷の容器の寸法は、容器の剛性を決定するために必要です。長さ約2mmの大動脈リングを切断し、校正された顕微鏡設定を使用してその長さを正確に測定します。このセグメントはクレブの解決策で脇に置いておきます。

次に、2ミリメートルのセグメントを取り外した後に残った大動脈のセクションから2つの小さな大動脈リングを切り取ります。1つは2ミリメートルセグメントの前の大動脈セクションからのリング、もう1つは大動脈セクションからのリングです。2ミリメートルのセグメントの後、ルーメンを上に向けて顕微鏡のスライドガラス上に両方の大動脈リングを置き、キャリブレーションされた顕微鏡設定を使用して壁の厚さを測定します。

大動脈壁の厚さは、これら 2 つのリングを使用して測定および平均化されます。二軸ストレッチプラットフォーム上のペトリ皿にクレブス溶液を充填し、2ミリメートルの大動脈リングセグメントを引っ張りピンに挿入します。このプロトコルでは、二軸ストレッチングプラットフォームを使用して、25%の変位変形の基質変形にさらされた単一のマウス筋芽細胞の核の機械的応答を調査しました。

標準および純粋な単軸延伸を行うことによる関係は、これらの代表的な結果に示されています。蛍光ビーズは、ビデオの最初のフレームで手動で選択され、水平方向と垂直方向で最大の伸びに達するまで、1つのフレームから別のフレームに追跡されます。MATLAB スクリプトは、各フレームの緑色のひずみテンソルの成分を自動的に計算し、モーターの変位に対するひずみの検量線を生成します。

これらのグラフでは、青と赤の線は、それぞれ水平方向と垂直方向に沿った緑のひずみヒアの成分に対応しています。これらの結果は、2つの直交方向に沿って基板に変形を誘発する二軸延伸プラットフォームの能力を示しています。EQU二軸ひずみ場の標準的な一軸に加えて、二軸延伸プラットフォームは基板に複雑なひずみ場を誘導することができます。

パネルGは、同じ基板をX軸に沿って4ミリメートル引き伸ばし、赤で強調表示されたY軸に沿って1.5ミリメートルわずかに引き伸ばすと、基板に圧縮変形のない純粋な一軸場が生成されることを示しています。パネル、Hは、基質をx軸に沿って3.5ミリメートル引き伸ばすと、垂直軸に沿った基質の端部が固定されると25%の変形および7%の圧縮変形を生じることを示しており、赤で強調表示された伸張核中に生細胞顕微鏡イメージングを行う能力により、DNAに結合する生細胞蛍光色素で染色し、次いで各直交伸張軸に沿って25%伸ばした。ここでは、各ストレッチサイクルフェーズの間に、未形成核と変形核のコントラスト画像とエピ蛍光画像を取得しました。未形成状態に沿った長核軸と短核軸の長さ、および原子核がその長軸と短軸に沿って順次引き伸ばされたときの長さは、画像Jプラグインを使用して決定され、長さの相対的な変化を計算するために使用されました。

この棒グラフの各軸に沿って、X軸(長軸)は青で、Y軸(短軸)は赤で示されています。核の変形能力は、その短軸に沿って有意に高い変形能を示すため、機械的異方性を示し、その長軸と比較して、核変形能力の調節におけるアクチンおよび微小管の細胞骨格の役割を解重合することにより調べ、アクチンフィラメントまたは微小管をそれぞれcyto Dおよびneolを用いて選択的に解重合することによって調べた。アクチンフィラメントまたは微小管は、核の異方性変形能の喪失を誘発することがわかりました。

これらの結果は、細胞骨格成分が基質から核に力を伝達し、核の自然な機械的振る舞いを維持するためにも不可欠であるという知見を裏付けています。変形中、二軸延伸プラットフォームは、熱ショックタンパク質27またはHP27の慢性的な過剰発現が血管硬化HSPの過剰発現に及ぼす影響を評価するためにも使用されました。アテローム性動脈硬化症になりやすいマウスモデルでは、POEホモ接合型ネガティブは、内膜平滑筋細胞とコラーゲン含有量を増加させることにより、アテローム性動脈硬化症病変の組織学的組成を変化させます。

この組織学的リモデリングが血管の機械的特性に与える影響を判断するために、ストレッチプラットフォームを使用して大動脈硬化を測定しました。このグラフは、大動脈血管を伸ばすことで得られる典型的な応力ひずみ曲線を示していますが、剛性はひずみの30%で計算されます。剛性は、曲線に対して赤い線で示される接線の傾きです。

HSP 27を過剰発現させたマウスの大動脈部分の硬さは、対照マウスモデルと比較して41%有意に増加したことがわかりました。まとめると、血管とプラークの組織型と組み合わせた機械的評価により、HSP 27の過剰発現は血管の硬化とコラーゲン平滑筋細胞含有量の増加によって特徴付けられることが示されました。これらの結果は、HSP 27が潜在的にアテローム性動脈硬化性病変の安定性を高め、したがってプラーク破裂のリスクを低下させることを示唆しています その発症後。

この技術は、バイオエンジニアリングの分野の研究者が、複雑で変力的な機械的変形に対する細胞応答を探求し、機械生物学への応用だけでなく、疾患における生体組織力学のモニタリングにも新たな方法を提供します。