Name: ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学ぶポリソーム分画法による哺乳類細胞の翻訳リボソーム分離とmRNA翻訳活性解析。シクロヘキシミド処理と蔗糖密度勾配遠心分離を用いて、ゲノム規模での遺伝子発現制御を研究します。

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この研究はまた、CIHR若手研究者賞を受賞され、それに健康の研究助成金のカナダの協会（CIHRからMOP-115195）とFRQ-Sによってサポートされていました。とスウェーデンの研究評議会とスウェーデンの癌協会はOLする

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<li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
<li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
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<li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li>
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<li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li>
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<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li>
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<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li>
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<li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li>
<li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li>
<li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li>
<li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+translational+control+in+CD4%2B+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13(2013).</li>
<li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li>
<li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li>
<li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li>
<li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li>
</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

この記事では、哺乳動物細胞におけるゲノムワイド規模で翻訳活性の質的および量的な変化を捉えるために社内開発の分析方法に続いて十分に確立されたポリソーム分画プロトコルについて説明します。このプロトコルは特別な注意が正常に完了したが、1）細胞集密度に支払われるべきであるため増殖率と栄養利用は、mRNAの翻訳活性と相関し、translatomeの構成に影響を与えることができるように（、細胞集密度）を複製した実験条件間で一貫している必要があり、 2）急速な細胞溶解（シクロヘキシミドおよびバッファ内のRNA分解酵素阻害剤の存在にもかかわらず、溶解が迅速かつ細胞抽出物がすぐにRNA分解やポリソームの解離を防止するための溶解後に、ショ糖勾配上にオーバーレイされるべきであるべきである）、3）グラデーション準備（確保するための高いデータ再現性、スクロース勾配は、勾配メーカー、SPEを用いて調製されるべきである）、それらを処理する際に金融注意が必要です。 翻訳活性の変化を研究することに加えて、このプロトコルは、リボソーム関連タンパク質複合体を単離し、それらの生理学的機能を確立するために使用することができる。リボソーム関連タンパク質複合体は勾配分画から免疫沈降し、ウエスタンブロッティングまたは質量分析法によって分析することができるのに対し、この目的のために、種々のリボソーム関連タンパク質のレベルおよびリン酸化状態は、ウェスタンブロッティング、続いてTCA沈殿により決定することができる。この手法の欠点は、遅い勾配分画法が結合動態の急速な結合/解離にあっても強固に結合したタンパク質の解離を引き起こす可能性があることです。新たに合成されたポリペプチドに関連した要因は、典型的な例である。リボソームを構成する新興新たに合成されたポリペプチドは、3のような化学的架橋剤を使用してリボソームに関連するタンパク質複合体上に固定化することができる、3&#39;-ジチオビス[スルホスクシンイミジル]（DTSSP）31。このアプローチは、受容体活性化Cキナーゼ1（RACK1）/ c-Jun N末端 ​​キナーゼ（JNK）/真核生物翻訳伸長因子1A2（EEF1A2）錯体がストレス27に応答して新たに合成されたポリペプチドの分解を調節すること。明らかにまた、同様の方法論は、タンパク質キナーゼC BII（PKCbII）はRACK1 32によりリボソームへ補充されるおよびmTOR複合体2（mTORC2の）の活性化は、それが新たに合成されたAKTポリペプチドをリン酸化し、それらを調節するリボソーム上で起こることを示す研究に使用した安定性33,34。 anota分析を行っソーム分画法の主な制限は以下のとおりです。細胞の比較的多数（〜15×10 6細胞）のための1）の要件、2）指定されたmRNA分子上のリボソームの局在に関する位置情報の欠如、および3細胞および分子ヘテロに関連する）の​​問題正常組織および腫瘍組織のgeneity。必要な細胞数に関連する問題は、量、高存在量の細胞（ 例えば HeLa細胞）35から得られたものと限定された細胞のモノソーム（80S）に対応する吸光度スペクトルピークを整列させることによって解決することができる。例えば、ヒト組織のような複雑なシステムから得られた遺伝子発現の変化の解釈上の組織の不均一性の交絡効果に関連する問題が議論されているのに対し、リボソームプロファイリング技術（下記参照）は、所与のmRNA分子上のリボソームの正確な位置を決定するために使用することができるネギやストーリー36による刊行物に詳細が。 最近では、技術をプロファイリング小説リボソームはリボソーム保護された断片（RPFS）はRNA分解酵素I処理によって生成され、ディープシーケンシング22によって解析され、開発されました。この技術は、それによって、これまで提供した一塩基分解能でリボソーム位置の決定を可能にするUNPRリボソーム生物学へのecedented洞察。例えば、リボソームプロファイリングは、指定されたmRNA分子、またはそのような代替開始部位、非8月コドンなどuORFsなどの調節エレメントの開始などの影響翻訳開始率、その要素の識別にリボソーム密度の測定のために使用することができます。しかし、正確にmRNAの翻訳効率を推定するリボソームプロファイリングの能力を制限するいくつかの方法論的な制限があります。これらはランダムな断片化とリボヌクレアーゼI消化により導入された独立したバイアスを含み、翻訳阻害剤（例えば、エメチンやシクロヘキシミドなどなど 、伸び阻害剤は翻訳開始部位でのリボソーム蓄積を誘導する可能性がある）により導入されたバイアスは、偽陽性や偽陰性の結果の多くは、関連するTEスコアだけでなく、予測する上で、その不正確さとそれがタンパク質をコードするmRNA 37から発信読み込みます。おそらく最も重要なのに対し、リボソームプロファイリングが与えられたmRNA分子上のリボソームの位置を直接同定を可能にする、指定されたmRNAと関連しているリボソームの数は、間接的に、合計（ランダムに断片化されたmRNAに観察されたものの上にRPFS（リボソーム関連するmRNA）を読み込みの頻度を正規化することによって推定されているmRNA）の。例えば、4つの「B」mRNA分子（BaとBbは、BCおよびBdの）は、位置1、2、3、4、リボソームプロファイリング技術の固有の欠点で4リボソームによって占有されている単純な設定では許可しないシナリオここで、すべてのリボソーム関連付けるだけBaの位置1におけるmRNA、2、3、4およびBa、Bbは、BCおよびBdのmRNAは、各位置での1つのリボソームによって占有されるシナリオで、2の区別それぞれ図3、図4、。これとは対照的に、ポリソーム分画の間に、ポリソーム完全性は、それによってリボソームの定義された数（ 図1）に関連するmRNAのプールの単離を可能に、保持されます。このインポートソーム分画およびリボソームプロファイリング間の蟻の区別は、前者の方法は、直接のmRNPの軽重ポリソーム画分中のmRNAを比較するために使用することができるが、後者の方法は、おそらく移行からのmRNAによって引き起こされるtranslatomeの変更をキャプチャするために失敗することを示唆している重いポリソームへのmRNP分からシフトしているものの寄与を過大評価している間、重いポリソームに点灯します。前述の方法との間に、これらの矛盾の生物学的意義は、保有するものと他のもの、一方で、このようなのeIF4Eと小文字が区別されているようなmRNAのサブセットの翻訳活性化を示すデータの大きな体、光から重いポリソームへの移行によって強調される5&#39;TOP要素は、直接リボソームのないmRNAの6のプールから重いポリソームに補充される。興味深いことに、mTOR経路は、同時に「eIF4Eの敏感な」及び5&#39;TOP mRNAの1の翻訳を調節することが示されている1であるため、上述された方法論の違いはtranslatome上のmTOR阻害の効果を評価するためにプロファイリング38,39リボソーム及びポリソーム分画24を用いた研究の結論の間の見かけの不一致を説明することができる。 結論として、ポリソーム分画およびリボソームプロファイリングは、主にそれぞれのmRNA上のmRNAとリボソームの位置に関連したリボソームの数に関する情報を提供する補完的なメソッドです。重要なことに、これらの方法の欠点と利点にもかかわらず、それは両方の手順によって得られたゲノムワイドなデータを適切に分析し、機能的にも生化学的に検証されることが不可欠で残っている。

遺伝子発現を制御する調節ネットワークは、広範囲に、最後の20年間に研究されてきた。ゲノムワイドスケールでの定常状態のmRNAレベルの変化は、いわゆる「遺伝子発現」プロファイルを決定するために使用されたことにより、転写調節に焦点を当て、これらの研究努力の大半。最近の研究では、定常状態のmRNAレベルが緩く、それにより、mRNA翻訳などの転写後メカニズムは、遺伝子発現3,4の調節において主要な役割を果たすことを示す、プロテオーム1,2の組成に相当することを明らかにした。実際に、〜のタンパク質レベルの50％が不死化マウス線維芽細胞5におけるmRNA翻訳のレベルで決定されると推定されている。 mRNAの翻訳は、mRNAがリボソームの編成作用を介してタンパク質に翻訳される間の高度に調節されたプロセスである転移RNA（tRNAは）と付属要因COmmonly翻訳因子（TFS）6と呼ばれる。タンパク質合成は、哺乳動物細胞7で最もエネルギーを消費するプロセスであり、したがって、全体的なmRNAの翻訳速度は、栄養利用および細胞増殖速度8を収容するように調整される。全体的なmRNAの翻訳速度の変化に加えて、種々の細胞外刺激（ 例えばホルモン及び成長因子）、細胞内の手がかり（ 例えば、アミノ酸レベル）およびストレス（ 例えば、ERストレス）の異なるタイプがあるmRNAのプールにおける選択的な変化を誘導（translatome）6を翻訳さ。刺激、いくつかの翻訳活性ではなく、のタイプに応じて、全てのmRNAが劇的に、それによって迅速な細胞応答6を取り付けるために必要とされるプロテオームの変更を伴う、影響を受けます。 translatomeにおけるこれらの定性的および定量的変化は、トランス作用因子間の相互作用（ 例えばにより媒介されると考えられている</EM&gt;翻訳機構は、補助因子またはmiRNA）はおよびmRNAの6,9の選択されたサブセットに存在するシスエレメント（RNAエレメントまたは機能）の成分。例えば、レベルおよび/ ​​または律速翻訳開始の活性の変化は、eIF4Eのとは、eIF2が選択特定の5&#39;UTRの特徴6に基づいて転写産物の翻訳を調節要因。のeIF4Eとは、eIF2は、それぞれ6、リボソームへのmRNAおよび開始tRNAの募集のために必要とされる。 eIF4Eの活性の増加は、選択的サイクリンのc-mycおよびBcl-xLの10を含むタンパク質をコードするもの刺激増殖および生存を含む長いと高度に構造の5&#39;UTRを保有するmRNAの翻訳をボルスタ。今度は、eIF2はの不活性化は、選択的にこのようなコードするものマスターTとしてのの5&#39;UTRが短い阻害上流オープンリーディングフレーム（uORFs）を含むmRNAの翻訳を調節しながら、全体的なタンパク質合成のシャットダウンにつながる小胞体ストレス応答（ 例えば ATF4）のranscriptionalレギュレータです。 MAPK経路は直接リン酸化し、一方、栄養素、成長因子およびホルモンを含む様々な刺激に応答して、ラパマイシン（mTORの）経路の哺乳類/機構的標的は、翻訳抑制の4E-結合タンパク質（4E-BP）ファミリーを不活性化することによって、eIF4Eの活性を刺激する6,11 EIF4E。今度は、eIF2αリンキナーゼ（ すなわち PERK、PKR、HRIとGCN2）は栄養枯渇、ERストレスやウイルス感染6,12に応答して、そのeIF2αリン調節サブユニットをリン酸化することによっては、eIF2を阻害する。 TFの活性および/ ​​または発現の変化は、翻訳機構およびmiRNAを含む調節因子の他の構成要素は、がん、メタボリック症候群、神経学的及び精神障害、腎および心血管疾患13〜19を含む様々な病理学的な状態で観察されている。まとめると、これらのデータは、その並進私を示すchanismsは、細胞の恒常性を維持する上で、それらの抑止は、様々なヒト疾患の病因において中心的な役割を果たしている中心的な役割を果たしている。 ここで、モノソーム、リボソームサブユニットメッセンジャーリボ核タンパク質粒子（mRNPs）からポリソームを分離するために使用される哺乳動物細胞におけるショ糖密度勾配遠心分離によってポリソームの分画のためのプロトコルが記載されている。これが不十分（光ポリソームに関連する）、翻訳mRNAから効率的に翻訳（重いポリソームに関連付けられている）との識別を可能にします。このアッセイでは、リボソームは、シクロヘキシミド20およびサイトゾル抽出物を遠心分離によって5-50％線状スクロース密度勾配上で分離されているような翻訳伸長阻害剤を用いたmRNA上に固定化される。ショ糖勾配のその後の分別は、それらが結合しリボソームの数に応じて、mRNAの単離を可能にする。各画分から抽出されたRNAは、その後決定することができる異なる条件間の勾配を横断するmRNAの分布の変化、それによって勾配の上から下への翻訳効率が向上する。ノーザンブロッティングまたは定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を、各画分中のmRNAのレベルを決定するために使用される。 代替的に、重いポリソーム（典型的に3つ以上のリボソーム）を含有する画分をプールし、ゲノムワイド関連ポリソームmRNAレベルは、マイクロアレイまたはディープシーケンシングを使用して決定される。これは、ポリソーム関連するmRNAのレベルは、翻訳に加えて、サイトゾルのmRNAレベルに影響を与える21の転写および転写後メカニズムによって影響されることを強調するために最も重要である。したがって、ポリソーム関連mRNAからゲノムワイドなデータを用いて、翻訳の違いを決定するための換算はその上流にある遺伝子発現経路における工程からの影響を補正する必要があるTiONから21。このような補正を可能にするために、細胞質ゾルRNAは、各試料からのポリソーム関連RNAと並列に調製し、ゲノムワイドな定常状態のmRNAレベルを21に決定される。現在、いわゆる「翻訳効率」（TE）がゴール（ポリソーム関連mRNAのデータおよび細胞質のmRNAデータと、すなわち対数比）は、多くの場合の翻訳効率にサイトゾルmRNAレベルの変化の影響を補正するために使用されるmRNAを22与えられた。しかし、差動変換を識別するために、TEスコアを使用することは一般的に偽の相関27と呼ばれる、TEスコアの数学的な性質に起因する偽陽性や偽陰性所見のかなりの数に関連している。実際、複数のラボからのデータセットの調査は、このようなスプリアス相関がtranslatomes 23の変化を分析するときに避けられないように見えることを示した。これは、差動のtrの「分析の開発を促し<html>前述の欠点23の影響を受けないanslation」（anota）アルゴリズム、。 anota、分析中の回帰モデルは、細胞質ゾルRNAレベルの独立した翻訳活性の測定値を導出するために使用される。このような措置は、その後の条件と統計が計算されている間で比較する。ユーザーは、統計的検出力を向上させ、いくつかの複製24を用いた研究では偽陽性所見の発生を減少させ、分散収縮法を適用するオプションを持っています。重要なことに、最近anotaによって捕捉translatomeにおける摂動はなく、TEスコアは、25プロテオームの変化と相関することが実証された。したがって、それは非常にゲノムワイド規模での翻訳の変化を同定するためのanota分析を適用することを推奨します。 anotaアルゴリズムの理論的基盤が以前21,23,26詳細に議論されたが、ここでの焦点は、実際にそれを適用する方法である。 細胞中のmRNA翻訳活性の変化を研究することに加えてve_content &quot;&gt;、このリボソーム分画プロトコルが分離し、生化学的および機能的リボソーム及びポリソーム結合蛋白質複合体を特徴付けるために使用することができる。このアプローチは、正常に識別するために、過去に展開されている新たに合成されたポリペプチド27および/ ​​または翻訳機構の構成成分のリン酸化に関与しているの安定性を調節複合体は、ポリソーム分画法のこの適用はまた、簡単に説明する。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Biobasic</td><td>HB0264</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>CABDH4532</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Biobasic</td><td>DB0058</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biobasic</td><td>TB0196</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue Ambion</td><td></td><td>AM9515</td><td>RNA Precipitation Carrier</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>Sigma</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>04693132001</td><td>錠(EDTAフリー)</td></tr><tr><td>RNase阻害剤&nbsp;</td><td>プロメガ</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & マイクロ;m フィルターシステム 150 ml</td><td>コーニング</td><td>431155</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute クリーンアップキット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>RNAクリーンアップキット</td></tr><tr><td>薄肉ポリアロマー超遠心チューブ&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW41Ti ローターパッケージ 付属品</td><td>付き ベックマン・コールター</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Optima L100 XP 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>DS-9340A</td><td></td></tr><tr><td>ISCO フラクションコレクター&nbsp;</td><td>Brandel</td><td>FC-176-R1</td><td></td></tr><tr><td>チャートレコーダー付きタイプII検出器</td><td>Brandel</td><td>UA-6</td><td>UV検出器</td></tr><tr><td>チューブピアサー(フローセルとシリンジポンプ付き</td><td>) Brandel</td><td>BR-A86-5</td><td></td></tr><tr><td>UA-6検出器ケーブル</td><td>Brandel</td><td>60-1020-211</td><td></td></tr><tr><td>FC-176 通信ケーブル</td><td>Brandel</td><td>FCC-176</td><td></td></tr><tr><td>グラジエントマスターベースユニット</td><td>バイオコンプ</td><td>108-1</td><td>グラジエントメーカー</td></tr><tr><td>グラジエントフォーミングアタッチメント</td><td>Biocomp</td><td>105-914A-1R</td><td>グラディエントメーカーアタッチメント</td></tr><tr><td>Measurement Computing 8チャンネル 50kHz データ収集デバイス</td><td>MicroDAQ</td><td>USB-1208FS</td><td>解析ソフトウェアアタッチメント</td></tr><tr><td>Measurement Computing データ収集ソフトウェア</td><td>MicroDAQ</td><td>TracerDAQ Pro</td><td>解析ソフトウェア (ダウンロードのみ)</td></tr><tr><td>ショ糖勾配用10倍バッファー:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM HEPES (pH7.6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &g/ml シクロヘキシミド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x プロテアーゼ阻害剤カクテル (EDTA-free)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 units/ml RNase inhibitor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM KCl&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x プロテアーゼ阻害剤カクテル(EDTAフリー)]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>次に、本文に示されているように、シクロヘキシミド(CHX)、DTT、RNAse阻害剤、トリトン、デオキシコール酸ナトリウムを添加します</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ゲノム規模で哺乳類translatomesのソーム分画および分析

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNAの翻訳は、遺伝子発現の調節において中心的な役割を果たし、哺乳動物細胞中で最もエネルギーを消費するプロセスを表す。従って、mRNA翻訳の調節不全は、癌を含む種々の病理学的状態において主要な役割を果たしていると考えられる。リボソームは、それにより新たに合成されたポリペプチドの機能と安定性の調節、発生期のポリペプチドの折り畳みを促進するシャペロンをホストする。また、新興のデータは、リボソームが、彼らは、リボソームから出てくるように新たに合成されたポリペプチドの翻訳後修飾の様々に関与している分子、および/または翻訳機構の成分を信号のレパートリーのためのプラットフォームとして機能することを示している。ここで、ショ糖密度勾配遠心分離を用いてリボソーム分画の十分に確立された方法が記載されている。社内開発した「anota &quot;アルゴリズムと併せて、この方法は、diffeの直接測定を可能にするゲノムワイド規模での個々のmRNAの翻訳rential。また、この多目的なプロトコルは、新たに合成されたポリペプチドのフォールディング及び分解において中心的な役割を果たすものを含むリボソーム関連タンパク質複合体の機能を分析することを目指し種々の生化学的研究のために使用することができる。

mTORは、栄養素利用19で全体的なタンパク質合成速度を調整し、セルラーネットワークの主要ノードです。 mRNA翻訳が律速開始段階6で、主に規制されている。ポリソームに従事してリボソームの割合は、積極的に翻訳開始速度28と相関する。 mRNAの翻訳に対するインスリンの効果を仲介するmTORシグナル伝達の役割を調査するためにポリソーム画法を適用した例が提示される。この目的のために、MCF7ヒト乳癌細胞は、低血清中で維持し、次いでインスリン単独で、または活性部位mTOR阻害Torin1との組み合わせで刺激した。連続的に低い血清中で維持した非刺激細胞は、対照とした。 mRNPs、モノソーム（80S）およびポリソーム画分をポリソーム分画法を用いて分離した。対照細胞と比較して、インスリンは、対応する勾配画分における吸光度の増加を誘導しポリソームに、一染色体分中の吸光度の減少が同時に起こる（ 図1）を伴う。これらの知見は、ポリソームに従事リボソームの割合は、したがって予想通り、インスリンは、グローバル翻訳開始速度を刺激する、ことを示す、対照細胞と比較して、処理されたインスリンが増加することを示している。 Torin1ことによりmTORシグナル伝達は、翻訳機構19に対するインスリンの効果を媒介に主要な役割を果たすという知見を裏付け、吸光度プロファイルに対するインスリンの効果（ 図1）を逆転させた。 勾配製剤の矛盾を避けることができない教義に基づいて、質問はポリソーム画法22を用いて得られたデータの再現性に関して提起されている。経験的に、この潜在的に有害な問題で、細胞質ゾルと重いポリソーム関連RNA（4以上のリボソームに関連するmRNA）をテストするために単離された<html> 4つの独立した生物学的複製からTorin1（ 図2）との組み合わせで、単独でインスリンまたはインスリンで処理したMCF7細胞から。細胞質ゾルおよび各反復における重いポリソーム関連mRNAの組成に、インスリンおよびTorin1の効果は、マイクロアレイ法を用いて、ゲノムワイドなスケールで決定した。主成分分析（PCA）を適用したポリソーム分画法の再現性を決定すること。このような分析は、異なる条件がよく（ 図2）を分離しながら、それぞれの条件に属するサンプルが密に二つの第一の構成要素内に配置されたことを示した。これらの知見は、ここで説明したようにポリソーム分画法は、再現性の高いゲノムワイドなレベルでの翻訳の量的および質的な変化を研究することが適切であることを示している。 ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; 図1 MCF7細胞におけるグローバル並進上でシグナリングを血清飢餓、インスリンおよびmTOR阻害の効果を示すポリソームプロファイル。MCF7細胞を、16時間の栄養素（0.1％FBS中で維持）を奪われ5nMのインスリン（INS）で処理し、単独で、または4時間250 nMのTorin1（INS + Torin1）と組み合わせた。連続的に栄養分を奪われた未処理の細胞（0.1％FBS）を対照として使用した。対応する細胞質ゾル抽出物を5〜50％ショ糖勾配上での遠心分離によって沈降させた。無料リボソームサブユニット（40Sおよび60S）、モノソーム（80S）と、ポリソーム画分中のリボソームの数が示されている。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> 図2。Pを使用して得られたゲノムワイドなデータolysomeプロファイリング高度に再現可能である。MCF7細胞を、 図1のように処理した。細胞質およびポリソーム関連RNA（&gt; 3リボソーム）は4つの独立した生物学的複製から抽出し、それらのゲノムワイドなmRNAレベルはGeneTitanアレイ（Affymetrix）を用いて決定した。 PCAは、得られるデータの再現性を評価した。 、RNAの原点（C =細胞質ゾル、P =ポリソーム関連）すべての処置のための最初の2のPCAコンポーネント（;; CTRL =コントロールイン=インスリンT1 =トリン1）も示されていると複製されます。同じ条件とRNA起源からの試料は、密接に高い再現性を示して配置されている。

リボソームはタンパク質合成の中心的な役割を果たしている。ショ糖密度勾配遠心分離によりポリリボソーム（ポリソーム）分画は、ゲノムワイドな規模での個々のmRNAの翻訳効率の直接測定を可能にする。さらに、この方法は、シャペロンおよびシグナル伝達分子としてのリボソーム及びポリソーム関連因子の生化学的分析のために使用することができる。

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

本実験の全体的な目的は、細胞内でのmRNA翻訳活性の変化を研究するために、翻訳中のリボソーム（ポリソーム）を単離することです。これは、第2ステップとして、増殖培地にシクロヘキシミドを添加してリボソームをmRNA上に固定し、リボソームの脱落（runoff）を防ぐことで達成されます。細胞からリボソームを抽出し、ショ糖密度勾配遠心法を用いて密度に基づいて分離することで、遊離リボソームサブユニット（40 sおよび60 s）、モノソーム、および翻訳中のリボソーム（ポリソーム）を定量および単離します。次に、プレリボソーム分画およびポリソーム分画におけるmRNAおよびタンパク質の存在量をそれぞれ分析するために、スクロース分画からRNAまたはタンパク質を抽出できます。その結果、mRNA翻訳の定量的および定性的な変化が明らかになり、これらはマイクロアレイや次世代RNAシーケンシングを用いてゲノムワイドなレベルで検討し、NoDaアルゴリズムを用いて分析することが可能です。ポリソームプロファイリング法は、ゲノムワイドなレベルでのmRNAの変化や翻訳のモニタリング、ならびにリボソームおよびポリソームへのタンパク質の結合など、転写後レベルでの遺伝子発現調節に関する主要な課題に取り組むために活用できます。当研究室のリサーチアソシエイトであるValentina Gandがこの手法を実演します。まず、脱イオン蒸留水を用いて60% w/vのスクロース溶液を100 mL調製し、次いでその溶液を0.22 µmフィルターでろ過します。次に、60%スクロース溶液を1 Xスクロースグラジエント緩衝液で希釈し、5%および50%のスクロース溶液をそれぞれ40 mL調製します。グラジエントユニットに付属のマーカーブロックを使用し、6本のpoly Amer超遠心管の半分まで液体が入る位置に印を付けます。次に、レイヤリングデバイスを使用して、チューブの半分まで5%sucrose溶液を加えます。続いて、2つの溶液の界面が半分まで達するまで、チューブの底に50%sucrose溶液を加えます。レートゾーナルキャップでチューブを密閉し、グラジエントメーカー上のチューブホルダーに設置します。グラジエントメーカーを作動させ、5%から50%の直線的な勾配を作成します。グラジエントメーカーはチューブを大きな傾斜角度で回転させ、数分以内に6つの直線勾配を形成します。実験当日、細胞のコンフルエンシーは約80%である必要があります。成長培地を用いて、100 µg/mLのcyclo hexaで細胞を処理し、37 °C、5% CO2条件下で5分間インキュベートします。100 µg/mLのcyclo hexaを含む氷冷PBS 10 mLで細胞を2回洗浄します。その後、氷冷PBS溶液をさらに5 mL加えます。細胞をスクレイパーで回収し、細胞懸濁液を50 mLチューブに移して、4 °C、200 ×gで5分間遠心分離します。その後、上清を捨て、細胞を425 µLの低張溶解バッファーで再懸濁します。次に、細胞懸濁液に10 mg/mL cyclo hexaを5 µL、1 M DTTを1 µL、および100 unitsのRNase inhibitorを加えます。その後、溶液を5秒間ボルテックスします。細胞懸濁液に10% Triton X-100を25 µL、10% 脱酸素コール酸ナトリウムを125 µL添加し、さらに5秒間ボルテックスします。次に、溶解物を4 °Cで16,000 ×gにて7分間遠心分離します。上清をあらかじめ冷却した新しい1.5 milliliterチューブに移し、定常状態のMR.mRNAレベルを測定するためのコントロールとして、ライセートの10%を保存します。各ライセートサンプルの260 nanometersにおけるODを測定し、低張ライシスバッファーを用いて最終容量が500 microlitersとなるようにODを揃えます。ショ糖密度勾配の上部から500 microlitersを取り除き、調整したライセートサンプルを各勾配の上部にロードします。次に、各グラジエントチューブの重量を量り、バランスを調整します。チューブをSW 41 TIローターにセットし、超遠心機をローブレーキモードに設定します。その後、サンプルを4 °Cで222,228 ×g、2時間遠心分離します。超遠心分離が完了したら、慎重にローターからグラジエントチューブを取り出し、氷上に置きます。まず、フラクションコレクターに2 mL回収チューブをセットします。次に、分画回収を開始する30分前に、コンピューター、ポンプ、UV検出器、およびフラクションコレクターの電源を入れます。ポンプの流速を3 mL/minに設定し、チェイシング溶液でチューブを満たしてシステム内の空気を除去します。針先から液滴が出るまで、チューブ内にチェイシング溶液を流します。分析ソフトウェアを起動します。次に、感度を±10 milli electron voltsに、タイムベースを100 secondsに設定します。超遠心管をUV検出器に設置し、チューブが直交位置にあることを確認してください。続いて、チューブホルダーの下にあるノブを回して、ニードルでチューブを貫通させます。ポンプの流量を1.5 milliliters per minuteに調整し、分画コレクターを30秒ごとに分画するように設定します。これにより、1分画あたり750 microlitersとなります。ポンプをリモートポジションに設定します。その後、ポンプと分画コレクターを起動し、同時にDAQトレーサーによる記録を開始します。チェイシング溶液の最初の一滴が回収チューブに落ちた時点で、ポンプとDAQトレーサーを停止させます。同時に、回収した各フラクションに750 µLのトリオールを加え、フラッシュします。その後、フラクションを液体窒素中で凍結させます。次に、製造元の指示に従って、サンプルからポリソーム結合RNAおよび細胞質RNAを単離します。インスリンで処理したC7乳がん細胞の翻訳活性を評価するために、ポリソーム分画を用いました。対照細胞およびmTOR阻害剤であるTorin 1で処理した細胞と比較して、インスリン処理によりポリソームの割合が増加しました。この結果は、インスリンがmc seven細胞における全般的な翻訳開始率を刺激することを示しています。インスリン実験の4回の独立した試行の結果を用いて、このポリソーム分画法の再現性を評価しました。同一の処理条件およびRNA由来のサンプルがこのグラフ上で近接して配置されており、高い再現性が示されています。このビデオを視聴することで、細胞の溶解、スクロースの調製、勾配の作成、そして最終的な分画リボソームの回収方法について十分に理解できるはずです。このプロトコルを用いることで、転写後のレベルでの遺伝子発現を解析することが可能になります。

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Biology

生物学

この記事では、真核細胞からリボソームを翻訳するの抽出のためのプロトコルについて説明します。解凍したら、リボソームが異なるリボソーム集団を分析できるようにショ糖密度勾配分画によってmonosomesとpolyribosomesに分かれています。このように、このメソッドは、翻訳の調節を調べるためのゴールドスタンダードです。...

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

ここでは、ストレス条件に応答する真核細胞のmRNA翻訳の開始の変化を分析するための方法を記載している。このメソッドは、非翻訳リボソームからリボソームを翻訳するショ糖勾配に速度の分離に基づいています。...

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

このプロトコルは、in vivoでのCNSサンプルのtranslatomeを研究するためにポリリボソーム分画の本質的な変更を示している。これは、結合したRNA画分をリボソームへの全RNAの単離と比較を通じて翻訳と転写制御の全体的な評価が可能になります。...

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

細胞がストレスに適応する能力は、彼らの生存にとって非常に重要です。mRNA翻訳の制御は、プロテオームの迅速な制御を可能にする適応戦略の1つです。ここでは、ストレス条件下で選択的に翻訳される特定のmRNAを同定するための標準化されたポリソームプロファイリングプロトコルを提供します。...

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

Translating Ribosome Affinity Purification...

のレア細胞集団からのTRAP-RC、翻訳リボソームアフィニティー精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

このプロトコルは、結合したリボソームの数に基づいて植物組織から転写物を抽出し、分画する簡単な方法を説明しています。これにより、翻訳活性の全体的な推定と、特定のmRNAの翻訳状態の決定が可能になります。...

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

ポリソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、タンパク質合成時に個々 の mRNAs のトランスクリプトーム Mrna...

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

ここでは、リボタグシステムを用いた成人男性マウス生殖細胞の選択集団からリボソームおよび関連RNAの免疫沈降について説明する。戦略的な繁殖と慎重な免疫沈降は、細菌細胞の翻訳を知らせ、変異型のメカニズムに関する洞察を提供するクリーンで再現可能な結果をもたらします。...

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

哺乳類の脳の発達には、翻訳のレベルでの遺伝子発現の適切な制御が必要です。ここでは、発達中の脳におけるmRNAの翻訳状態を評価するための、組み立て易いショ糖勾配および分画プラットフォームを備えたポリソームプロファイリングシステムについて説明する。...

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。...

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

ここで紹介するプロトコールは、ショ糖密度勾配遠心分離により 、シロイヌナズナからトランス ラトーム、リボソームに関連するmRNAを非ポリソームおよびポリソームRNAに単離するためのポリソームプロファイリングを含みます。この方法は、熱ストレスを受けた...

ポリソームプロファイルを用いた熱ストレス下での翻訳効率試験

学ぶポリソーム分画法による哺乳類細胞の翻訳リボソーム分離とmRNA翻訳活性解析。シクロヘキシミド処理と蔗糖密度勾配遠心分離を用いて、ゲノム規模での遺伝子発現制御を研究します。

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

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