神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

この手順の全体的な目標は、ニューロンシナプス伝達の変化に応答して、アストロサイトGQGタンパク質共役受容体シグナル伝達の長期的な増加または減少を誘導することです。これは、最初に野生型マウスから急性海馬スライスを準備することによって達成されます。2番目のステップは、スライスにSulur Rumine 1 0 1を塗布して、アストロサイトを標識することです。

次に、急性海馬切片を4〜6時間テトロダトキシンでインキュベートしてニューロン活動電位を遮断するか、または通常の人工脳脊髄液中でインキュベートします。最後のステップは、背圧負荷プロトコルを使用して、カルシウムインジケーターを使用してスライスの層半径原子に星状細胞をロードすることです。最終的に、共焦点顕微鏡法は、自発的および誘発されたアストロサイトカルシウム一過性の変化を記録することにより、アストロサイトGQ GPCRシグナル伝達活性の変化を示すために使用されます。

この方法は、アストロサイト受容体の可塑性とTQG PCRシグナル伝達の関連する変化に関する洞察を提供します。また、ニューロンの代謝型受容体の恒常性維持可塑性を測定するためにも使用できます。この手順を開始するには、ビブラートをオンにし、ドレナージが閉じていることを確認します。

次に、カッティングチャンバーをビブラートに固定し、カッティングチャンバーの周囲に氷を詰めます。次に、ダブルエッジカミソリの刃から工場のグリースを70%エタノールに5分間浸し、次に二重蒸留水ですすいで取り除きます。丁寧に半分に切り、半分をカッティングブロックに取り付けて脳スライスの準備をします。

マウスの脳を得た後、冷却と酸素化のためのより多くの表面積を可能にするために、冷やしたかみそりの刃でペトリ皿で二等分しました。二等分された半球を氷のように冷たいスライスバッファーに2〜3分間置いて、完全に冷たく、より固くなります。その後、ビブラート接着剤のプラットフォームにクレイジー接着剤の薄い層を塗布します。これは、プラットフォームに両方の半球です。

切断面を下にして側面を上にし、嗅球を前に向けて、プラットフォームを切断チャンバーに固定します。カッティングチャンバーに氷冷した十分に酸素化されたスライシングバッファーを充填します。ビブラートを使用して厚さ300ミクロンのパラ矢状スライスを準備しながら、カッティングチャンバーに酸素を供給し続けます スライスした後、氷冷の十分に酸素化されたスライスバッファーで、各パラサジタルスライスから海馬と隣接するエンドリン皮質を解剖します。

トランスファーピペットをガラスの牧草地ピペットの長い先端から折らせ、壊れた部分にピペットバルブをのせます。海馬スライスを摂氏35度の水浴のインキュベーションチャンバーに一度に1つずつ移します。視認性を確保するため、これらの手順は摂氏35度のウォーターバスの外側にあるインキュベーションチャンバーで示されていることに注意してください。

海馬スライスを、35度の水浴中で低カルシウムA CSFで希釈した1マイクロモルSR 1 0 1で20分間インキュベートします。次に、それらをSR 1 0 1を含まない低カルシウムA CSFにさらに10分間移します。温かい回復。

その後、ウォームインキュベーションの残りの15分間、スライスをコントロールまたは実験用A CSFに移します。45分間の回収後、インキュベーションチャンバーを摂氏35度の水浴からベンチトップに慎重に移動させ、スライスを室温で合計3時間インキュベートし続けることで、ボーラスローディングプロトコルを開始します。この手順では、色素溶液で満たされたときに約1.3メガオームの抵抗に引っ張られたホウケイ酸ガラスキャピラリーからピペットを準備します。

次に、海馬スライスを記録チャンバーに入れ、酸素化A CSFを毎分1.5ミリリットルで連続的に灌流し、健康なCA 1パラメタル細胞の割合が高く、表面が滑らかに見える海馬スライスのみを使用し、不健康に見える場合は破棄します。微分干渉コントラスト光学系を使用して、スライス表面の40〜70ミクロン下の地層ラジウムにアストロサイトの適切なフィールドを見つけます。次に、D溶液をあらかじめロードしたガラスピペットを標準のパッチクランプマイクロ電極ホルダーに入れます。

ピペットをスライスの表面に向け、フィールドの上のスライスの表面まで下げます。ピペットに陽圧を加えて、色素の排出を開始します。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットをスライス表面から約40ミクロン下までゆっくりと下げ、色素を約45〜60秒間排出します。

次に、ピペットをさらに35ミクロン下げ、色素を約45〜60秒間排出します。その後、ピペットチップをスライスからゆっくりと引っ込めて、多数のアストロサイトが色素を取り込むようにします。通常、2番目の染料ボーラスを少し離れた場所に注入すると便利です。

これを行うには、ピペットをスライスの表面に戻し、ピペットが詰まっていないことを確認します。次に、ピペットを最初の注入部位から約80〜100ミクロン離して、この部位で層ラジウムリピートボーラス注入を行い、アストロサイトをイメージングする前に30〜45分待って、イメージング用の共焦点顕微鏡をセットアップします。スライスの制限 レーザー光への曝露は、高い曝露が染料の漂白や光毒性につながる可能性があるため、最も重要です。

各レーザーのデフォルト値を、高光倍率設定、1 x ゲイン、0.5% レーザー出力パワー時間に設定します。次に、1.5倍ズームを適用して、アストロサイトのプロセスをより適切に視覚化します。次に、フィールド解像度を 512 x 512 ピクセルに設定します。

その後、スキャン速度を可能な限り高速 (スキャンあたり約 1.2 秒) に設定します。一方向スキャン モードを使用して、488 ナノメートル レーザーの場合は 503 ナノメートルから 548 ナノメートル、559 ナノメートル レーザーの場合は 624 ナノメートルから 724 ナノメートルのバンドパス フィルタを使用して発光スペクトルを収集します。次に、カルシウム色素をロードした細胞をアストロサイトとして、SR 1 0 1 co標識を視覚化して同一性を確認します。

559ナノメートルレーザーを使用して、アストロサイトのカルシウム活性を記録します。まず、画像取得ソフトウェアを使用して、細胞内の関心領域(この場合はアストロサイト細胞体)にボックスを描きます。次に、参照として背景の上に1つのボックスを描きます。

ROIから自発的なカルシウム活性の10分間のベースライン記録を取得します。その後、目的のアゴニストを順次増加させる濃度で適用し、適用の間に最低5分空けて、受容体の脱感作の可能性を減らします。.記録の最後に、他のアストロサイトGQのアゴニストのカクテル、InpactアストロサイトGQ GPCRシグナル伝達経路のポジティブコントロールとしてGPCRを適用します。

カルシウム記録が完了したら、488ナノメートルと559ナノメートルのレーザーで静止画を撮影し、後でアストロサイトの同一性とROIの配置を確認します。これは、オレゴングリーンBAFTA 1:00 AMカルシウムインジケーター色素およびSR 1 0 1を取り込んだ制御条件またはTTXでインキュベートされた記録フィールド内の細胞の代表的な画像です。両方の信号のオーバーレイは、カルシウムインジケーターボックスがロードされたアストロサイトが個々のアストロサイト上に描画され、アストロサイトのカルシウム活性を監視するためにグリーンチャネルで経時的な蛍光強度を記録することを示しています。

TTXでインキュベートされたアストロサイトのカルシウム活性の記録ボックスからのサンプルトレースは、応答パターンの変化によって証明されるように、自発的な活性の増加とより強力なグループ1のMGL Rカルシウム応答の誘発を示しています。シングルピーク、マルチピーク、プラトーカルシウムトランジェントの例が示されており、ここでは、ニューロンを脱分極させ、5.0ミリモルカリウムA CSFとインキュベートした2.5ミリモルカリウムコントロールA CSFアストロサイトと比較して、ニューロンを脱分極させ、基礎発火率を増加させるスライスからのアストロサイトカルシウム記録の代表的な痕跡を示します。 自発的な体細胞カルシウム過渡現象が少なく、DHPGの誘発応答が弱いことは、コントロールでインキュベートされたアストロサイトと比較して減少しました。CSF Astrocyteカルシウムイメージングは、Gタンパク質共役受容体シグナル伝達の変化を機能的に読み出すことができます。

しかし、これらの変化がシグナル伝達経路のどこで起こっているのかを特定することはできません。したがって、補完的なアプローチは、緑色蛍光タンパク質を発現するアストロサイトに対して蛍光活性化セルソーティングまたはフローサイトメトリーを使用し、次に目的のGタンパク質共役受容体に抗体を適用し、ウェスタンブロットを実行して受容体発現レベルの変化を探すことです。このビデオを見た後、アストロサイトのカルシウムイベントを自発的に記録し、アグネスがアストロサイトのカルシウムイベントを誘発することにより、ニューロンのシナプス伝達の変化に続いて、アストロサイトtqt PCR活性のスケーリングを測定する方法についてよく理解できるはずです。