における発作様活性を分析し、移動のための低コストの方法ショウジョウバエ

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの自発運動または発作行動の変化を特定することです。これは、最初に麻酔を使用してハエを個々のバイアルに分離することによって達成されます。次に、単純なWebカメラを使用してハエの動きを記録します。

その後、データを画像Jにインポートして解析を開始します。最後に、カスタムメイドのフライ分析ソフトウェアを使用して、記録期間中の移動距離、速度、および持続時間を決定します。最終的に、このアッセイは、遺伝的および薬理学的操作に関連する自発運動または発作行動の変化を示すことができます。

さて、これから説明するこの低コストの記録技術は、ショウジョウバエの発作行動と移動運動の両方を分析するために使用できます。特に、これらのハエの発作行動を変更する遺伝的および薬理学的操作を特定するために使用しました。しかし、今日、私の研究室の学部生の研究助手であるクリス・バーナーが、この手法を実演します まず、運動アッセイと発作アッセイ中にハエを記録するウェブカメラを設定します。

カメラが配置されたら、便利なVIソフトウェアプログラムを開きます。録画設定を調整するには、キャプチャタブの下のタイムラプス画像オプションを選択し、新しいウィンドウが開いたら、キャプチャデバイスとしてWebカメラを選択します。ほとんどの実験では、6 40 x 4 80のビデオフレームサイズで十分です 圧縮オプションでは、Intel IUVコーデックを選択し、アッセイに応じてフレームあたりの秒数を設定します。

[詳細設定]タブで、キャプチャごとにビットマップ画像ファイルを作成し、記録された画像スタックをプログラムに保存するフォルダーを選択します。次に、死んだハエを一枚の紙の上に置きます。ビデオ設定ボックスをクリックし、デバイス設定タブで、明るい白い背景が暗いフライとはっきりと対照的になるまで設定を調整します。

開始ボタンをクリックして録音を開始します。録画期間が終了したら、停止ボタンをクリックします。これで、画像スタックは、自発運動活動アッセイを開始するために選択したフォルダーにあるはずです。

ハエを綿栓で蓋をした個々のバイアルに移します。ハエを20〜30分間邪魔されずに座らせてから、先に進みます。この時間の後、テストするフライをバイアルから取り出し、ペトリ皿カバーの下で軽くたたきます。

カバーには小さなスリットが含まれている必要があります 空気の流れ フライを下に配置 web前にセットアップしたWebカム。準備ができたら、スタートを押して自発運動の記録を開始します。発作アッセイの最初のステップは、2日齢の発作に敏感なハエ(標準的な培地または試験対象の薬剤と混合された培地)に餌を与えることです。

2日間の給餌後、個々の空のバイアルを優しく叩いてハエを移し、バイアルを綿栓でキャップします。観察する前に、ハエを20分間邪魔されずに座らせてください。準備ができたら、バイアルを実験室のボルテックスでボルテックスするか、最高設定を使用して10秒間ボルテック

すぐに、固定されたハエをウェブカメラの真下の白い紙の上に置きます。所定の位置に配置されたら、録音を開始します。これは活動を飛ばします。

ハエは、麻痺の期間が散在する急速な非協調的な動きをします。ハエが立ち直ったら、録音は終了します。データの解析を開始するには、無料の画像処理ソフトウェアimageJを一度開きます。

目的の画像スタックをインポートするには、最初に[ファイル]タブをクリックし、[インポート]を選択します。そして最後に、画像シーケンスです。画像スタックを含むフォルダーを選択し、画像を開きます。

[シーケンス オプション] ダイアログ ボックスが開いたら、名前を数値で並べ替えてから選択します。大丈夫です。次に、画像タブを選択し、値の種類を 8 ビットに設定します。画像タブをもう一度クリックし、調整オプションの下のしきい値を選択します。

これにより、すべての画像のしきい値が設定され、各画像が白い背景で構成され、ハエが黒い点に変換されます。これにより、カットオフポイントを調整できるしきい値ダイアログボックスも開きます。画像をスキャンして、余分な黒い点が含まれているかどうか、またはスポットが欠落していないかどうかを確認します。

必要に応じて、しきい値を調整して問題を軽減します。調整が完了したら、しきい値ダイアログボックスで [適用] を選択します。[マスクに変換] ダイアログ ボックスが開いたら、[OK] をクリックして画像スタックのしきい値を設定します。

フライの動きをピクセル単位で測定するには、[プラグイン]タブでマルチトラッカープラグインを選択します。オブジェクトトラッカーダイアログボックスが表示されたら、表示された4つのオプションをすべてクリックして選択します。大丈夫です。その後、マルチトラッカープラグインが黒に座標をアタッチします。

を各スライスに含め、これらを結果ウィンドウにリストし、合計長 (ピクセル単位) もリストします。パスウィンドウには、ハエがたどったパスがグラフィカルに表示されます。結果ウィンドウから X 座標と Y 座標のリストをコピーし、データを Excel スプレッドシートに貼り付けます。

スタック内のスライドに黒の文字がない場合、マルチトラッカープログラムはそのスライドで停止します。これが発生した場合は、スタックのしきい値を変更して、フライが黒として登録されるようにします。

問題のスライドで。パスの長さをピクセルからセンチメートルに変換するには、空白の白い紙に既知の距離を空けて配置された 2 つのドットの画像を撮ります。2 つのドットの XY ピクセル座標を決定し、この情報を使用して 1 センチメートルに対応するピクセル数を決定し、より正確な結果を得ることができます。

XY座標をカスタムメイドのフライ分析プログラムにインポートして、画像からノイズを除去します。開いたら、各遺伝子型または治療のデータを別々のスプレッドシートにインポートします。次に、サマリーシートタブを選択し、[クリックミー]ボタンをクリックします。

解析の種類に応じてしきい値を選択し、[OK]をクリックすると、プログラムが移動の速度、時間、および距離を計算します。これらの代表的な経路は、メトホルミン治療の有無にかかわらず、突然変異ハエで発作様活性を示します。発作活性は、試験した2つの変異体での治療により減少しました。.

メトホルミンは、発作アッセイ中の移動距離と発作様活動の総持続時間の両方を大幅に短縮しました。.対照的に、これらの個々の自発運動経路の平均速度には変化がありませんでした。野生型のCSフライの経路は、円形のアリーナの周辺に集中しています。

一方、A変異型BSSフライの経路は同じ濃度を示していますが、全体的に動きが少なくなっています。新しい環境での移動性をテストしたところ、BSS変異体はCSフライと比較して経路長が大幅に短縮されました。このアッセイでは、自発運動アッセイ中にCSフライが探索している間の移動速度の変化も検出されました。

BSSフライは、いくつかの活動のバーストを除いて、試験全体を通して比較的不活性なままでした。この手法でこれらの行動アッセイのいずれかを実行する際に留意すべき最も重要なことの1つは、録音を行う前にハエに麻酔をかけないようにすることです。麻酔は発作行動と運動行動の両方に影響を及ぼし、結果を大幅に変える可能性があることがわかりました。