大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと

本手順の目的は、浸潤腫瘍前縁における悪性上皮細胞とがん関連基質細胞の界面における特有の生物学的特性を明らかにすることである。まず、結腸植え込み物から初代線維芽細胞培養を確立し、次いで、初代結腸線維芽細胞と培養大腸がん細胞を用いて組織型共培養モデルを構築することでこれを達成する。

次に、器官培養モデルを固定してホルマリン切片とし、メンブレン貼付スライドに載せてクリスタルバイオレットで染色します。最終ステップとして、浸潤腫瘍細胞を非浸潤腫瘍細胞および癌関連ストローマ細胞から分離するために、レーザーマイクロダイセクションを行います。最終的に、分子プロファイリング技術を用いて、浸潤および非浸潤腫瘍細胞、ならびに周囲の腫瘍微小環境におけるストローマ細胞の生物学的特性を解析することができます。

大腸がんの三次元臓器様共培養モデルにおいて、浸潤細胞が非浸潤細胞とはいかに明確に区別できるかに気づいたことが、本手法を着想したきっかけとなりました。まず、手術室から正常なヒト結腸粘膜組織のサンプルを直接採取し、研究室へ搬送します。組織片を直径10 centimeterの組織培養ディッシュの中央に配置し、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾンの補充したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で、培養物を3回洗浄します。

滅菌したピンセットとメスを用いて、最後の洗浄後に吸引は行わず、組織を細かく切断します。次に、メスの刃で描いた十字の中心に、切断した組織をそれぞれ配置します。12ウェルプレート内で、組織が培養皿に接着するように、メスで組織の上を静かに揺らします。

組織が浮き上がらない程度に完全に浸るよう、750 µLの初代線維芽細胞増殖培地に検体を入れます。その後、検体を37 °C、5〜10% CO2インキュベーターに入れ、5日間培養します。約7日後から、組織の端から線維芽細胞がゆっくりと成長し始めます。

これは約3〜4週間後に、より明確に観察できるようになります。線維芽細胞が十分に増殖している場合は、細胞が剥離した後に各ウェルに750 µLのtrypsinを加え、それらを回収してT 25組織培養フラスコに移し、線維芽細胞含有オルガノタイプ・ゲルを作成します。まず、サプリメント添加dmmを用いて、ゲル1つあたり500,000個の細胞を含む線維芽細胞懸濁液を調製します。

テキストプロトコルに記載された比率に従い、9個分のゲル（1個あたり1 mL）を氷上で調製します。計10 mLを準備し、気泡が入らないように静かに混ぜ合わせます。次に、24ウェルプレートの各ウェルに1 mLずつ加え、加湿条件下、37 °Cで1時間インキュベートします。

1時間後にゲルを凝固させるため、ゲルの上に補完済みDMEMを1 mL加え、一晩インキュベーターに戻します。翌日、ゲルの上の培地を吸引し、500,000個の大腸がん上皮細胞を含む培地1 mLを、ゲルコーティングしたナイロンシート上に播種します。

滅菌鉗子を用いて、1.5 cm × 1.5 cmの滅菌オートクレーブ済みナイロンシートをあらかじめ準備します。必要数のナイロンシートを10 cmの培養皿に入れます。テキストプロトコルに従って氷上でゲル混合液を調製し、溶液が中和されたことを示すピンク色に変わるまで、0.1 M 水酸化ナトリウムをゲル混合液に加えます。

次に、この溶液を各ナイロンシートに250 µLずつ加えます。その後、ゲルを凝固させるため、5% CO2の加湿条件下、37 °Cで30分間インキュベートします。続いて、PBSで調製した1%グルタルアルデヒド溶液を、10 cm培養ディッシュに10 mLずつ加えます。

ゲルが凝固した後、4 °Cで1時間インキュベートし、次にナイロンシートをPBSで3回、サプリメント添加dmeで1回洗浄します。シートを同バッファー中で4 °Cにて一晩インキュベートし、ステンレス鋼シートを三脚状に折り曲げて作製し滅菌した浸潤用足場グリッド（スチールグリッド）上に器官型ゲルを載せます。その後、滅菌済みのピンセットとエタノールを用いて、6ウェルプレートの各ウェルにスチールグリッドを配置します。

コラーゲン側を上にして、ゲルコーティングしたナイロンシートを各グリッドに配置します。滅菌しエタノール処理したスパチュラを用いて、24ウェルプレートから器官型ゲルをナイロンシート上へ慎重に転移させます。ナイロンシートが培地に接触し、かつ浸からない程度まで、サプリメント添加D memでウェルを満たします。

培地がオルガノタイプゲルに触れないようにしてください。5%CO2加湿雰囲気下、37°Cで14日間インキュベートします。2日ごとに培地を交換してください。

ナイロンシートを含む臓器培養組織全体をウェルから取り出し、ラップフィルムの上に置きます。清潔な使い捨てメスを用いて臓器培養組織とナイロンシートを二等分し、両方の半分をホルムアルデヒドに24時間固定します。24時間後、室温でホルムアルデヒドを70% ethanolに置き換え、一晩静置した後、パラフィン埋込、切片作成、および染色を行い、レーザーマイクロダイセクションを実施します。

まず、厚さ10 micronの器官培養切片をメンブレン搭載スライドに作製します。本文のプロトコルに従って切片を処理した後、選択したプラットフォームを用いてレーザーマイクロダイセクションを行う準備をします。マイクロダイセクションを行う染色済み切片が載ったガラススライドを設置します。

顕微鏡ステージの上に、0.5 mLのマイクロ遠心チューブを回収カセットに伏せて装着し、マイクロダイセクションで回収する組織が直接入るチューブのキャップ内に、50 µLの細胞溶解バッファーを加えます。ジョイスティックを使用して目的の組織を特定し、ソフトウェアインターフェースを用いて染色された有機切片に注釈を付け、腫瘍浸潤先端でマイクロダイセクションを行う細胞をハイライトします。レーザーを照射させ、ハイライトされた部分を切り出すと同時に、マイクロダイセクションされた組織をマイクロ遠心チューブのキャップ内に送り込みます。

適切な方法でサンプルを処理し、目的の分析物を抽出します。ここでは、器官型ストローマに浸潤するSW 480大腸がん細胞のレーザーマイクロダイセクション画像を示します。大腸がん上皮細胞を強調するためにクリスタルバイオレットが使用されています。

レーザー切除を行う前に浸潤腫瘍島を定義し、切り出された断片を回収デバイスに転送します。非浸潤細胞およびストローマ細胞についても、同様の手法を用いて同定および分離を行います。3次元共培養系をmicroRNAプロファイリングにより解析し、浸潤腫瘍前縁の細胞と層状腫瘍領域の細胞との間で、差次的に発現しているmicroRNAを比較しました。

データは、総変化量およびデータ値の2倍以上の増減に基づいてソートされました。代表的な実験からの変化に基づき、浸潤縁細胞と非浸潤縁細胞におけるmicro RNA遺伝子の差有的発現を示しています。このビデオを視聴することで、解剖学的に適切な組織型モデルの構築方法と、さらなる研究のために個別の細胞集団を単離するためのレーザーマイクロダイセクションの使用方法について十分に理解できるはずです。驚きましたね。