Name: 大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと生体外線維芽細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶ レーザーマイクロディセクションを用いて大腸がんの侵襲性腫瘍微小環境における悪性上皮細胞と線維芽細胞の界面生物学を解析する方法です。オルガノタイプ共培養モデルと分子プロファイリング技術で細胞集団を分離し、がん進行メカニズムを解明します。

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結腸外植片からの初代線維芽細胞培養の1。設立<ol><li>外科手術室から直接、正常なヒト結腸粘膜組織のサンプルを得るし、PBS 7-10中に一時停止し、100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および0.25μg/ mlのファンギゾンを補った。 </li><li>研究室では、10cmの組織培養皿の中央に試料を置き、PBS /ペンストレプトマイシン/ファンギゾンで3回洗浄する。最後の洗浄の後に吸引しないでください。 </li><li>滅菌ピンセットやメスで、（約2mm）組織を小片にカットし、12ウェルプレート中のメスの刃を使用して描画十字の中心にそれぞれの作品を配置します。それが接着することができるように組織の上そっとメスを揺する。 </li><li> 750μlの培養中の検体は、一次線維芽細胞増殖培地submeべき（DMEM、20％ウシ胎児血清（FCS）、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および292μg/ mlのL-グルタミンを補充）フロートするためにそれを可能にすることなく、組織をRGE。 2日ごとに再給紙を除き、次の5日間にわたりプレートを邪魔しないようにします。 </li><li>次の5日間に線維芽細胞が徐々に組織の端から外に成長を開始します。約7日後に、これはより見えるようになります。後約3〜4週間、内外の成長に十分な線維芽細胞が存在する場合、各ウェルに750μlのトリプシンを追加します。細胞を、T-25組織培養フラスコに、プール、転移（5〜10分かかることがあります）取り外された後。 </li></ol> 2。器官の準備線維芽細胞を含浸させ、器官ゲルの調製： <ol><li> 10％FCSおよび292μg/ mlのL-グルタミンを補充したDMEM中の器官当たり5×10 5個の細胞を含む線維芽細胞懸濁液を調製する。 </li><li>以下の比率で、氷上器官ゲルを構成している。 <ul><li>ラットテールコラーゲンの7ボリューム：マトリゲルミックス（1:1） </li><li>フィルタリングさ10倍のDMEM 1ボリューム</li><li> FCSの1の体積</li><li> 5×10 5個の線維芽細胞を含む線維芽細胞懸濁液1容量 9ゲル（ゲルあたり1ミリリットル）のために10ミリリットルを用意し、気泡を避けるために、穏やかに混合。 </li></ul></li><li> 24ウェルプレートの各ウェルに1 mlを添加し、37℃で1時間インキュベート ゲルが設定できるように加湿した雰囲気の中でCと°。 1時間後、ゲルの上に1ミリリットルのDMEM（10％FCS）/供給過剰を追加し、一晩培養器に戻る。 </li><li>次の日、ゲルおよび5×10 5のCRC上皮細胞を含む培地のプレート1ミリリットルの上から吸引媒体。 </li></ol>ゲルコーティングされたナイロンシートの製造： <ol start="5"><li>事前に1.5センチメートル×1.5センチメートルを測定無菌、オートクレーブナイロンシートを準備します。 </li><li>滅菌ピンセットを用いて、10cmの培養皿（通常は4ナイロンシートを皿ごとに収容することができる）ナイロンシートの必要な数を配置する。 </li><li>次の順序で氷上ゲルを構成する（250μlの総ボリュームナイロンシートごとに必要となる）。 <ul><li>ラットテールコラーゲンの7容積</li><li>フィルタリングさ10倍のDMEM 1ボリューム</li><li> FCSの1の体積</li><li> 1体積のDMEM、10％FCS /グラット</li></ul></li><li>溶液が黄色の場合は、溶液がピンク色に変わるまで50μlのアリコートで0.1MのNaOHを加えることによって中和する。 </li><li>各ナイロンシートに、この溶液の250μlを加え、37℃でインキュベート °Cゲルが設定できるように30分間、5％CO 2の加湿雰囲気中。 </li><li> PBS中の1％グルタルアルデヒド溶液を構成しています。ゲルがセットされた後、各10cmの培養皿に10ミリリットルを加え、1時間4℃でインキュベートする。 </li><li>ウォッシュナイロンシートはPBSおよびDMEM中で1X（10％FCS）/グルタミン酸で3倍、4℃で、DMEM / Gluの中で一晩インキュベート</li></ol>侵入用スチールグリッド上に器官ゲルを上げる。 <ol start="12"><li>三脚の形成にステンレス鋼板を折り曲げて足場グリッドを事前に準備する。使用前にオートクレーブ。</li><li> 6ウェルプレートの各ウェルにスチールグリッドを配置し、エタノールで滅菌ピンセットを使用してください。 </li><li>各グリッド上に、コラーゲン側最上でゲルコーティングされたナイロンシートを置きます。 </li><li>慎重にエタノールで滅菌スパチュラを用いて上げたナイロンシートを24ウェルプレートからの器官のゲルを移す。 </li><li>ナイロンシートが媒体に接触しているが、水没しないまで、10％FCSを補充したDMEM、10％FCS /ウェルで供給過剰を埋める。媒体は器官ゲルに接触していないことを確認してください。 </li><li> 2日毎に培地を交換し、5％CO 2の加湿雰囲気中、37℃で14日間インキュベートする。 </li></ol> 3。器官固定<ol><li>井戸からナイロンシートを含む全器官を取り出して、ラップフィルム上に置きます。 </li><li>器官ときれいな使い捨てメスを用いてナイロンシートを二等分し、室温で24時間、ホルムアルデヒド中で両方の半分を修正。 </li><li> 70％のイーサンとホルムアルデヒドを交換してくださいオール24時間後と前に、パラフィンに包埋切片、および染色を一晩のままにしておきます。 </li></ol>侵略的マージンの4。レーザーマイクロダイセクション<ol><li>膜上10μmの厚さにセクションでは、スライドをマウントした。 </li><li> 1分間のキシレンを適用することにより脱パラフィン切片、次いでキシレンを除去し、さらに1分間、75％エタノールで固定する。 </li><li> 1分間0.125％クレシルバイオレット溶液でエタノールと汚れを取り除きます。クレバイオレットは、上皮細胞が強調表示され、間質から簡単に区別することを可能にする。 </li><li>クレシルバイオレットを除去し、100％エタノールでリンスする前にさらに1分間100％エタノールを加える。 30分間空気乾燥スライドを可能にします。 </li><li>選択したプラットフォーム（ 例えばライカASシステム）を用いたレーザーマイクロダイセクションを実施しています。 </li><li>顕微鏡ステージ上に下向き顕微解剖するために染色部をガラススライドを置きます。 </li><li>回収カセットに0.5ミリリットルマイクロチューブをマウントし、50μlを加える顕微解剖組織収集先となるキャップの細胞溶解緩衝液（ 例えば、DNA、RNAまたはタンパク質溶解緩衝液）。 </li><li>直視下、関心のある組織を同定するためにジョイスティックを使用して、ソフトウェア·インタフェースを使用して、腫瘍の浸潤先端部での顕微解剖するセルを強調表示する、染色された有機部に注釈を付ける。 </li><li>強調表示されたセクションを切り出し、マイクロチューブのキャップ内に顕微解剖した組織を推進する必要があり、どちらも、発射するレーザーを指示します。 </li><li>一旦十分な材料が収集され、収集カセットを取り出すマイクロ遠心チューブを閉じ、チューブの底に溶解緩衝液を描画するために穏やかに回す。 </li><li>マイクロダイセクションが完了するまで氷上にサンプルを置きます。適切な方法による処理サンプルは、目的の分析物を抽出する。 </li></ol>

<ol><li>Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-153+supports+colorectal+cancer+progression+via+pleiotropic+effects+that+enhance+invasion+and+chemotherapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance.</a> Cancer Res. , (2013).</li>
<li>Bullock, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+actions+of+miR-21+highlight+the+critical+role+of+deregulated+stromal+microRNAs+during+colorectal+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression.</a> Cell Death Dis. 20 (4), (2013).</li>
<li>Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+invasion+in+an+organotypic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring invasion in an organotypic model.</a> Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).</li>
<li>De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+myofibroblasts+are+drivers+of+invasive+cancer+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth.</a> Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).</li>
<li>Fries, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+fibroblast+heterogeneity+and+the+role+of+fibroblast+subpopulations+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis.</a> Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).</li>
<li>Moutasim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betel-derived+alkaloid+up-regulates+keratinocyte+alphavbeta6+integrin+expression+and+promotes+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis.</a> J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).</li>
<li>Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+roads+to+maturity%3A+microRNA+biogenesis+pathways+and+their+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation.</a> Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+miRNA+expression+patterns+using+total+RNA+extracted+from+matched+samples+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+cells+and+snap+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells.</a> BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).</li>
<li>Szafranska, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+molecular+characterization+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+microRNA+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling.</a> J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).</li>
</ol>

著者らは、利害の相反を開示していない。

ここでは、特に上皮細胞および間質細胞の3次元共培養構築物における転移性進行の最も初期の段階で癌関連間質に侵入する能力を獲得した腫瘍細胞を分離し、特性化する方法について説明します。 ex vivoでのヒト結腸繊維芽細胞を含有する合成基質と並置CRC上皮細胞からなる共培養モデルは3次元でCRC浸潤を研究するために使用した。 インビボ条件の模倣上皮細胞に置き換え、種々の解剖学的起源のex vivoでの線維芽細胞を用いて間質を構築することによって、他の癌のシナリオに適合させることができるこの生理学的に関連するシステム。 in vivoで結腸間質は、様々なセル画で複雑 ​​で動的な組織であるようにこのアプローチの1つの制限は、唯一の線維芽細胞を用いた間質コンパートメントの過度の単純化であるL成分。一例としては、原発腫瘍材料の大幅な量で存在しますが、このモデルには存在しない免疫由来細胞である。それにもかかわらず、（上皮内の個々の遺伝子および間質コンパートメントの発現またはノックダウン以上により）...

器官型共培養物は、必須の細胞外マトリックス成 ​​分1〜3を含むコラーゲンゲルにおける悪性上皮細胞および間質細胞を並置することによって3次元での生体内腫瘍微小環境を再構築するのを助ける組織工学モデルである。主に腫瘍浸潤を測定する方法として考えられ、organotypics インビボ動物モデルへの依存を低減し、そのような浸潤細胞が単分散状態2-4に人為的に強制されたトランスウェルアッセイのような他のインビトロ技術の欠点を回避する。線維芽細胞などのこれらのモデルにおける間質細胞の封入は、悪性の浸潤および転移3-4の調節における腫瘍微小環境の重要な役割を反映し、しかし、間質の表現型の異質性は、例えば、ある器官の生理的関連性を最大にするためにモデル、臓器の特定、解剖学的に正確なex vivoで可能な限り3,6線維芽細胞が含まれるべきである。 Organotypicsは、腫瘍細胞および間質細胞の間の相互作用を研究するための汎用プラットフォームであり、ますます化学的阻害剤および標的化遺伝子改変7,8の腫瘍浸潤に及ぼす影響を調べるために新規な方法で使用されている。浸潤性腫瘍マージンを研究することは、特にエキサイティングな見通しである。器官型モデルでは、確立された結腸直腸癌（CRC）細胞株は、典型的には、井戸重層上皮層を生成し、断面において、細胞外マトリックス（ECM）を浸潤する能力を獲得した細胞が容易に識別可能である。 インビボでの腫瘍および腫瘍関連間質細胞の確立マイクロ地形異質、レーザーマイクロダイセクションを使用して、これらの細胞を抽出し、分離して、それらを研究に照らして、大腸癌転移の起源に関する重要な生物学的な洞察を明らかにすることができるとどのようにそれがより効率的になることがあり対象とした。私N以下の方法論、組織サンプルを寄付し、すべての患者が書面によるインフォームドコンセントを提供し、研究は教育機関、地域研究倫理委員会によって承認された。

<table><tbody><tr><td>結腸直腸癌細胞株-例示 SW480</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-228</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>354265</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>ナイロン膜</td><td>メルクミリポア</td><td>VVLP01300</td><td></td></tr><tr><td>メタルグリッド</td><td>メッシュ会社</td><td>WSS20-A4</td><td>themeshcompany.com</td></tr><tr><td>レーザーマイクロダイセクションプラットフォーム</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>ライカ AS LMD</td><td></td></tr><tr><td>メンブレンマウントスライド</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クレシルバイオレット</td><td>メルク ミリポア</td><td>1052350025</td><td></td></tr></tbody></table>

大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと<em&gt;生体外</em&gt;線維芽細胞

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

大腸がんに侵入（CRC）細胞は、姉妹細胞から自由になる間質に浸透し、細胞外マトリックス（ECM）を改造する能力を獲得している。細胞のこの表現型が異なるグループの生物学を特徴づけることは、実質的に転移カスケード時に初期事象の我々の理解を向上させることができます。 腫瘍浸潤、悪性上皮と癌関連間質間の双方向の相互作用によって促進さ動的なプロセスである。腫瘍間質界面での細胞特異的応答を調べるために、我々は器官共培養し、レーザーマイクロダイセクション技術を組み合わせている。 線維芽細胞などのキーの間質成分が、がん上皮細胞と共培養3 - dimentioanallyである、器官のモデルは、近pHの検討が浸潤や癌間質の相互作用を可能にする、高度に操作可能な実験的なツールですysiological条件。 レーザーマイクロダイセクション（LMD）は、ミクロンレベルの精度で腫瘍組織内の様々な階層の外科解剖と抽出を伴う手法である。 ゲノム、トランスクリプトームおよびエピジェネティックなプロファイリングでこれらの技術を組み合わせることで、我々は、腫瘍細胞に侵入し、間質組織、周囲の分子特性をよく理解できるようにする、そうすることで、潜在的に、CRCにおける薬剤開発のための新規バイオマーカーと機会を明らかにすることを目指しています。

我々は、CRC細胞株及び間質細胞の複数の組み合わせに対して、上記の方法を適用した。ここで紹介する一つの例は、一次ヒトex vivoで結腸線維芽細胞と上皮SW480 CRC細胞株である。 3次元共培養物は、浸潤性腫瘍前線におけるセル間の差次的に発現されるmiRNAの比較のために顕微鏡およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ 図2）に供した（ 図1）は 、構成されており、マイクロRNA（miRNAの）プロファイリング（ 図3）によって分析される成層（非侵入）は、腫瘍のゾーンのもの。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51475/51475fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51475/51475fig1.jpg" /> 図...

合成からのレーザーマイクロダイセクション細胞や間質、組織工学大腸癌モデルの分子プロファイリングは、浸潤性前面に腫瘍細胞および癌関連の間質細胞との間の界面に特徴的な生物学を特徴付け、分析する新規かつ操作可能なアプローチを表しています。

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

本手順の目的は、浸潤腫瘍前縁における悪性上皮細胞とがん関連基質細胞の界面における特有の生物学的特性を明らかにすることである。まず、結腸植え込み物から初代線維芽細胞培養を確立し、次いで、初代結腸線維芽細胞と培養大腸がん細胞を用いて組織型共培養モデルを構築することでこれを達成する。次に、器官培養モデルを固定してホルマリン切片とし、メンブレン貼付スライドに載せてクリスタルバイオレットで染色します。最終ステップとして、浸潤腫瘍細胞を非浸潤腫瘍細胞および癌関連ストローマ細胞から分離するために、レーザーマイクロダイセクションを行います。最終的に、分子プロファイリング技術を用いて、浸潤および非浸潤腫瘍細胞、ならびに周囲の腫瘍微小環境におけるストローマ細胞の生物学的特性を解析することができます。大腸がんの三次元臓器様共培養モデルにおいて、浸潤細胞が非浸潤細胞とはいかに明確に区別できるかに気づいたことが、本手法を着想したきっかけとなりました。まず、手術室から正常なヒト結腸粘膜組織のサンプルを直接採取し、研究室へ搬送します。組織片を直径10 centimeterの組織培養ディッシュの中央に配置し、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾンの補充したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で、培養物を3回洗浄します。滅菌したピンセットとメスを用いて、最後の洗浄後に吸引は行わず、組織を細かく切断します。次に、メスの刃で描いた十字の中心に、切断した組織をそれぞれ配置します。12ウェルプレート内で、組織が培養皿に接着するように、メスで組織の上を静かに揺らします。組織が浮き上がらない程度に完全に浸るよう、750 µLの初代線維芽細胞増殖培地に検体を入れます。その後、検体を37 °C、5〜10% CO2インキュベーターに入れ、5日間培養します。約7日後から、組織の端から線維芽細胞がゆっくりと成長し始めます。これは約3〜4週間後に、より明確に観察できるようになります。線維芽細胞が十分に増殖している場合は、細胞が剥離した後に各ウェルに750 µLのtrypsinを加え、それらを回収してT 25組織培養フラスコに移し、線維芽細胞含有オルガノタイプ・ゲルを作成します。まず、サプリメント添加dmmを用いて、ゲル1つあたり500,000個の細胞を含む線維芽細胞懸濁液を調製します。テキストプロトコルに記載された比率に従い、9個分のゲル（1個あたり1 mL）を氷上で調製します。計10 mLを準備し、気泡が入らないように静かに混ぜ合わせます。次に、24ウェルプレートの各ウェルに1 mLずつ加え、加湿条件下、37 °Cで1時間インキュベートします。1時間後にゲルを凝固させるため、ゲルの上に補完済みDMEMを1 mL加え、一晩インキュベーターに戻します。翌日、ゲルの上の培地を吸引し、500,000個の大腸がん上皮細胞を含む培地1 mLを、ゲルコーティングしたナイロンシート上に播種します。滅菌鉗子を用いて、1.5 cm × 1.5 cmの滅菌オートクレーブ済みナイロンシートをあらかじめ準備します。必要数のナイロンシートを10 cmの培養皿に入れます。テキストプロトコルに従って氷上でゲル混合液を調製し、溶液が中和されたことを示すピンク色に変わるまで、0.1 M 水酸化ナトリウムをゲル混合液に加えます。次に、この溶液を各ナイロンシートに250 µLずつ加えます。その後、ゲルを凝固させるため、5% CO2の加湿条件下、37 °Cで30分間インキュベートします。続いて、PBSで調製した1%グルタルアルデヒド溶液を、10 cm培養ディッシュに10 mLずつ加えます。ゲルが凝固した後、4 °Cで1時間インキュベートし、次にナイロンシートをPBSで3回、サプリメント添加dmeで1回洗浄します。シートを同バッファー中で4 °Cにて一晩インキュベートし、ステンレス鋼シートを三脚状に折り曲げて作製し滅菌した浸潤用足場グリッド（スチールグリッド）上に器官型ゲルを載せます。その後、滅菌済みのピンセットとエタノールを用いて、6ウェルプレートの各ウェルにスチールグリッドを配置します。コラーゲン側を上にして、ゲルコーティングしたナイロンシートを各グリッドに配置します。滅菌しエタノール処理したスパチュラを用いて、24ウェルプレートから器官型ゲルをナイロンシート上へ慎重に転移させます。ナイロンシートが培地に接触し、かつ浸からない程度まで、サプリメント添加D memでウェルを満たします。培地がオルガノタイプゲルに触れないようにしてください。5%CO2加湿雰囲気下、37°Cで14日間インキュベートします。2日ごとに培地を交換してください。ナイロンシートを含む臓器培養組織全体をウェルから取り出し、ラップフィルムの上に置きます。清潔な使い捨てメスを用いて臓器培養組織とナイロンシートを二等分し、両方の半分をホルムアルデヒドに24時間固定します。24時間後、室温でホルムアルデヒドを70% ethanolに置き換え、一晩静置した後、パラフィン埋込、切片作成、および染色を行い、レーザーマイクロダイセクションを実施します。まず、厚さ10 micronの器官培養切片をメンブレン搭載スライドに作製します。本文のプロトコルに従って切片を処理した後、選択したプラットフォームを用いてレーザーマイクロダイセクションを行う準備をします。マイクロダイセクションを行う染色済み切片が載ったガラススライドを設置します。顕微鏡ステージの上に、0.5 mLのマイクロ遠心チューブを回収カセットに伏せて装着し、マイクロダイセクションで回収する組織が直接入るチューブのキャップ内に、50 µLの細胞溶解バッファーを加えます。ジョイスティックを使用して目的の組織を特定し、ソフトウェアインターフェースを用いて染色された有機切片に注釈を付け、腫瘍浸潤先端でマイクロダイセクションを行う細胞をハイライトします。レーザーを照射させ、ハイライトされた部分を切り出すと同時に、マイクロダイセクションされた組織をマイクロ遠心チューブのキャップ内に送り込みます。適切な方法でサンプルを処理し、目的の分析物を抽出します。ここでは、器官型ストローマに浸潤するSW 480大腸がん細胞のレーザーマイクロダイセクション画像を示します。大腸がん上皮細胞を強調するためにクリスタルバイオレットが使用されています。レーザー切除を行う前に浸潤腫瘍島を定義し、切り出された断片を回収デバイスに転送します。非浸潤細胞およびストローマ細胞についても、同様の手法を用いて同定および分離を行います。3次元共培養系をmicroRNAプロファイリングにより解析し、浸潤腫瘍前縁の細胞と層状腫瘍領域の細胞との間で、差次的に発現しているmicroRNAを比較しました。データは、総変化量およびデータ値の2倍以上の増減に基づいてソートされました。代表的な実験からの変化に基づき、浸潤縁細胞と非浸潤縁細胞におけるmicro RNA遺伝子の差有的発現を示しています。このビデオを視聴することで、解剖学的に適切な組織型モデルの構築方法と、さらなる研究のために個別の細胞集団を単離するためのレーザーマイクロダイセクションの使用方法について十分に理解できるはずです。驚きましたね。

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我々は、その後、表面抗原（DotScan...

抗体マイクロアレイと蛍光多重を用いた大腸癌の細胞表面タンパク質のプロファイリング

我々は侵襲的な表現型への微小環境に影響を与える進行中の乳房の腫瘍細胞と他の細胞間の相互作用をリアルタイムでライブセルイメージングのための3D共培養モデルを開発しました。これらのモデルは、パラクリン誘起分解、ケモカイン/サイトカインと侵襲性に関与するキナーゼ経路を標的とする薬剤の臨床画面として使用できます。...

腫瘍の4DライブセルイメージングのためのMAMEモデル：微小環境の相互作用に影響を与える悪性進行

このビデオでは、3Dオルガノタイプ共培養モデルのレーザー解剖をミクロン単位の精度で説明しています。3D器官型モデルでは、線維芽細胞などの間質成分をがん上皮細胞と3次元共培養します。3Dモデルは、浸潤とがん-間質の相互作用を生理学的に近い条件で研究できるようにする実験ツールとして機能します。...

レーザーマイクロダイセクション:3D器官型培養モデルから浸潤する結腸直腸癌細胞を分離する技術

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この資料は、乳癌細胞の浸潤を定量化するための3次元（3D）のアッセイの使用のための詳細な方法論を提供する。具体的には、細胞が侵入したときに発生する膜の完全性の喪失を検査するためにこのようなアッセイ、定量化、およびデータ分析だけでなく、メソッドを設定するために必要な手順を説明します。...

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私たちは、酸素と栄養素を送達するために灌流バイオリアクターシステムを使用して培養できる3D乳がん代理を生成する方法を示します。成長後、代理母体を固定し、目的のパラメータの評価のためにパラフィンに加工します。そのようなパラメータの1つであるセル密度の評価について説明します。...

の調製と分析<em&gt;インビトロ</em&gt;三次元乳癌サロゲート

ここでは、乳癌、がん細胞同様単球とコラーゲン分解、免疫細胞の動員、セルなど成果の直接的/間接的相互作用の研究としての形態を分析する三次元培養法について述べる侵略、および炎症の癌関連のプロモーション。...

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このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。...

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

このプロトコルは、Caco2結腸腺癌細胞から3次元スフェロイドを生成し、増殖させる新規、堅牢、再現性培養システムを提示する。この結果は、化学療法への応答を含む癌幹細胞生物学を研究するためのこのアプローチの適切性に関する最初の概念実証を提供する。...

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

がんの転移を研究するためには、ヘテロセルのクロストークを捉える3Dがんモデルが急務となっています。私たちの研究は、侵入と細胞空間分布の研究に使用できる足場および足場のない環境でのヘテロ多細胞間質-上皮の生成を示しています。...

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

学ぶ レーザーマイクロディセクションを用いて大腸がんの侵襲性腫瘍微小環境における悪性上皮細胞と線維芽細胞の界面生物学を解析する方法です。オルガノタイプ共培養モデルと分子プロファイリング技術で細胞集団を分離し、がん進行メカニズムを解明します。

大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと

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