慢性腎臓病患者における血管機能の評価

次の実験の全体的な目標は、血管機能を評価することです 慢性腎臓病の患者では、これは最初に患者から血管内皮細胞を収集することによって達成されます。次に、大動脈脈波速度を評価して、大きな弾性動脈の剛性を測定します。次に、血管内皮機能を評価するために、上腕動脈の流れを介した拡張が測定されます。

最終的には、血管内皮機能を特徴付ける結果を得ることができます。この方法は、細胞レベルで何が起こるのか、さまざまなタンパク質の発現など、血管領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな個人は、超音波イメージングを習得するために広範な練習とトレーニングが必要なため、苦労します。

この手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるロニー・ペリーノです。まず、局所消毒剤を使用してサイトを準備します。次に、敷地に滅菌済みの穴あきドレープを配置します。

訓練を受けた看護師または医師は、IVを配置し、HEPロックアダプターを取り付ける必要があります。ドレープに2本のJワイヤーを配置して、J字型をほどきます。両方のワイヤのJの円弧を引っ張ります。

ほどけたら、ヘップロックのキャップを外し、JWIを静脈に約8センチメートル送ります。ワイヤーに血液が溜まりすぎないように、ワイヤーを取り外す前にワイヤーを数回前後に押します。次に、ワイヤーカッターを使用してワイヤーを切り取り、約30ミリリットルの解離バッファーを含む50ミリリットルの円錐管に収まるようにします。

サンプル収集が完了したら、2本目のワイヤーに対してこれらの手順を繰り返します。ウェットラボに戻ります。一対の鉗子でワイヤーを留め、チューブの内側、ただし溶液の上に10分間保持します。

電動ピペッターを使用して、チューブからの解離バッファーでワイヤーをすすぎます。バッファーをワイヤーの長さに沿って流れるように解放し、余分な液体をチューブに振り落とします。ワイヤーを取り外し、サンプルを遠心分離してペレットにします。

サンプルを取り出し、遠心分離する前にペレットをPBSに再懸濁します。その後さらに5分間、吸引ホースの端にあるピペットチップを使用して、チューブに約2ミリリットルを残します。ペレットを邪魔せずに残りを掃除機で取り除きます。

ペレットを再懸濁し、サンプルを以前に標識した8枚のスライドの楕円形の領域に均等にピペットで移します。スライドをインキュベーターに37°Cで5時間置いた後、分析を開始する準備ができるまでマイナス80°Cで保存します。被験者は使い捨てのショーツに着替え、静かで薄暗い温度調節された部屋に仰向けになります。

開始する準備ができたら、超音波と動脈硬化装置用の電極を配置します。次に、血圧カフを被写体に置きます。20分後に血圧の測定値を開始し、測定値が水銀柱の5ミリメートル以内になるまで測定値を繰り返します。

各読書の間に2分間休憩し、少なくとも3回実行します。次に、上腕動脈の脈拍を触診し、眼圧計を配置して上腕波の形態を記録します。橈骨動脈、大腿動脈、頸動脈についても繰り返します。

上腕動脈、橈骨動脈、頸動脈の巻尺と大腿動脈のカスタム定規を使用して、スーパー胸骨ノッチからこれらの各部位までの距離を測定します。次に、専用のソフトウェアを使用して、頸動脈上腕頸動脈橈骨および頸動脈大腿脈波速度を計算します。前腕の血圧カフをリオンプロセスのすぐ遠位に配置します。

血管ソフトウェアをトリガーモードに設定し、ベースライン上腕動脈、超音波画像、および血流速度測定の少なくとも10回の心周期を記録します。必要に応じて、機械式アームを使用して超音波プローブを安定させることができます。次に、前腕の血圧カフを水銀柱250ミリメートルに膨らませます。

そしてタイマーを開始します。参加者にじっとしているように指示します。タイマーが4分45秒のトリガーを読んだときに速度の記録を開始します。

5分でカフを外し、超音波を変更してBモードの画像を記録します。時計が5分10秒を指しているとき。時計が7分を示すまで録音を続けます。

次に、被験者の血圧を測ります。収縮期血圧が水銀柱の100ミリメートル以上の場合は、被験者の舌の下に0.4ミリグラムの舌下ニトログリセリンを置き、タイマーを開始します。.時計が3分を告げたらBモードの録画を開始し、録画を停止します。

時計が8分を指しているとき。染色された内皮細胞を分析するには、1人の盲検実験者がスライドを系統的にスキャンする必要があります 系統的に、内皮細胞はVEカドヘリンの陽性染色によって識別され、核の完全性はdapiの陽性染色によって確認されます。さらに、目的のタンパク質について細胞を染色する必要があります。

スライドごとに合計30個のセルを画像化し、後で解析する必要があります。VEコントロールスライドを含む染色バッチの各スライドについて、このプロセスを繰り返します。定性ソフトウェアを使用して、目的の一次抗体の染色強度を分析します。

この画像は、カフを 2 分間解放した後の慢性腎臓病患者の評価中に得られたベースライン上腕動脈径を示しています。この録音は、直径のR波ゲート変化を示しています。これらの波形は、頸動脈と大腿動脈のそれぞれで得られました。

時間と距離の差は、大動脈脈波速度のレポートを計算するために使用されました。ここでは、コントロール細胞と患者細胞の核の完全性について、DPIによる核の完全性、VEカドヘリンによる内皮細胞の発現、および酸化酵素N-A-D-P-Hオキシダーゼについて分析しました。この手順を試みる際には、正確で定量的な評価のために、可能な限り最高品質の超音波画像、波形、および内皮細胞画像を取得することを忘れないでください。

人間のサンプルを扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、適切な個人用保護具を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。