Name: 評価するために制限酵素ベースのクローニング方法インビトロ HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学ぶHIV-1サブタイプCのgag遺伝子変異が複製能に与える影響を評価する制限酵素ベースのクローニング法。患者由来gag遺伝子をMJ4プラスミドに組み込み、放射性逆転写酵素アッセイでウイルス産生を定量化する。

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調査員は、この研究に参加したザンビアのすべてのボランティアと、この研究を可能にしたルサカのザンビアエモリーHIV研究プロジェクトのすべてのスタッフに感謝します。研究者は、技術支援とサンプル管理について、Jon Allen、Smita Chavan、Mackenzie Hurlstonに感謝します。また、Mark Brockman博士の議論とGXR25細胞の寛大な寄付に感謝します。
この研究は、R01 AI64060とR37 AI51231（EH）および国際エイズワクチンイニシアチブによって資金提供されました。この作業は、米国国際開発庁 (USAID) を通じた米国民の寛大な支援によって部分的に可能になりました。内容は研究著者の責任であり、必ずしも USAID または米国政府の見解を反映しているわけではありません。この研究は、エモリーエイズ研究センターのウイルス学コア(Grant P30 AI050409)によっても部分的に支援されました。DCとJPは、Action Cycling Fellowshipsによって部分的に支援されました。 この研究は、ヤーキス国立霊長類研究センターの助成金(2P51RR000165-51)によって部分的に支援されました。このプロジェクトは、National Center for Research Resources P51RR165によっても部分的に資金提供を受けており、現在はOffice of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132によってサポートされています。

著者らは開示するものは何もない。

により長さとこのプロトコルの技術的な性質のために、キメラギャグ-MJ4プラスミドの構築の成功の両方のためだけでなく、ウイルス複製能力の定量化のために重要である、いくつかのステップがあります。このプロトコルで概説MJ4への外来ギャグ遺伝子の導入のための制限酵素ベースのクローニング戦略は以前に使用され再結合に基づく方法に対して多くの利点を有しているが、重要なステップを正確に従わない場合、プロトコルは、技術的に挑戦することができます。 まず、DCMおよびダムDNAメチラーゼを欠くコンピテント細菌株において生成されたMJ4プラスミドDNAを使用することが必要不可欠である。 MJ4骨格にギャグの遺伝子をクローニングするために使用されているのBclI制限エンドヌクレアーゼの酵素活性は、敏感なダム/ DCMのメチル化であるとして、これが必要です。 JM110及びSCS110（endAの負JM110誘導体）E.大腸菌株非メチル化MJ4プラスミドDNAを生成するのに適して再。さらに、ベクターおよびインサートバンドの切除のために、それは非常に青色光...

HIV-1病因および疾患の進行に影響を与える宿主およびウイルス両方の特性を決定することは、合理的なワクチン設計のために最も重要である。細胞性免疫応答は、HIV-1感染に対するヒトの免疫応答の重要な構成要素である。細胞傷害性Tリンパ球（CTL）は、急性ウイルス血症の初期制御のために必要であり、ホストが定常状態（セットポイント）ウイルス量1,2を確立することを可能にする。これらのエフェクター細胞の実験的な枯渇は、ウイルスコントロール3,4の損失をもたらす。これにもかかわらず、エスケープ変異は、ウイルス感染細胞5-9のCTL認識を覆すウイルスゲノム内で発生する。 特定のHLA対立遺伝子は、より低いウイルス負荷およびB * 57、B * 27、B * 81の10-15を含む遅い疾患進行と関連している。 HLAクラスI対立遺伝子の保護の利益の一部は、彼らがそのようなGagのようなゲノムの機能的に制約された領域を標的とするという事実に帰することができる及びインビトロ 16-21 で複製するウイルスの能力を減少させ、エスケープ突然変異を選択します。細胞性免疫系からの脱出は、私は対立の選択HLAクラスとの関連でウイルスに有益であるが、これらの変異の効果は、HLAミスマッチ22,23の個人に送信時にホストの差分結果をもたらす可能性がある。そのため、ウイルス複製能力に送信されたHLA-関連したエスケープ変異の影響を理解することは、初期のHIV-1の病因の理解を促進するために重要であろう。 多くの進歩は、私が24〜29の対立遺伝子特異的HLAクラスに関連付けられた個別のエスケープ変異の適応度の欠陥を特定し、特徴づけるために作られているが、天然に存在するHIV-1分離株は、おそらく、HLAから生じる、HLA関連多型のユニークで複雑 ​​な足跡を持っている別の免疫遺伝学的背景30の媒介免疫圧力。 apにrevious分析、Goepfert ら 。 88急性感染ザンビアに由来して送信ギャグ配列におけるHLA関連変異の蓄積がセットポイントウイルス量31の減少と関連していることを示した。これは、HLA-ミスマッチの受信者へのGag特異的で有害なエスケープ突然変異の送信は、臨床的利点を提供し、そしてウイルス複製を弱毒化することによるものであり得ることを示唆した。今後、このような複製能力、および早期の複製が今度は、HIV-1臨床パラメータと後期に影響を与える可能性のある方法として、送信されたウイルスの特性を定義するために協調してどのように動作するか、複雑なギャグ多型の組み合わせ、天然に存在する分離株の中勉強することが不可欠です病因。 ブロックマンらは、最初のサブタイプCとBの感染の両方で慢性期の感染とウイルス量の間に単離さギャグ-プロ配列の複製能力の間のリンクを実証した32-35。これらの研究で示された実験的なアプローチは、慢性的に感染した個体に由来する配列のin vitro複製能力を調べるための適切なものの、困難なサブタイプC急性感染した個体におけるHIV-1複製の能力を研究するいくつかの技術的な注意事項や制限事項があります。この方法は、研究室では、ウイルスストック36を適応、LAVの一部が元になって、サブタイプB NL4-3プロウイルスの中に人口ベースのPCR増幅された配列の組換えに依存しています。ウイルス産生は、PCRアンプリコンとCEM系T細胞株37の同時トランスフェクションによって達成し、デルタのgag-プロ NL4-3 DNAを消化し ​​た。この方法は、潜在的に生体内でのウイルス準種に関連して回収されたウイルス株の本質をゆがめるため、in vitroでの複製能力の測定を変えること、数週間から数ヶ月の期間にわたってウイルスの増殖を必要とします。このメソッドは、私それが効果的に最も高い複製能力を持つウイルスのために選択され、ここで、慢性感染者が多数から多数の異なるウイルス変異株のクローンを作成すると、非常に労働集約的であるため現実的ではない場合には、慢性的に感染した個体を研究するためのより適切だ。しかし、急性感染個体内の、一般的に一から二の変種が存在であり、従って、 インビトロ選択圧を通じて回収されたウイルス株の本質をゆがめる危険性を排除し、in vitroでの複製能力をより正確に評価することができます。第二に、この方法では、サブタイプB派生バックボーンにサブタイプC ギャグ-プロ配列が再結合が必要であり、分析にバックボーンの非互換性の偏りをもたらす可能性があります。により、これらの制限のために、配列の大きな番号が導入された潜在的なバイアスを克服するために分析しなければならない。 ここでは、代替実験的アプロを記述サブタイプC急性感染した個体に由来する配列を研究するための適切なACH。私たちは、サブタイプCプロウイルス骨格、MJ4へのHIV-1サブタイプC感染者の急性感染時点から派生gag遺伝子を導入するために、制限酵素ベースのクローニング戦略を使用しています。 ギャグの遺伝子をクローニングすることで一般的なバックボーンとしてMJ4の使用は、サブタイプC由来配列の分析のために重要である。 MJ4は、一次分離株38から導出され、したがって、原因バックボーンおよびgag遺伝子間のサブタイプの非互換性にバイアスを導入する可能性が低いであろう。また、酵素に基づく制限クローニングを使用してのアプローチは、293T細胞に直接トランスフェクトするプロウイルス構築物について、およびクローン化されたgag配列と同一のクローン性ウイルスストックの回収を可能にする。 以下に提示された方法は、派生ギャグ-MJ4サブタイプCの複製能力を評価するためのハイスループット法であるキメラウイルス。 293T細胞へのトランスフェクションは、簡単であり、ウイルスの回収は、わずか3日かかります。 インビトロ複製能力は、ブロックマンらによって作成された同じCEM-CCR5ベースのT細胞株でアッセイされる。37が、成功した複製に必要な重要なプロトコルの変更を使用して、サブタイプC MJ4キメラウイルスの。むしろPBMCをより適切なT-細胞株の使用は、高いアッセイ再現性試験すべきサブタイプC MJ4-キメラウイルス多数のを可能にする。最後に、上清中のウイルスの定量化のために放射性標識逆転写酵素アッセイを使用して、市販のp24 ELISAキットを使用するよりもコスト効率である。また、同じアッセイ内および分離株の間でのレプリケーションの微妙な違いを検出するためのウイルスを複製し、両方の悪い、高度を検出するために重要であった、より高いダイナミックレンジを与える。 結論として、ここで紹介する方法が可能にしたザンビアからの急性感染した個体のHIV-1サブタイプCから派生ギャグ配列の複製能力の詳細な調査、および書かれたように、他のサブタイプC感染集団を研究するために拡張することができる。異なる分離株のGag間の複製能力のばらつき度が高いが観察された。さらに、当社は送信されたギャグの複製能力とセットポイントウイルス量だけでなく、3年間で39以上のCD4 +の減 ​​少との間の統計的関連性を示すことができた。このような結果は、そのような複製能力としてどのように、送信さウイルスの特性を研究することの重要性を強調初期感染時に病原性に影響を与えるために、宿主の免疫系と相互作用して、効果的なワクチンの介入だけでなく、治療を開発するための一体化されています。

<table><tbody><tr><td colspan="4">PCR Reagents</td></tr><tr><td>GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, 標準脱塩</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, 標準脱塩</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, 標準脱塩</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR</td> <td>3'IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, 標準脱塩</td></tr><tr><td>MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, 標準脱塩</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, 標準脱塩</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTATTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>カスタムオリゴ</td><td>25 nmol、標準脱塩</td></tr><tr><td>GagF2:5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>カスタムオリゴ</td><td>25 nmol、標準脱塩</td></tr><tr><td>For3:5' CTAGGAAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>カスタムオリゴ</td><td>25 nmol、標準脱塩</td></tr><tr><td>GagR6:5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>カスタムオリゴ</td><td>25 nmol、標準脱塩</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, 標準脱塩</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, 標準脱塩</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 Strip Tubes, Blue (Flat Cap)</td> <td>Daigger</td><td>EF3647BX</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III ワンステップ RT-PCR システム</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II DNA polymerase</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nucleotideミックス</td><td>ロシュ</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>アガロース、高ゲル強度</td><td>フィッシャー</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>プロメガ 1 kb DNA ラダー</td><td>フィッシャー</td><td>PRG5711</td><td>プロメガ</td></tr><tr><td>Sybr 製 Safe DNA ゲル染色、10,000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>ウィザード SV ゲルおよびPCRクリーンアップシステム</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr>カ<tr><td>ミソリの刃、片刃の</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-640</td>外科<td>設計</td></tr><tr><td>サーモサイクラー、PTC-200</td><td>MJリサーチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">微生物学&によって製造クローニング試薬</td></tr><tr><td>LB 寒天、Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth、Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 100 x 15 mm ポリスチレン シャー</td>レ <td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>NgoMIV制限エンドヌクレアーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>BclI制限エンドヌクレアーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>HpaI制限エンドヌクレアーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ、5 U/&mu;l</td><td>ロシュ</td><td>10799009001</td><td></td></tr><tr><td>JM109 コンピテントセル、>108 cfu/&mu;g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield プラスミド ミニプレップ システム</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 ブルーライト トランスイルミネーター</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture Reagents</td></tr><tr><td>Amphyl クリーナー/消毒剤</td><td>フィッシャー</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD、1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>Promega</td></tr><tr><td>臭化ヘキサジメトリン (ポリブレン)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Costar Plates、6 ウェル、フラット</td><td>フィッシャー</td><td>07-200-83</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>Costar Plates、24 ウェル、フラット</td><td>フィッシャー</td><td>07-200-84</td><td>Corning Life 製</td></tr><tr><td>コスタープレート、96ウェル、丸型</td><td>フィッシャー</td><td>07-200-95</td><td>コーニングライフ</td></tr><tr><td>フラスコ製造、コーニングフィルタートップ/カントネック、75 cm2</td><td>フィッシャー</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>フラスコ、コーニングフィルタートップ/カントネック、150 cm2</td><td>フィッシャー</td><td>10-126-34</td><td>コーニングライフ</td></tr><tr><td>コニカルチューブ、50 ml、ブルーキャップ</td><td>フィッシャー</td><td>14-432-22</td><td>BD Biosciences</td></tr><tr><td>コニカルチューブ、15 ml、ブルーキャップ</td><td>フィッシャー</td><td>14-959-70C</td><td>BD バイオサイエンス社製</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>フィッシャー</td><td>MT25052CI</td><td>メディアテック</td></tr><tr><td>製 RPMI、500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン、100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS、マグネシウムとカルシウム、500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS、マグネシウムとカルシウムを含まない</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Sarstedtチューブ、アソートカラー</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>リザーバートレイマルチチャンネル、55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 well clear V bottom tissue culture treated microplate</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Manufactured by Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M Buffer Solution</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Defined, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Promega</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド、グレード II、H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M 塩化マグネシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液、分子生物学用、36.5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>カリウムヘキサシアノフェレート(II) 三水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサシアノフェレートカリウム(III)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15-R 遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>TC10 自動セルカウンター</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision 倒立顕微鏡</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">逆転写酵素定量アッセイ試薬</td></tr><tr><td>dTTP, [&α;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8.0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td> KOH 2 M 塩化カリウム (KCl AM9640G) で <td>pH 7.8 に調整する必要があります</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>1 M 溶液</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Poly adenylic acid (Poly rA) potassium salt&nbsp;</td><td>ミッドランド試薬株式会社</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>オリゴ d(T) プライマー</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>SR, 超解像蛍光体スクリーン, 小型</td><td>パーキンエルマー</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>コーニング Costar サーモウェル 96-well プレートモデル (M) ポリカーボネート</td><td>フィッシャー</td><td>07-200-245</td><td>コーニング生命社製</td></tr><tr><td>コーニング96ウェルマイクロプレートアルミニウムシーリングテープ、非滅菌</td><td>フィッシャー07-200-684</td><td></td>コー<td>ニングライフ</td></tr><tr><td>DE-81アニオン交換紙</td>製<td>Whatman3658-915</td><td></td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸三ナトリウム二水和物</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーS671-3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オートラジオグラフィーカセット</td><td>フィッシャー</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>サイクロンストレージリンショウスクリーン</td><td>パッカード</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; hiv-1サブタイプc gag特異mj4キメラウイルスの複製能力

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

多くのHLAクラスI対立遺伝子のHIV-1の病因と疾患の進行に対する保護効果は、部分的には、HIV-1ゲノムの保存された部分を標的とする能力に起因しています。 細胞性免疫圧に起因する配列変化は、感染中にゲノム全体で発生し、Gagなどのゲノムの保存領域内で見つかった場合、ウイルスのin vitroでの複製能力に影響を与える可能性があります。 GagにおけるHLA関連多型のHLA一致レシピエントへの伝播は、セットポイントウイルス量の減少と関連している。これは、ウイルスの複製能力の低下によるものである可能性があるという仮説を立てました。ここでは、サブタイプCに感染したザンビア人の急性時点から単離されたGAG遺伝子の影響を受けるHIV-1のinvitro複製を評価するための新しい方法を紹介します。 この方法では、制限酵素ベースのクローニングを使用して、GAG遺伝子を一般的なサブタイプC HIV-1プロウイルス骨格であるMJ4に挿入します。これにより、サブタイプC配列の研究には、慢性的に誘導されたgag-pro配列のin vitro複製を評価した以前の組換えベースの方法よりも適切になります。それにもかかわらず、このプロトコルは、他のサブタイプ由来のウイルスの研究のために容易に変更することができます。さらに、このプロトコルでは、CEMベースのT細胞株上のGag-MJ4キメラウイルスの複製能力を評価するための堅牢で再現性の高い方法を詳述しています。この方法は、急性に感染したザンビア人149人のサブタイプCに由来するGag-MJ4キメラウイルスの研究に利用され、複製に影響を与えるGagの残留物の同定を可能にしました。 さらに重要なことに、この技術の実施により、ウイルス複製が設定値のウイルス量や縦方向のCD4+ T細胞の減少など、初期のHIV-1病因のパラメータをどのように定義するかについてのより深い理解が促進されました。

適切に完全に機能する、感染性のギャグ-MJ4キメラを組み立てることのできるプロウイルスプラスミドを作成し、このプロトコルを、実行するために、細心の注意は、適切なPCRアンプリコンを生成するように注意しなければならない。 PCRは適切なサイズのギャグアンプリコンを生成したかどうかを決定することは非常に重要です。製品は、 図1（a）に示した約1700 bpのアンプリコンの100塩基対（bp）の範囲内である必要があります。この断片の正確な長さは、研究中のgag遺伝子に依存して変化する。次に、MJ4分子クローンの5 &#39;末端反復配列（LTR）の部分は、その後のクローニングに適するようにするために増幅され、 ギャグリコンにスプライスされている必要があります。 MJ4 LTRアンプリコンは長さが1474塩基対であるべきである。 図1Bは、正しいバンドサイズが適応される代表的なゲル画像を示す。スプライスオーバーラップ伸長PCRの41後、合わせLTR- ギャグの製品は次のようになります<...

HIV-1の病因は、ウイルスの特性と宿主の遺伝的要因の両方によって定義されます。ここでは、gag遺伝子配列の変異がウイルスのin vitro複製能力に与える影響を評価するための再現性のある測定を可能にする堅牢な方法について説明します。

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

この手順の全体的な目的は、サブタイプCのHIV-1感染者由来のgag遺伝子を複製能を持つHIV-1プラスミドに組み込み、in vitroにおけるHIV-1の複製能に対するgag配列の多型による影響を評価することです。まず、患者の血漿からgag遺伝子を増幅させることでこれを達成します。第2のステップでは、患者由来のgag配列を、複製能を持つ感染性分子クローンMJ-fourにクローニングします。次に、gag-MJ-fourキメラプラスミドをトランスフェクションして感染性ウイルスストックを調製し、インジケーター細胞株を用いて感染価を測定し、感染性を評価します。最終ステップでは、GXR-25 T細胞株におけるin vitro複製能を測定します。最終的に、放射標識逆転写酵素アッセイを用いて、ウイルス複製キネティクスを可視化するために、時間経過に伴うビリオン産生量を定量します。本日解説する手法は、HIV研究分野における重要な課題の解決に役立ちます。これには、HIVの複製適応度の決定要因の定義や、HIVの適応度が長期的な病原性にどのように影響するかを理解することが含まれます。本日の手法の解説は、私の大学院生であるJessica PrinceとDan Claiborneの2名が担当します。この手順を開始するために、ワンステップRT-PCRを用いて、逆転写酵素および耐熱性DNAポリメラーゼによりRNAからcDNAを逆転写し、第1ラウンドのDNA産物を増幅させます。次に、第1ラウンドのPCR増幅産物1 µLをDNA鋳型として用い、ネステッド第2ラウンドPCR増幅を行います。続いて、第2ラウンドの反応液5 µLに5Xローディングダイを3 µL加えます。UV蛍光DNA染色剤を含む1%アガロースTAEゲル上で、バンドが分離するまで120 Vで電気泳動を行います。次に、ブルーライトイルミネーターで1.6 KBのバンドを視認します。その後、残りの45 µLの反応液を、DNA染色剤を含む1%アガロースTAEゲル上で電気泳動します。清潔なカミソリの刃で適切なバンドを切り出し、個体あたり3つの陽性反応分をまとめます。続いて、ゲル精製キットを用いてゲルスライスからDNAを抽出し、ヌクレアーゼフリー水で溶出させます。得られた産物は、後で使用するために-20 °Cで凍結保存します。0:15:56 この手順では、MJ-fourプラスミドのlong terminal repeat 5' UTR領域を増幅させた後、1.3 KBのPCR産物をイルミネーターで視認します。陽性アンプリコンを切り出し、前述の方法で精製し、凍結保存します。次に、スプライスオーバーラップ伸長PCR（splice overlap extension PCR）により、融合MJ-four LTR gagアンプリコンを作製します。3.2 kbの長いアンプリコンを視認、切り出し、精製し、凍結保存します。ここで、1.5 µgのMJ-fourプラスミドと1.5 µgの精製LTR-gag PCR産物を、BclI制限エンドヌクレアーゼを用いて50 °Cで1.5時間消化します。続いて、消化反応液に1 µLのNGOM-fourを加え、37 °Cで1時間インキュベートします。その後、制限酵素消化反応液に5xローディングダイを添加します。全量を、DNA染色剤を含む1%アガロースTAEゲル上で、100 Vで1〜2時間かけてゆっくりと電気泳動します。前述の方法で、クローニングのために目的のバンドを視認、切り出し、精製します。次に、精製したLTR-gagインサートとMJ-fourベクターDNAを用い、インサートとベクターの比率を3:1にしてライゲーション反応液を調製します。ライゲーション反応液を4°Cで一晩インキュベートします。次に、100 µg/mLのAmpicillinを含むLB寒天培地に、ライゲーション産物を用いてJM-109化学的コンピテント細胞を形質転換します。形質転換した細菌を30 °Cで少なくとも22時間培養します。クローニングの正確性を確認するため、ミニプレップDNAをNGOM-fourおよびHPA-one制限酵素で37 °Cで2時間ダブルダイジェストします。その後、1%アガロースTAEゲルで分析します。TZM-BL細胞アッセイによる1 µLあたりのIU力価に基づき、5×10⁵個のGXR-25細胞を0.05の感染多重度（MOI）で感染させるために必要な各ストックのウイルス量を算出します。複製能を有するHIVを取り扱う際は、フルガウン、フェイスマスク、二重手袋を含む適切な個人用保護具を必ず着用してください。感染当日、ウイルスストックを-80 °Cのフリーザーから取り出して解凍します。次に、0.05 MOIにするため、ウイルスをC-R-P-M-I培地で100 µLに希釈します。これをV底組織培養処理済み96ウェルプレートに添加します。その際、各複製実験セットにポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方を含め、ウェル間のクロスコンタミネーションを制限するために1列おきに空列を設けてプレートを構成します。その後、自動細胞計数器を用いてGXR-25細胞をカウントし、すべての感染に必要な総細胞数を算出します。必要な容量を50 mLコニカルチューブに分注し、遠心して細胞をペレット化します。次に、培地を慎重に吸引し、C-R-P-M-Iを用いて100 µLあたり5×10⁵個の濃度に再懸濁します。細胞を滅菌済みのリザーバーに移し、十分に混ぜ合わせます。続いて、マルチチャンネルピペットを使用して、希釈ウイルスを含む96ウェルプレートの各ウェルに細胞を100 µLずつ加え、十分に混ぜます。その後、各ウェルに5 mg/mLのポリブレン溶液を2 µL加え、細胞を十分に混合します。その後、5% CO2濃度の組織培養インキュベーター内にて37 °Cで3時間インキュベートします。感染細胞を洗浄するために、96ウェルV底プレートを遠心分離して細胞をペレット化します。次に、培地150 µLを慎重に取り除き、細胞ペレットを乱さないように新鮮なC-R-P-M-I 150 µLと置換します。この手順をさらに2回繰り返し、細胞を十分に洗浄します。最後の遠心分離後、150 µLのC-R-P-M-Iを添加し、マルチチャンネルピペットを用いて細胞ペレットを再懸濁します。各ウェルの混合液を、24ウェル組織培養プレートのウェルにある800 µLのC-R-P-M-Iに加えます。その後、プレートを37 °C、5% CO2の組織培養インキュベーターに入れます。2日ごとに、培養ウェルの表面から上清100 µLを96ウェルU底プレートのウェルに移し、後のRTアッセイによる分析のために冷凍保存します。その後、細胞を十分に再懸濁し、細胞の過増殖を防ぐために残りの液量の半分を取り除きます。その後、各ウェルに新鮮なC-R-P-M-I 550 µLを添加し、元の液量に戻します。この手順では、1 mLのRTマスターミックスの分注量それぞれに、10 mCi/mLのDTTPを1〜2 µL、および1 MのDTTを4 µL加えます。1.5 mLマイクロ遠心チューブに入ったRTマスターミックス、DTT、DTTPの混合物を、1000 µLピペットを用いて慎重に混合し、滅菌済みのトラフに移します。次に、ラベル付けされたRTミックスを25 µLずつ、96ウェル薄壁PCRプレートの各ウェルに分注します。各上清5 µLを、RTマスターミックスを含むPCRプレートに加えます。その後、PCRプレートを粘着剤付きフォイルカバーで密封し、サーモサイクラーを用いて37 °Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、200 µLマルチチャンネルピペットを使用して、フォイルカバーに小さな穴を開けます。サンプルを5回混ぜ合わせます。各サンプル5 µLをDE-81ペーパーに移し、すべてのサンプルを10分間自然乾燥させます。ブロットを個別の洗浄容器に入れます。続いて、ブロットを1X SSCで5回洗浄します。その後、90%エタノールで1回につき5分間、2回洗浄し、自然乾燥させます。乾燥後、ブロットをサランラップで丁寧に包み、密閉したカセットに入れて、室温で一晩ホスホスクリーンに感光させます。準備が整ったら、フォスフォーイメージャーを用いてフォスフォスクリーンを解析し、放射性転写産物量を定量します。図示。ここでは、MJ-fourプラスミドバックボーンにクローニング可能な患者由来gagアンプリコンを生成するために必要な、さまざまなPCRアンプリコンの電気泳動分離を示す代表的なゲル画像を示します。この代表的なゲル画像は、患者のgag遺伝子をMJ-fourにクローニングするための制限酵素消化物の電気泳動分離を示しています。この代表的なゲル画像は、精製したgag MJ-fourキメラプラスミドDNAの制限酵素消化による電気泳動分離を示しています。このグラフは、GXR-25細胞株における複製アッセイの経時的な再現性を示しています。約1年の間隔を空けて実施された2回の独立した実験において、同一のgag MJ-fourキメラウイルスを用いてGXR-25細胞に感染させました。複製スコアは、対数変換したDLU値の傾きを算出し、その傾きを野生型MJ-fourで正規化することによって算出しました。2つの独立した測定値は強い相関を示しており、異なる時期に異なる継代数の細胞を用いて実施したアッセイの再現性が強調されています。この手法は、世界で最も普及しているサブタイプである急性サブタイプC感染における病原性のウイルス決定因子の探索という、HIV/AIDS分野の研究者に道を開きました。複製能を持つHIVを扱うことは極めて危険な場合があります。生ウイルスを扱うすべての工程は、BSL 2+施設で実施する必要があります。すべての表面は定期的に除染し、常に二重手袋を着用してください。

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Research

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Immunology and Infection

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学ぶHIV-1サブタイプCのgag遺伝子変異が複製能に与える影響を評価する制限酵素ベースのクローニング法。患者由来gag遺伝子をMJ4プラスミドに組み込み、放射性逆転写酵素アッセイでウイルス産生を定量化する。

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法

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