評価するために制限酵素ベースのクローニング方法インビトロ HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力

この手順の全体的な目標は、サブタイプ CHIV One 感染者に由来する gag 遺伝子を複製能力のある HIV One プラスミドに組み込むことです。in vitroでHIV 1複製能力に対するギャグ配列多型の影響を評価するために、これは最初に患者の血漿からギャグ遺伝子を増幅することによって達成されます。第2のステップは、患者由来のギャグ配列を複製能力のある感染性分子クローンMJ 4にクローニングすることです。

次に、gag MJ four キメラプラスミドをトランスフェクションして感染性ウイルスストックを作製し、指標細胞株で感染力を評価するために力価を付与します。最後のステップは、G XR 25 T細胞株のin vitro複製能を測定することです。最終的には、無線標識逆転写酵素アッセイを使用して、ウイルス複製速度を視覚化するために、経時的なビリオン産生を定量

今日説明する方法は、HIV分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。これには、HIV複製適応度の決定要因の定義や、HIV適応度が長期的な病因にどのように影響するかを理解することが含まれます。今日は、私の大学院生であるジェシカ・プリンスとダン・クラバンの2人にその方法を説明します。

この手順を開始するには、RNAからCDNAを逆転写し、逆転写酵素と熱安定DNAポリメラーゼを使用して1回目のラウンドDNA産物をワンステップRT PCRで増幅します。次いで、第1ラウンドPCR増幅の1マイクロリットルをDNAテンプレートとして用いて、ネストされた第2ラウンドPCR増幅を行う。次に、第2ラウンド反応量の5マイクロリットルに5×ローディング色素の3マイクロリットルを添加する。

バンドが解消されるまで、UV蛍光DNA染色を含む1%aros、TAEゲルで120ボルトで実行します。次に、青色光イルミネーターで 1.6 KB のバンドを視覚化します。その後、残りの45マイクロリットルの反応容量を、DNA染色物を含む1%aros、TAEゲルで実行します。

清潔なカミソリの刃で適切なバンドを切除し、個人ごとに3つの肯定的な反応を組み合わせます。続いて、ゲル精製キットを用いてゲルスライスからDNAを抽出し、ヌクレアーゼフリー水中で使用してください。この手順の後半で使用するために、製品を摂氏マイナス20度で凍結します。

MJ 4プラスミドの長末端リピート5プライムUTR領域を増幅した後。イルミネーターで 1.3 KB PCR 産物を可視化し、ポジティブアンプリコンを取り出してから、前述のように精製して凍結します。次に、スプライスオーバーラップ延長PCRを介して融合したMJ 4 LTRギャグアンプリコンを作成します。

3.2 kbの長アンプリコンを視覚化、切除、精製、凍結します。次に、1.5マイクログラムのMJ 4プラスミドと1.5マイクログラムの精製LTR gag PCR産物をBCL 1制限エンドヌクレアーゼで摂氏50度で1.5時間消化します。その後、1マイクロリットルのNGOM 4を消化反応に加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。

その後、制限酵素消化反応に5×ローディング色素を添加します。1%aros上で全体積をゆっくりと電気泳動し、A DNAを含有するTAEゲルを100ボルトで1〜2時間染色します。前述のように、クローニングのために指定されたバンドを視覚化、切除、精製します。

次に、精製したLTRギャグを用いてライゲーション反応を調製します。MJ 4ベクターDNAをインサートとベクターの比率が3対1で挿入します。ライゲーション反応を摂氏4度で一晩インキュベートします。

次に、JM 1 0 9化学的に有能な細菌をライゲーション生成物で変換し、1ミリリットルあたり100マイクログラムのLBオーガープレートに広げます。アンピシリンは、形質転換細菌を摂氏30度で少なくとも22時間増殖させます。.クローニングの忠実度を確認するために、NGO の M four および HPA one 制限酵素を使用して mini prep DNA を 37°C のダブル消化で 2 時間切断します。

その後、1%arosで分析します。TAEゲル。TZM BL細胞アッセイからのマイクロリットル力価あたりのIUに基づいて、感染の多重度0.05で5倍10から5番目のG XR 2 5細胞に感染するために必要なウイルスの量を計算します。

感染当日には、フルガウン、フェイスマスク、ダブルグローブなど、複製能力のあるHIVを扱うための適切な個人用保護具を必ず着用してください。マイナス80°Cの冷凍庫からウイルスストックを取り出し、解凍します。次に、C-R-P-M-I培地でウイルスを100マイクロリットルの容量に希釈します。

0.05 MOIを達成するためには、vbo組織培養処理した96ウェルプレートにそれを追加し、各複製実験セットにポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方を含め、ウェル間のクロスコンタミネーションを制限するために、他のすべてのカラムが空白になるようにプレートを設定します。その後、自動セルカウンターを使用してGXRの2つの5つのセルをカウントし、すべての感染に必要な細胞の総数を計算します。必要な量を50ミリリットルの円錐管に分注し、遠心分離して細胞をペレット化します。

次に、培地を慎重に吸引し、100マイクロリットルあたり10〜5番目の細胞の5倍の濃度でC-R-P-M-Iに再懸濁し、細胞を滅菌トラフにピペットで入れ、十分に混合します。続いて、マルチチャンネルピペットを使用して、希釈したウイルスを含む96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞を加え、完全に混合します。その後、ポリブレインの5ミリグラム/ミリリットル溶液を各ウェルに2マイクロリットル加え、細胞を完全に混合します。

次に、感染細胞を遠心分離機に洗浄するために、5%CO2を含む組織培養インキュベーターで摂氏37度で3時間インキュベートします。細胞をペレット化する96ウェルV底板。次に、150マイクロリットルの培地を慎重に取り出し、細胞ペレットを乱さずに新しい150マイクロリットルのC-R-P-M-Iと交換します。

最後の遠心分離後に細胞を十分に洗浄するためにこの手順をさらに2回繰り返し、150マイクロリットルのC-R-P-M-Iを添加して、マルチチャンネルピペットで細胞ペレットを再懸濁します。各ウェルからの混合物を、24ウェル組織培養プレートのウェル内の800マイクロリットルのC-R-P-M-Iに加えます。次に、プレートを摂氏37度の5%CO2組織培養インキュベーターに2日ごとに置きます。

培養ウェルの表面から100マイクロリットルの上清を96ウェルUボトムプレートのウェルに移し、RTアッセイを使用してその後の分析のために凍結し、細胞を完全に再懸濁し、残りの体積の半分を除去して細胞の過増殖を防ぎます。その後、この手順で各ウェルに550マイクロリットルの新鮮なC-R-P-M-Iを追加し、DTTPの1ミリリットルあたり10ミリキュリーの1〜2マイクロリットルと1モルDIO 3エトールの4マイクロリットルを各1ミリリットルのアリコートに追加して元のボリュームを復元します。RTマスターミックスDTTおよびDTTPの各1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを1000マイクロリットルピペットで慎重に混合し、滅菌トラフに移します。

次に、ラベル付きRTの25マイクロリットルを分注します。96ウェル薄肉PCRプレートの各ウェルに混合します。各上清の5マイクロリットルを、RTマスターミックスを含むPCRプレートに加えます。次に、PCRプレートを接着性ホイルカバーで密封し、インキュベーション後、サーモサイクラーで摂氏37度で2時間インキュベートし、200マイクロリットルのマルチチャンネルピペットを使用してホイルカバーに小さな穴を開けます。

サンプルを5回混ぜます。各サンプルの5マイクロリットルをDE81紙に移し、すべてのサンプルを10分間風乾させます。ブロットを別々の洗浄容器に入れます。

その後、1つのXSSCでブロットを5回洗浄します。その後、90%エタノールを2回、洗濯ごとに5分間行い、その後、自然乾燥させます。乾いたら、ブロットをサランラップで慎重に包み、密閉されたカセットに入れて室温で一晩リン酸化スクリーンに曝露します。

準備ができたら、リン酸化イメージャーでリン酸化スクリーニングを分析し、放射性転写産物を定量化します。表示。これは、MJ 4プラスミド骨格にクローニング可能な患者由来のギャグアンプリコンを生成するために必要なさまざまなPCRアンプリコンの電気泳動分離を示す代表的なゲル画像です。この代表的なゲル画像は、患者ギャグ遺伝子をMJ fourにクローニングするための制限消化物の電気泳動分離を示しています。

そして、この代表的なゲル画像は、精製されたギャグMJの4つのキメラプラスミドDNAを制限酵素消化物の電気泳動分離を示しています。このグラフは、G XR two five cell lineにおける複製アッセイの経時的な再現性を示しています。同じギャグMJ 4キメラウイルスを使用して、約1年間隔で行われた2つの独立した実験でG XR two five細胞に感染しました。

レプリケーションスコアは、対数変換されたDLU値の傾きを計算し、その傾きを野生型MJ4に正規化することによって生成されました。この2つの独立した測定には強い相関関係があり、異なる時間に、異なる継代の細胞を用いて行われたアッセイの再現性が強調されています。この技術は、HIVエイドの分野の研究者が病因のウイルス決定要因を探求する道を開きました。

急性サブタイプC感染症では、世界で最も蔓延しているサブタイプです。複製能力のあるHIV1と協力することは、非常に危険です。生ウイルスを含むすべての手順は、BSL 2プラス施設で実行する必要があります。

すべての表面は定期的に除染し、常に二重の手袋を着用する必要があります。