局所および全身所における病原体により誘導される慢性炎症のためのマウスモデル

次のプロトコルの全体的な目標は、生理学的に関連する動物モデルを使用して、in vivo での慢性炎症に対する微生物感染の影響を調べることです。これは、マウスにポルフィロモナス・ジンジバリスを経口感染させ、局所的および全身的な慢性炎症を誘発することによって達成されます。その後、MRIを利用して生きた動物の全身性炎症の進行を測定することができ、局所炎症性骨量減少はマイクロCTによって評価され、アテローム性動脈硬化性プラークは犠牲後の顔面脂質染色によって視覚化できます。

最終的には、P歯肉筋に感染したマウスと非感染対照群とでは、歯槽骨の体積とアテローム性動脈硬化性プラークの蓄積の違いを、それぞれマイクロCT解析と顔面脂質染色に基づいて測定できます。私たちの動物モデルの主な利点は、慢性炎症に関与する宿主と病原性の両方のメカニズム、特に感染から離れた場所でのメカニズムを調べることができることです。そのため、トランスジェニックマウスと定義された細菌変異体を使用して、全身性部位と局所的な感染部位を調べることができます。

このモデルは、病気の原因となる宿主や微生物の要因など、病因の重要な側面を特定するのに役立ちます。この方法は、炎症性骨量減少やアテローム性動脈硬化に関与する特定の宿主および病原体のメカニズムについての洞察を得ることができますが、関節リウマチ、糖尿病、がんなど、他の疾患モデルマウスにも適応させることができます。これはボストン大学の高磁場MRIの中核施設であり、私のポスドクフェローであるNingは、マウスイメージングの側面を実証する予定です。まず、桃の歯肉3 81の凍結茎を嫌気性血液寒天プレートにストリーキングし、プレートを摂氏37度の嫌気性チャンバーでインキュベー

3〜5日後、プレート成長生物を使用して、脳心臓注入ブロス(BHI)の5ミリリットルの液体培養物に接種します。一晩成長した後、培養物を45ミリリットルのBHIに移し、培養物をさらに18〜24時間嫌気的にインキュベートします。中間対数期では、7, 000 GSおよび室温で10分間の遠心分離によって細菌を収穫し、その後、PBS Resusの50ミリリットルでペレットを3回洗浄した後、血清学的ピペットでPBSの5ミリリットルのペレットを徹底的に再懸濁します。

次に、十分な中粘度のカルボキシメチルセルロースを取り出して、体積溶液に対して2%の重量を達成し、凝集を避けるためにボルテックスしながらカルボックスエチルセルロースを細菌懸濁液にゆっくりと追加します。C 2の炎症の進行を測定する。まず、マウスの頭を仰臥位にしてアニマルホルダーを30 mmの垂直プローブと11.7 TMRIスキャナーの垂直ボアに入れます。

ウォブリングとシミングのプロセスの後、珍しいシーケンスを使用して、3つの直交方向に沿ってスカウト画像を取得し、軸方向の冠状および矢状画像を作成します。次に、低解像度の磁気共鳴血管造影法を使用して、取得した画像が標的領域内にあることを確認した後、次のパラメーターを使用して、無名動脈の高解像度磁気共鳴血管造影を未知数3D勾配エコーシーケンスで実行します。スラブの厚さは 1.5 センチメートル、フリップ角度は 45 度、繰り返し時間は 20 ミリ秒、エコー時間は 2.2 ミリ秒、視野は 1.5 x 1.5 x 1.5 センチメートル、マトリックスは 1 28 x 1 28 x 1 28、平均は 4 の数で、合計スキャン時間は約 22 分です。

次に、ROI分析のために鎖骨下分岐部の0.3〜0.5ミリメートル下にあるデノミナイト動脈の軸方向画像を選択します 大動脈を固定し、組織を常にPBSで覆ったままにします。大動脈の球根を左側にして、大動脈を解剖学的位置に置くことから始めます。次に、次の5つの場所に一時的なムニューチンピンを連続して配置します、アーチの3番目の枝の下の大動脈の上部、下行大動脈の下端近くの下降大動脈の中間、および大腿動脈の枝の上。

次に、極細のスプリングハサミを使用して、大腿動脈の左枝から上行大動脈の最も低い枝の下まで大動脈の左側を切り取ります。次に、各枝を切断して固定して内面を露出させた後、組織を固定し続けます。内面全体が露出しており、上からはっきりと見え、ピンからの視覚的な干渉はありません。

脂質を染色し、病変を定量化するには、まず、ピン留めされた大動脈を新たに調製したスーダンフォーまたはオイルレッドO溶液で覆います。50分後、組織を70%イソプロパノールで1〜5分間洗浄し、組織から出る水が赤くなくなるまで大動脈を二重蒸留水で穏やかにすすいでください。次に、大動脈をPBSで覆い、組織の隣に定規を置いて画像のキャリブレーションを支援します。

次に、解剖顕微鏡に取り付けられた高解像度カメラで組織の画像をキャプチャし、画像をTIFFファイルとして保存します。最後に、画像解析ソフトウェアでは、各内膜表面を手動でトレースして、その面積を決定します。次に、自動カラーしきい値を使用して病変領域を計算するには、各画像にしきい値を設定して、病変を正常領域から識別する色の強度を定義します。

アテローム性動脈硬化症病変によって覆われた内膜表面の割合は、p歯肉に感染したマウスを用いたこの代表的な実験で計算できます。体積解析により、感染したマウスは、感染していない対照と比較して有意な骨量減少を示すことが明らかになりました。再建された上顎半身の目視検査は、感染したマウスの臼歯根の露出表面積の増加を示しています アテローム性動脈硬化症になりやすい対照群と比較して。

POE欠損マウス。P gingivalisは、大動脈洞内の歯槽骨減少と炎症性プラーク沈着を促進する慢性炎症を誘発し、最後の感染から24時間後には、最後の感染から24時間後にノミネート動脈を誘導し、これらの代表的な画像のように、感染後のさまざまな時点での連続in vivo、MRIによって生きたマウスで監視できます。さらに、スーダンの4つの染色大動脈の顔の測定では、p歯肉感染が内膜表面の脂質沈着と病変領域を大幅に増加させることが示されています。

さらに、大動脈洞病変の免疫組織化学的分析により、マイクロファージ浸潤の増加と自然免疫受容体Toll様受容体の発現上昇が明らかになりました。この手順を試みる際には、炎症が評価される実験期間の時点が疾患の進行と適切に一致する必要があることを考慮することが重要です。他の人のMRイメージングの後、顔面立位や免疫組織化学などの他の方法を実行して、全体的なアテローム性動脈硬化症の負担や病変の細胞成分などの追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、慢性炎症に関与する宿主因子と病原性因子の両方を調べることができるin vivoマウスモデルについてよく理解できるはずです。病原体を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常にPPEの適切な使用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。