Name: 生物医学研究における牛の肺：視覚ガイド付き気管支鏡検査、気管支内接種およびインビボサンプリングテクニック (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶ気管支鏡検査による気管内接種と肺サンプリング法。子牛モデルを用いて呼吸器感染症の宿主病原体相互作用を研究し、気管支肺胞洗浄や経気管支肺生検で病態経過を追跡する技術を習得できます。

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著者は、彼らの研究に対する資金提供に対して、ドイツ連邦教育研究省（BMBF）に非常に感謝しています。また、著者は、気管支鏡検査の技術支援について、Ines Lemser、Sylke Stahlberg、Ingolf Rücknagel、および動物館(FLI、ドイツ)のチームで働く他のすべての同僚に感謝します。彼らは、マリア・クリスティーナ・ハーゼ(FLI、ドイツ)が文献を提供してくれたことに非常に感謝しています。さらに、著者は、原稿を批判的に読んでくれたAngela Berndt博士(FLI、ドイツ)とNicolette Bestul(ウィスコンシン大学リバーフォールズ校)に感謝の意を表したいと思います。

倫理に関する声明 本研究では、動物の管理と使用に関する欧州と国内法を遵守して実施した。プロトコルは、動物実験の倫理委員会とチューリンゲン州の動物の保護、​​ドイツ（：04-004/11許可番号）によって承認された。全ての実験は動物保護のために認可された機関のエージェントの監督の下で実施した。気管支鏡検査は厳密に全身麻酔下で行った。研究中に、あらゆる努力が不快感や苦痛を最小限にするために行われました。 総説 記載されている技術は、約60〜80 kgの、生後約6〜8週間の子牛のために開発されている。他の大型動物種や年齢や体重の異なる子牛に使用するためには、技術は大きさと重量にフィットし、考慮し、特定の動物種の肺解剖学的構造を取るために適合させなければならない。すべて使用した装置は、無菌でなければならない。 オウム病クラミジアは、ヒトでの呼吸器と一般的疾患を引き起こす可能性が人獣共通細菌である。非鳥類で現在のプロトコルで使用されるオウム病菌株 DC15は、バイオセーフティーレベル2の下で処理されなければならない。病原体や感染動物とのすべての作業は、人工呼吸器、スプラッシュウォータープルーフジャンプスーツ、長靴や手袋などの保護具を着用して行う必要があります。適切な保護マスクを身に着けていることは、非常に重要であるCの感染の自然経路からオウム病はのAerogenです。サンプルの包装及びラベルは、すべてのものは、動物の収容部を離れる前に、メーカーの指示に従って、クラミジアに対する効果的な消毒剤で処理しなければならないので、消毒証明である必要があります。 1。気管支鏡検査のための動物の準備<ol><li>麻酔薬の投与量のための子牛の重量を決定する。 </li><li>静脈内（IV）アクセスiのを配置N左頸静脈。 </li><li>まず、ゆっくりと鎮静が発生した後、（2.0 mg / kgの体重）ケタミンを注入、その後、約30秒間にわたって（0.2 mg / kgの体重）キシラジンを注入。 </li><li>テーブルの上に動物を持ち上げ、右横臥に配置します。動物が適切にテーブルの上に配置されるとIVアクセスが所定の位置にまだあるかどうか確認し、必要に応じて再調整します。麻酔中、定期的に麻酔の深さを決定するために、まぶたの反射を確認してください。 </li><li>動物が着実に呼吸していると、誰かが舌を抜くと首を伸ばす必要があります。わずかに回転運動を使用して、動物の口の中に金属管鏡を配置します。喉頭が表示されるまで、懐中電灯を使用して、視力の制御下に前進鏡を押してください。 </li><li>必要に応じて、7 mgのキシラジンおよび70 mgのケタミンのボーラスを注入することによって、全体の内視鏡手術全体で麻酔を維持。 </li></ol> 2接種（接種サイト：図1） </p&gt; <ol><li> 1、2を含む接種材料との3注射器、および接種物の5ミリリットルを用意します。 </li><li>内視鏡のワーキングチャンネルにテフロンチューブを挿入します。チューブは、内視鏡の先端から突出しないようにしてください。 </li><li>金属鏡を通して内視鏡を挿入します。鏡のわずかな再調整は、喉頭の通過を可能にするために必要な場合があります。右側に分岐し、モニターに画像を位置合わせするために役立ちます気管支気管 、。 </li><li>テフロンチューブの先端に5ミリリットル接種で注射器を取り付けます。接種物が堆積されなければならない枝にチューブを移動し、所望の量（右肺適用されます。 葉中殿 ：0.5ミリリットルを、 葉の補助器官 ：0.5ミリリットル、 葉は尾側 ：0.5ミリリットルと1.0ミリリットルを、左肺： 葉は、Parsでcranialをcranial ：0.5ミリリットル、Parsで尾 ：0.5ミリリットル、 葉は尾側 ：1.5ミリリットル）を。 1で注射器を取り付け＆＃160;チューブミリリットルの接種材料は、 気管支気管に移動し、（ 葉のcranial、Parsで尾 ：1.0ミリリットル）の接種材料を堆積させる。それは、常に同じ順序でローカライズにアプローチすることが有用である。 </li><li>内視鏡と鏡を取り外します。 </li><li>アクチュエータで各鼻孔に接種物の1ミリリットルスプレーします。 </li><li>戻って安定したの動物を持参し、目を覚ますために発生しやすい位置に配置します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人または他の動物の会社で動物を放置しないでください。体温調節のための動物の能力は全身麻酔下で減少するため、回復、安定には、エアコンがなければならない。 注：最初の臨床症状は使わ病原体に応じて、接種後約24〜36時間後に発生する必要があります。 </li></ol> 3サンプリング手順（サンプリングサイト：図2） <ol><li>ステップ1.1〜1.6で説明したように動物を準備します。 </li><li>気管支肺胞洗浄<ol><li>水浴中で、滅菌等張食塩水20ミリリットルを含む5シリンジそれぞれを配置し、それらを約38℃まで昇温することができます</li><li>内視鏡のワーキングチャンネルに洗浄カテーテルを挿入し、金属鏡内視鏡を挿入し、内視鏡は、さらに先のいずれかを押すことができない場合、「ウェッジ位置」に達するまで左肺の主気管支にナビゲートする。 </li><li>相次いで、洗浄カテーテルに温かいNaCl溶液で注射器を取り付け、液体を浸透し、それを直接吸引除去する。気管支肺胞洗浄液は、シリコン処理ガラスびんに保存され、ガラス表面に付着する肺胞マクロファージを防ぐために、すぐに回復した後、氷上に置かれている必要があります。点滴の生理食塩水の量​​と、回収液量の両方に注意してください。 </li><li>作業チャネルから洗浄カテーテルを取り外します。 </li></ol></li><li>気管支ブラッシング<ol><li>記述されたプロトコルで、これは気管分岐部で、所望のサンプリングの場所に内視鏡を移動します。 </li><li>ブラシの先端がモニターに表示されるまで、内視鏡の作業チャネルに挿入する前に、チューブブラシをカバーしています。 </li><li>ブラッシングする場所にナビゲートして、ハンドルを押して、約5cm前進プラスチックチューブブラシを押して、プラスチック管からそれを明らかにします。 </li><li>ブラシと気管支の壁との間の接触を確実にするために、内視鏡をナビゲートしながら、ゆっくりと前後​​にブラシを押し引きすることによって上皮の呼び出しをこすり。出血が発生したときにこすり停止します。作業チャネルから引き出し前にチューブブラシをカバーしています。 </li><li>そっとスライド上でブラシを転がすことによって顕微鏡スライド上の5スメアまで準備します。 -20℃で10分、空気乾燥して保存するための冷メタノール中でスミアを固定</li><li>ブラシでリンスすることができますサンプリングされたセルの目的に応じて種々の媒体。同じブラシで複数のブラッシングを取った場合、唯一の粘膜を刺激しないメディアでそれを洗い流してください。 </li></ol></li><li>経気管支的肺生検<ol><li>記述されたプロトコルで、これは葉のcranialの扁平部尾で、所望のサンプリングの場所に内視鏡を移動します。作業チャネルのオープンに生検鉗子を挿入する前に、それがスムーズに動作することを確認し、それを数回を閉じる。 </li><li>若干の抵抗が発生するまで気管気管支の尾ブランチに生検鉗子を押してください。 、鉗子を開い前進約2cmを押し、鉗子を閉じて、引き戻すと作業チャネルから鉗子を外し、バック2〜3センチメートルを引っ張る。これはいくつかの練習が必要です。 </li><li>慎重に針や小さなピンセットを用いて、生検鉗子から組織を除去する。組織のさらなる用途に応じて、液体nitrに保管プラスミン又は適切な固定媒体。これは自己分解プロセスを防止するために除去した後に権利が起こるはずです。 </li></ol></li><li>術後の治療<ol><li>戻って安定したの動物を持参し、目を覚ますために発生しやすい位置に配置します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人または他の動物の会社で動物を放置しないでください。体温調節のための動物の能力は全身麻酔下で減少するため、回復、安定には、エアコンがなければならない。 </li><li>次の24時間、気胸の兆候が密接に動物を監視します。動物が完全な意識を取り戻したとき、フィード、新鮮な水を提供しています。 </li></ol></li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

接種の気管支鏡法が開発され、種々の気管支サンプリング方法は、実験条件下で大動物において使用されるように適合させた。記載されている技術はあっても、内視鏡検査ではほとんど経験のある審査官のため、習得が容易である。気管支鏡検査の過程は、低侵襲であり、接種の方法に関連する有害作用だけでなく、説明したサンプリング法（BAL、経気管支肺生検、気管支ブラッシング）は、これまでの動物のいずれにも見られなかった。ヒトでの経気管支肺生検に伴う合併症は、出血していると気胸48、これらはいずれも、この手順を受けた子牛に見られた。経気管支肺生検ではより多くの時間がかかり、経皮的方法より機器を必要としますが、低侵襲で、創感染のリスクを負いません。 inoculatの視覚的に制御し、内視鏡的方法イオンは、肺の特定の部位で病原体の規定された量の堆積を可能にする。したがって、すべての接種した動物において非常に一貫性のある32-34臨床的および病理学的所見をもたらす。しかし、子牛に自然感染のすべての機能に似ていない。呼吸器Cのモデルでは自然に院内感染で子牛は通常、頂端ローブの肺炎を発症するのに対し、 オウム病感染 、接種の記載された技術は、病原体の配置34のサイトに関連した肺病変につながった。この事実は、ウシの天然取得した肺感染症のコンテキストで実験結果の妥当性を解釈する際に考慮に入れなければならない。 Videoendoscopic BALは肺の定義された領域をサンプリングできます。実験目的のために、これは、ブラインド条件下で鼻腔カテーテルの使用に比べて利点である。原因ウシ肺の解剖学的構造に、盲目的に挿入されたカテーテルは、プッシュになるほとんどの場合53,54の右横隔膜葉にEDと審査官はを洗浄され、肺の区域に影響を与えない。横臥位、麻酔子牛における内視鏡BALのもう一つの利点は、80％以上の点眼液の高い平均回収率である。他の研究との比較が立ち、鎮静ふくらはぎ、133.3±1.6ミリリットル46の回復と127.13±3.53ミリリットル45で尾葉に流体240ミリリットルの点滴後に報告されている、ことを明らかにしている。胸骨横臥位での鎮静の子牛に点滴注入した流体の51％が尾葉43から頭蓋ローブと62％を回収することができた。これは点眼液の約半分は、子牛の直立した状態で回収できることを意味している。さらに、試料調製のために必要な、BALFの量に応じて、これは、すべての必要な実験を行うために十分な材料を残していない可能性があります。牛のBALは、多くの研究グループによって使用され、多くされています異なるパラメータは、種々の条件下で試験されてきた。ほとんどの著者は、基礎のローブ43,45,46の洗浄を行ったが、洗浄のために使用される流体の量は、研究グループの間で異なる。これは、困難な異なる刊行物からの結果を比較すること、回収された細胞、タンパク質および他の物質の希釈に矛盾をもたらす。このため、牛に使用するためには点眼後すぐに回収される20ミリリットルの5画分（ すなわち、合計100ミリリットル）の体暖かい、等張食塩水で洗浄することを推奨します。大口径（ すなわち、&gt; 2mm）を洗浄カテーテルを使用する場合、各画分の体積はわずかにカテーテルに残る流体の量に応じて大きくする必要がある。 ウシの肺の高度にセグメント化された解剖学の方法論の制限につながる。肺の一部から得られた結果は、肺の他の部分には当てはまらないかもしれません。全く存在しないので経気管支生検および洗浄によりプローブされ、全肺領域の視界制御、審査官は、サンプリングされた領域は、健康や​​病気のであったかどうかを知ることができない。したがって、病原体が病原体のより高い回収率を有するようにし、罹患肺領域をサンプリングするより高い可能性を有するために以前に接種した場所をサンプリングすることが非常に重要である。他の制限は、不良な臨床状態の動物での増加麻酔リスクです。記載された方法は、可能な限り低く動物のための負担を維持する疾患軽度から中等度のモデルで使用されるべきである。第一胃内のガス開発は、これらの種の麻酔リスクを増大させるように反芻動物の全身麻酔は常に、可能な限り短くする必要があります。動物は、気管支鏡が開発されたガスの流出を可能​​にするためにした直後に発生しやすい位置に配置する必要があり、それらは完全に麻酔から回復するまで、厳重に監視されなければならない。また、記載されている技術は、吹田ではありません未満24時間の間隔をサンプリングするためのBLE。 記載されているプロトコルは、他の感染因子に適合させることができる。種々の病原体の接種の内視鏡は、例えばC.として、記載されているオウム病 32〜34、 パスツレラヘモリチカ 38-40,42、 ヘモフィルスsomni 55、およびウシウイルス性下痢ウイルス44。また、肺の中の病原体の付着物のサイトが必要なモデルに適合させることができる。サンプリング地点を選択する際に、いくつかの重要な事実を考慮しなければならない：（i）のサンプリング部位は、接種の位置に、予想される病理学的所見に基づいて選択されるべきである。剖検の世話を行う場合には（II）ex vivoでのサンプリングのための十分なサンプリングされない肺の領域を残すように注意する必要があります。彼らは機器に到達できるように（III）サンプリングサイトの場所を選択する必要があります。特に経気管支肺生検のために、生検鉗子の長さに起因する制限があります。 （iv）のTサンプリングの彼順序が重要である、気管支ブラッシングと経気管支肺生検は、BALFを汚染であろう、少量の出血につながる可能性があります。したがって、BALFは常に最初に取得する必要があります。他の種におけるプロトコルを使用する場合、種特異的な肺の解剖学的構造を考慮しなければならない。

生物医学研究における大型動物モデルの値は哺乳類生物内 - 健康や病気の状態に関連する - 現代の学際的な生物医学研究では、動物モデルは、まだ複雑な相互作用を解明することが不可欠である。研究の1％未満が家畜で作業している間、生物医学研究1のモデルとしてウシ、ウマ、ヒツジ、または家禽を研究し、科学者に授与されている17ノーベル賞にもかかわらず、動物実験の頃は大部分は、げっ歯類で行われているまたは家畜。 小動物は多くの実用的な利点（ すなわち 、低コスト、遺伝可 ​​鍛性、高スループット、数々の遺伝の可用性、および免疫学のツールおよびキット）を提供し、遺伝子改変されたマウスモデルは、一般に、特定の分子経路を発見する機構研究を行うために受け入れられています。複雑なシステムの生物医学研究、T中彼は生物学的な関連性とマウスモデルの臨床的有用​​性はますます疑わしいなってきています。彼らは、誤解を招くことと生物学的複雑2-9の単純化のリスクを負う可能性があります。 により種間の特殊性のために、単一の動物種は完全に人間のような状況を反映していないし、複数のモデルを使用すると、学際的な生物医学研究のアプローチで有益であると思われる。トランスレーショナル医学の文脈では、大型動物は、比較モデルは、人間と動物の健康1の両方のデュアルユースの高い生物学的関連性を持つ結果を提供するように機能する機会を提供しています。驚くべきことに、ヒトのゲノムは、より密接に実験用げっ歯類のゲノムによってよりウシゲノムにより似ている。また、他の分類群と比較して、マウスのゲノムがはるか10-12再配置であることが最近確認された。 複雑な研究​​デザインでは、家畜の使用はuniqはを提供しています動物を犠牲にすることなく、1アンド·同じindividuumから、生体内で種々のサンプルを繰り返しコレクションによる個人内、長期試験のUEの機会。したがって、機能性、炎症性および形態学的変化は、13時間の一定期間にわたって同じ被験体においてモニターすることができる。 適切な呼吸モデルとしてウシ肺原因の肺の解剖学、呼吸生理学、肺免疫学の有意差の数が多いと、マウスは、ヒトの肺疾患の多くの重要な病態生理学的な側面を再現していません。呼吸器疾患の動物モデルとしてそれらを使用する場合に考慮しなければならない2,9,14-16。解剖学や構造物の特殊性は、それぞれ、哺乳類の肺のために存在しないが、機能的特性（ すなわち肺気量、気流、呼吸力学）は、同様の体重に成人とふくらはぎの間のより良い比較可能（50 kg）で。 次のように牛の肺の種特異的な特性がまとめられている：左の肺は2葉（2つのセグメントに分割される葉のcranial、および葉の尾 ）で構成され、右肺が4葉で構成されている間（ 葉cranial、葉中殿、葉の尾 、そして葉の補助器官 ）。他のほとんどの哺乳類の肺の解剖学とは違って、気管の右横側から直接右頭蓋葉枝の気管支。解剖学的構造をsubgrossに関しては、ウシ肺分葉性の高い、比較的低い比肺コンプライアンスと高い肺組織抵抗19に至る間質組織17,18の高い割合を示している。したがって、必要な呼吸活動は、他の種20,21に比べてかなり高い。高度の分葉は、セグメントの強力な独立性をもたらす。このように、INFlammatoryプロセスは、結合組織中隔によって制限され、病気のおよび健康なセグメントは、多くの場合、同じローブ内にある。により担保気道の不足のために、ウシ肺閉塞性肺機能障害13をミラーに特に適している。ウシの肺の中の血管系に関しては、小さな肺動脈は非常に著名な平滑筋層を示しています。そのため、子牛はまた、肺高血圧症や血管リモデリング22〜24の老舗動物モデルとして機能することができる。 呼吸器感染症に関しては、天然に存在する疾患が男性に匹敵する疾患と多くの類似点を共有して家畜に存在する。典型的な例は、ウシ結核25、呼吸器合胞体ウイルスふくらはぎ26-28における（RSV）の感染症、または天然に取得したクラミジア感染症である29。従って、大型動物モデルは密接に自然宿主の状況に似てない。したがって、彼らはほとんどのUSEFです宿主-病原体相互作用と人間30,31の対応する疾患の複雑な病態生理を研究するためのUL。 ウシは、この病原体32〜35のための自然なホストを表すため、呼吸オウム病クラミジア感染症の生物学的に関連モデルとして、子牛が選ばれた。動物とヒトの間に病気や可能な伝送ルートの病因に関連して、このモデルから得られた情報は、牛と人間の両方の影響を私たちの知識を広げるのに役立ちます。モデルはまた、肺での除去のため、一般的に受け入れられ、代替的な治療オプションを確認するのに役立ちます獣医および人間医学の両方において重要で、再び、あるオウム病感染 、。 ウシ呼吸器システムから得られるとし、試験片の適用技術本稿では説明し、技術や診断方法を示してapplicablウシの肺へのEと哺乳類の肺および治療的介入の有効性に関する病原体の両方の効果を評価するために、我々のモデルで使用される。 気管支鏡検査は、1960年代からヒトの医療で行われており、安全な手順36と見なされます。子牛では、実験的な気管支鏡は、初めて37 1968年に記載された。病原体の気管支内のアプリケーションは、子牛38で下気道疾患を製造するための信頼性のある方法として。ポットヒーテルらによって提案され、現在はウシの研究34,39,40で広まっ方法ですした。 videoendoscopic管理下に病原体の規定された量の気管支内接種は、肺の中の感染性物質を選択的に配置することができます。これは、34全ての動物において一貫した臨床的および病理学的所見をもたらし、病原体による露光に変更されることが予想される肺領域を標的サンプリングを可能にする。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; 気管支肺胞洗浄液 （BALF）は、肺の炎症の有無や重症度によく説明さ指標である。気管支肺胞洗浄（BAL）を呼吸器疾患41の様々な診断のための人間の医学の標準的な手順である。生体牛では、BALは前世紀42の70年代後半ウィルキーとマーカムによって導入されました。これは、牛の下気道を研究するため、安全で再現性のある技術と考えられていた。原因1988プリングルら健康な動物におけるBALFパラメータに関する十分なデータの不足のため、 フレキシブル光ファイバー気管支鏡で健康的な牛にBALを行った。著者らはまた、同等の結果43を取得する実験条件下でBALプロトコルを標準化する必要性を指摘した。 BALは依然としてふくらはぎ44-46におけるインビボサンプリング方法として使用される。 気管支ブラッシングは、一般に、人間の医学で使用されている腫瘍性病変または微生物学的分析のために36をサンプリングする診断ツール。研究目的のために、細胞学的ブラッシングによって採取した上皮細胞の初代細胞培養物は、47を得ることができる。ウシにおいて、微生物学的分析のために気管支ブラッシングの使用は、肺43の微生物環境を特徴付けるために記載されている。 経気管支肺生検は、肺組織サンプルを提供し、ヒトでのびまん性肺疾患のための貴重な診断ツールです。医原性気胸と手続きに関連した出血は、この技術に関連した合併症である。それらの発生率は、ヒト患者48に1％未満であると報告されている。経気管支肺生検が必要な機器の高コストおよび生検を得るために必要な時間のために牛に使用するための一般的な方法ではない。その代わりに、経皮的肺生検は、フィールドの条件の下で49-51の方が便利です。

<table><tbody><tr><td>獣医用ビデオ内視鏡</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany</td><td>PV-SG 22&ndash;140</td><td>直径:9 mm、作業チャネル:2.2 mm、作業長さ 140 cm</td></tr><tr><td>洗浄カテーテル</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG、トゥットリンゲン、ドイツ</td><td></td><td>直径:2 mm; 長さ:180 cm、ルアーロックアダプター</td></tr><tr><td>アクチュエータ</td><td>WEPA Apothekenbedarf GmbH &Co KG, Hillscheid, Germany</td><td>32660</td><td>長さ: 60 mm</td></tr><tr><td>生検鉗子</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany</td><td>REF 60180LT</td><td>1.8 mm, 鋸歯状, 楕円形</td></tr><tr><td>Omnifix 20 ml, Luer-Lock</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>4617207V</td><td></td></tr><tr><td>Cytology brush</td><td>mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany</td><td>110240-10</td><td>作業長 180 cm, ブラシの長さ: 15 mm, 直径 1.8 mm</td></tr><tr><td>iv acess</td><td>Henry Schein Vet GmbH, Hamburg,</td><td>Germany 370-211</td><td>直径: 1.2 mm; 長さ: 43 mm</td></tr><tr><td>Rompun 2% (キシラジン)</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td><td></td><td>0.2 mg/kg 体重</td></tr><tr><td>Ketamin 10% (ketamine)</td><td>bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany</td><td></td><td>2.0 mg/kg 体重</td></tr><tr><td>等張性生理食塩水</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td></td>3200950</tr><tr><td>SUB 6 ウォーターバス</td><td>CLF analytische Laborger&auml;te GmbH, Emersacker, Germany</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Metal tube speculum</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>diameter: 3.5 cm; length: 35 cm</td></tr><tr><td>Flashlight</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized glass bottles</td> n<td>/a</td><td></td><td>siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)</td></tr><tr><td>Omnifix Luer 3 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>OmnifixLuer 5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>4616057V</td><td></td></tr><tr><td>Sealing plugs</td><td>Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany</td><td>900-3057</td><td></td></tr><tr><td>Inoculum</td><td></td><td>n/a</td><td>dilute pathogen in 8 ml buffer</td></tr></tbody></table>

生物医学研究における牛の肺：視覚ガイド付き気管支鏡検査、気管支内接種および<em&gt;インビボ</em&gt;サンプリングテクニック

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

呼吸器内科の研究における代替動物モデルのための継続的な検索があります。研究の目的に応じて、肺疾患のモデルとして大型動物は、多くの場合、マウスが行うよりもはるかに優れたヒトの肺の状況に似ている。大型動物での作業はまた、動物を犠牲にすることなく、長期的な研究を可能にする時間、一定の経過とともに、繰り返し同じ動物をサンプリングする機会を提供しています。 目的は、呼吸オウム病クラミジア感染の牛のモデルで使用するためのin vivoでのサンプリング方法を確立することであった。サンプリングは、試験中に各動物に種々の時点で行われるべきであり、サンプルは実験条件下での宿主応答、ならびに病原体を研究するのに適しているべきである。 気管支鏡検査は、ヒトおよび獣医学において貴重な診断ツールである。それは、安全かつ低侵襲的処置である。この北極LEは、気管支内の子牛の接種だけでなく、下気道のサンプリングの方法について説明します。 Videoendoscopicは、気管支内接種は、全ての接種された動物において非常に一貫性のある臨床的および病理学的知見につながるとされ、したがって、感染性肺疾患のモデルで使用するために適し。記載されたサンプリングの方法は、気管支肺胞洗浄、気管支ブラッシングと経気管支肺生検である。これらのすべては、ヒト医学において有用な診断ツールである6-8週齢の子牛に、実験目的のために適合させることができる。得られた試​​料は、宿主における肺の炎症の重症度の病原体検出および特徴付けの両方に適していた。

病気の経過動物の健康への病原体の効果は、臨床検査によって評価することができる。我々の呼吸器感染モデルにおいて、動物は1日2回検査し、臨床的観察は、スコアリングシステムを用いて記録した。追加情報は、 例えば他のインビボのサンプリング法、血液の収集およびスワブまたは肺機能測定を実行することによって捕捉した。病理学的検査は、感染32〜34の進行を記述するために、接種後の異なる時点で行った。 BALF回収率点眼液の回収率は83.05±4.58％であった（平均±SD）。 病原体検出病原体の再培養は、気管支ブラッシングから行うことができる。また、種々のサンプルのPCRスクリーニングは、例えば TIの、病原体を検出することができるssue生検、細胞診ブラシサンプル、BALF細胞52または咽頭ぬぐい液。病原体の可視化は、肺生検およびBALF細胞（ 図3）の沈降製剤の凍結切片の免疫組織化学を行うことによって可能である。以前の実験では、血液サンプル及びスワブ（結膜、糞便、鼻）のPCRを、拡散および病原体32の脱落を特徴付けるために実施した。 肺組織の局所炎症のマーカー BALFにおいて、肺の炎症の種々のパラメータを研究することができる。肺の炎症が存在する場合には総細胞数及び好中球の割合は、通常、増加する。細胞分化については、BALF細胞の沈降製剤はギムザに従って染色し、油浸（ 図4）を用いて分化させることができる。 BALFの細胞と液体の比率を遠心分離（; 20分300×g）で区切られています。 BALF·上清を、肺における炎症プロセスの間に変化様々なマーカーが含まれており、実験条件下で研究することができる。例としては、全タンパク質およびエイコサノイド29,34です。 記載されたサンプルの電位さらなる使用の概略図を図5に示されている。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig1highres.jpg" width="500" /> 接種部位（黄色）とウシの肺の図1。スキーム。数字は、接種材料が異なる気管支内に投与される順序を示している。 R：右; L：左。右肺：1 葉中殿 ：0.5ミリリットル、2 葉の補助器官 ：0.5ミリリットル、3 葉尾 ：0.5ミリリットルと1.0ミリリットル4;左肺： 葉のcranial、 <strong&gt; 5 Parsではcranial：0.5ミリリットル、6 Parsで尾 ：0.5ミリリットル、7 葉尾 ：1.5ミリリットル、8 葉のcranial、Parsで尾 ：1.0ミリリットル。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig2highres.jpg" width="500" /> 。図2接種部位（黄色）とサンプリングサイトとウシの肺のスキーム：気管支肺胞洗浄（青）、気管支ブラッシング（緑）、肺生検（オレンジ）は、すべてのサンプルは、病原体が付着していた地域から得ていることに注意してください前。 R：右、L：左。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig3highres.jpg" width="500" /> クロロフィルを接種した子牛から図3 A）肺生検<html> amydiaオウム病は、接種後4日目（dpi）に、b）の子牛からのBALFの細胞沈降物を接種したC.オウム病 9解像度。クラミジアのための免疫組織化学的ラベリング。クラミジア封入体（矢印）は、肺において（a）および肺胞マクロファージ（b）の中に存在する。ヘマトキシリン​​対比。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。Cに接種した子牛からのBALFの細胞堆積物オウム病 9解像度。肺胞マクロファージ（＃）は、BALF中の主要な細胞型である。炎症プロセスが存在する場合、好中球顆粒球の量（*）が増加する。修正されたパッペンハイム染色。 es.jpg &quot;幅=&quot; 600 &quot;/&gt; 図5。サンプル調製のための可能な方法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51557/51557fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

この記事では、実験条件下で牛の肺における気管支鏡技術、 すなわち気管支鏡ガイド付き接種、気管支肺胞洗浄、気管支ブラッシングし、経気管支肺生検を説明しています。

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

本実験の目的は、呼吸器感染症のウシモデルを用いて、宿主と病原体の相互作用を研究することである。これは、目的の病原体を気管内に接種して子牛に呼吸器感染症を誘発し、疾患の経過中に観察することで達成される。動物からは、気管支肺胞洗浄液によるサンプリングを繰り返し行う。次に、上皮細胞を回収するために気管支ブラシ採取を、肺組織サンプルを回収するために経気管支肺生検をそれぞれ行います。最終的に、洗浄液における炎症性変化、細胞診、および免疫組織化学的な病原体検出などによって、病原体特異的な呼吸器疾患を確認することができます。この大型動物モデルの他の既存の動物モデルやげっ歯類と比較した主な利点は、繰り返しサンプリングを行うことで、同一個体における疾患の経過を長期間にわたって研究できる点にあります。この手法は、in vivoにおける宿主と病原体の相互作用に関する知見を提供できますが、他の病原体や宿主種などの異なる系にも適用可能です。麻酔の維持およびサンプリングの補助は、当研究室の獣医師であるフィッシャーが行います。処置を開始する前に、3本のシリンジに接種液をそれぞれ1 mL、2 mL、5 mLずつ充填してください。麻酔が完了したことを確認した後、動物の舌を引き出し、頸部を伸展させます。次に、軽く回転させるようにして、金属製スペキュラムを動物の口内に挿入します。懐中電灯を用いて喉頭が視認できるか確認しながら、視覚的にコントロールしつつスペキュラムを前方へ押し進めます。次に、内視鏡のワーキングチャンネルにテフロンチューブを挿入します。チューブが内視鏡の先端から突き出ないようにしてください。その後、内視鏡を腟鏡を通して挿入します。内視鏡を挿入可能にするために、クスコ（腟鏡）をわずかに調整する必要がある場合があります。喉頭を通過させる際は、肺の右側に分岐している気管支を利用して、モニター上の画像を調整します。その後、5 mLの接種液が入ったシリンジをテフロンチューブの先端に取り付けます。チューブを接種物を注入する分枝まで進め、適切な量の接種物を投与します。次に、1 mLの接種物が入ったシリンジをチューブに接続します。気管支まで進め、側枝に接種物を注入します。内視鏡と膣鏡（または鼻鏡）を取り除きます。次に、最後のシリンジをアクチュエータに取り付け、各鼻孔に1 mLの接種液をスプレーします。動物を腹臥位のままケージに戻し、覚醒させます。回復室はエアコンで温度調節されている必要があります。全身麻酔下では動物の体温調節能が低下するため、サンプリングの目的の時間にバルブサンプルを採取できるよう、滅菌等張生理食塩水を20 millilitersずつ入れた5本のシリンジを38 °Cの温水バスで加温しておきます。その後、洗浄カテーテルを内視鏡のワーキングチャンネルに挿入し、内視鏡を金属製スペキュラムに挿入します。次に、ウェッジポジションに達し、内視鏡をそれ以上前方に進めることができなくなるまで、左肺の主気管支内を前進します。その後、1つずつ順に、温めた塩化ナトリウム溶液が入ったシリンジを洗浄カテーテルに接続し、液体の注入と直接的な吸引を行います。肺胞マクロファージのガラス表面への付着を防ぐため、回収後すぐに気管支肺胞洗浄液をシリコン化ガラス瓶に入れ、氷上で保存してください。注入した生理食塩水の量と回収した液量の両方を記録します。その後、上皮細胞を採取するために、ワーキングチャンネルから洗浄カテーテルを取り出します。次に、内視鏡を目的のサンプリング部位まで移動させます。例えば、本実験では気管分岐部まで進めます。内視鏡が定位置に到達したら、気管支ブラシをチューブで覆い、ブラシの先端がモニターに映るまで内視鏡の処置具チャンネルに挿入します。その後、ブラシとプラスチックチューブを前方へ約5 cm押し進めます。次に、ブラシのハンドルを押し、プラスチックチューブから露出させます。ブラシが所定の位置にきたら、洗浄したい部位まで誘導します。その後、内視鏡を操作しながら、ブラシをゆっくりと前後に動かします。上皮細胞を掻き出すため、ブラシが気管支壁に確実に接触するようにします。出血が見られた時点で掻き出しを停止してください。その後、ブラシをチューブで覆い、処置チャンネルから引き抜きます。上皮細胞を塗布したブラシを最大5枚の顕微鏡スライドガラス上で緩やかに転がし、塗抹標本を冷メタノールで10分間固定します。その後、スライドを風乾させ、経気管支肺生検を行うまで-20°Cで保存します。次に、内視鏡を目的のサンプリング部位まで進めます。例えば、本実験におけるLOAsのpars Alisのように、生検鉗子を作業チャンネルに挿入する前に、数回開閉して適切に機能することを確認し、その後、わずかな抵抗が感じられるまで気管支の側枝に鉗子を押し進めます。次に、2〜3 cm引き戻して鉗子を開きます。再び鉗子を約2 cm前方に押し進め、その後、鉗子を閉じます。鉗子を後方に引き、ワーキングチャンネルから取り出します。針を用いて生検鉗子から組織を慎重に取り除き、自己融解の進行を防ぐために適切な固定液に保存します。最後に、子牛を個室で回復させ、飼料と新鮮な水を与えながら、その後24時間、気胸の有無を再度モニタリングします。動物が完全に意識を回復した後、経気管支肺生検の凍結切片を免疫組織化学的に染色することができます。接種した病原体を可視化するため、サンプリングの4日前にクラミジアを接種したこの動物の肺における、褐色のクラミジア封入体に注目してください。免疫組織化学的な洗浄細胞の染色は、細胞内病原体の可視化を可能にします。例えば、この画像では、子牛から採取した肺胞マクロファージ内にクラミジア包含体が認められます。クラミジアの気管内接種から9日後にCTACが観察されます。気管支肺胞洗浄細胞は、細胞学的染色によって識別することが可能です。肺胞マクロファージは、肺洗浄液の中で主要な細胞型です。しかし、炎症過程が存在する場合、好中球性顆粒球の数が増加します。習熟すれば、適切に行うことで、接種は10〜15分、サンプリングは20〜30分で完了できます。このビデオを視聴することで、麻酔下にある動物における気管支内接種および送子、ならびに気管支肺胞洗浄液、気管支刷細胞採取、および経気管支肺生検のサンプリング方法について十分に理解できるはずです。

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Medicine

医学

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