生物医学研究における牛の肺：視覚ガイド付き気管支鏡検査、気管支内接種および

本実験の目的は、呼吸器感染症のウシモデルを用いて、宿主と病原体の相互作用を研究することである。これは、目的の病原体を気管内に接種して子牛に呼吸器感染症を誘発し、疾患の経過中に観察することで達成される。動物からは、気管支肺胞洗浄液によるサンプリングを繰り返し行う。

次に、上皮細胞を回収するために気管支ブラシ採取を、肺組織サンプルを回収するために経気管支肺生検をそれぞれ行います。最終的に、洗浄液における炎症性変化、細胞診、および免疫組織化学的な病原体検出などによって、病原体特異的な呼吸器疾患を確認することができます。この大型動物モデルの他の既存の動物モデルやげっ歯類と比較した主な利点は、繰り返しサンプリングを行うことで、同一個体における疾患の経過を長期間にわたって研究できる点にあります。

この手法は、in vivoにおける宿主と病原体の相互作用に関する知見を提供できますが、他の病原体や宿主種などの異なる系にも適用可能です。麻酔の維持およびサンプリングの補助は、当研究室の獣医師であるフィッシャーが行います。処置を開始する前に、3本のシリンジに接種液をそれぞれ1 mL、2 mL、5 mLずつ充填してください。

麻酔が完了したことを確認した後、動物の舌を引き出し、頸部を伸展させます。次に、軽く回転させるようにして、金属製スペキュラムを動物の口内に挿入します。懐中電灯を用いて喉頭が視認できるか確認しながら、視覚的にコントロールしつつスペキュラムを前方へ押し進めます。

次に、内視鏡のワーキングチャンネルにテフロンチューブを挿入します。チューブが内視鏡の先端から突き出ないようにしてください。その後、内視鏡を腟鏡を通して挿入します。

内視鏡を挿入可能にするために、クスコ（腟鏡）をわずかに調整する必要がある場合があります。喉頭を通過させる際は、肺の右側に分岐している気管支を利用して、モニター上の画像を調整します。その後、5 mLの接種液が入ったシリンジをテフロンチューブの先端に取り付けます。

チューブを接種物を注入する分枝まで進め、適切な量の接種物を投与します。次に、1 mLの接種物が入ったシリンジをチューブに接続します。気管支まで進め、側枝に接種物を注入します。

内視鏡と膣鏡（または鼻鏡）を取り除きます。次に、最後のシリンジをアクチュエータに取り付け、各鼻孔に1 mLの接種液をスプレーします。動物を腹臥位のままケージに戻し、覚醒させます。

回復室はエアコンで温度調節されている必要があります。全身麻酔下では動物の体温調節能が低下するため、サンプリングの目的の時間にバルブサンプルを採取できるよう、滅菌等張生理食塩水を20 millilitersずつ入れた5本のシリンジを38 °Cの温水バスで加温しておきます。その後、洗浄カテーテルを内視鏡のワーキングチャンネルに挿入し、内視鏡を金属製スペキュラムに挿入します。

次に、ウェッジポジションに達し、内視鏡をそれ以上前方に進めることができなくなるまで、左肺の主気管支内を前進します。その後、1つずつ順に、温めた塩化ナトリウム溶液が入ったシリンジを洗浄カテーテルに接続し、液体の注入と直接的な吸引を行います。

肺胞マクロファージのガラス表面への付着を防ぐため、回収後すぐに気管支肺胞洗浄液をシリコン化ガラス瓶に入れ、氷上で保存してください。注入した生理食塩水の量と回収した液量の両方を記録します。その後、上皮細胞を採取するために、ワーキングチャンネルから洗浄カテーテルを取り出します。

次に、内視鏡を目的のサンプリング部位まで移動させます。例えば、本実験では気管分岐部まで進めます。内視鏡が定位置に到達したら、気管支ブラシをチューブで覆い、ブラシの先端がモニターに映るまで内視鏡の処置具チャンネルに挿入します。その後、ブラシとプラスチックチューブを前方へ約5 cm押し進めます。

次に、ブラシのハンドルを押し、プラスチックチューブから露出させます。ブラシが所定の位置にきたら、洗浄したい部位まで誘導します。その後、内視鏡を操作しながら、ブラシをゆっくりと前後に動かします。

上皮細胞を掻き出すため、ブラシが気管支壁に確実に接触するようにします。出血が見られた時点で掻き出しを停止してください。その後、ブラシをチューブで覆い、処置チャンネルから引き抜きます。

上皮細胞を塗布したブラシを最大5枚の顕微鏡スライドガラス上で緩やかに転がし、塗抹標本を冷メタノールで10分間固定します。その後、スライドを風乾させ、経気管支肺生検を行うまで-20°Cで保存します。次に、内視鏡を目的のサンプリング部位まで進めます。

例えば、本実験におけるLOAsのpars Alisのように、生検鉗子を作業チャンネルに挿入する前に、数回開閉して適切に機能することを確認し、その後、わずかな抵抗が感じられるまで気管支の側枝に鉗子を押し進めます。次に、2〜3 cm引き戻して鉗子を開きます。再び鉗子を約2 cm前方に押し進め、その後、鉗子を閉じます。

鉗子を後方に引き、ワーキングチャンネルから取り出します。針を用いて生検鉗子から組織を慎重に取り除き、自己融解の進行を防ぐために適切な固定液に保存します。最後に、子牛を個室で回復させ、飼料と新鮮な水を与えながら、その後24時間、気胸の有無を再度モニタリングします。

動物が完全に意識を回復した後、経気管支肺生検の凍結切片を免疫組織化学的に染色することができます。接種した病原体を可視化するため、サンプリングの4日前にクラミジアを接種したこの動物の肺における、褐色のクラミジア封入体に注目してください。免疫組織化学的な洗浄細胞の染色は、細胞内病原体の可視化を可能にします。

例えば、この画像では、子牛から採取した肺胞マクロファージ内にクラミジア包含体が認められます。クラミジアの気管内接種から9日後にCTACが観察されます。気管支肺胞洗浄細胞は、細胞学的染色によって識別することが可能です。

肺胞マクロファージは、肺洗浄液の中で主要な細胞型です。しかし、炎症過程が存在する場合、好中球性顆粒球の数が増加します。習熟すれば、適切に行うことで、接種は10〜15分、サンプリングは20〜30分で完了できます。

このビデオを視聴することで、麻酔下にある動物における気管支内接種および送子、ならびに気管支肺胞洗浄液、気管支刷細胞採取、および経気管支肺生検のサンプリング方法について十分に理解できるはずです。