切断断片の検出と電流測定を組み合わせることにより、上皮性ナトリウムチャネル（ENaCの）のタンパク質分解活性の実証

本実験の目的は、Xenopus oocytesに異種発現させた上皮性ナトリウムチャネル（ENaC）に対するプロテアーゼの影響を調べることです。まず、卵母細胞におけるアモロミド感受性全細胞電流を測定します。その後、卵母細胞を回復させた後、プロテアーゼを作用させ、再び電流を測定します。

次に、並行して卵母細胞をビオチン化し、ウェスタンブロッティングに供して細胞表面におけるgamma ENaC切断断片の出現をモニターします。その結果、2電極電位固定法とビオチン法を組み合わせることで、チャネルの切断とチャネルの活性化との間に因果関係があることが示されます。非計画的な測定などの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、2回の測定の間に、少量の試験溶液中で任意の時間、プロテアーゼやその他の薬理学的薬剤に卵母細胞を曝露させることができる点にあります。テキストのプロトコルに従ってXenopus laevisの卵母細胞を単離し、cDNAを注入してから2日後、ND 96を用いて重力供給灌流システムの1つ目のシリンジを満たし、アミドを含むND 96を用いて2つ目のシリンジを満たします。

シリンジをバスチャンバーの50 cm上に設置した後、150 Wのハロゲン冷光光源を点灯させ、双眼顕微鏡で良好に観察できるよう、サイトバスチャンバーの10 cm上に調整します。吸引装置を起動し、吸引チューブを卵母細胞バスチャンバー内のスーパーフュージョンチューブのアダプターの反対側に配置します。次に、IV重力フロー制御装置を用いて、各溶液のスーパーフュージョン速度を3～5 mL/minに調整します。その後、アダプターを使用してスーパーフュージョンチューブを卵母細胞バスチャンバーに接続します。その際、マイクロピペットプル装置でガラスキャピラリーを引き、先端径を1 µm未満にします。

次に、3 molar 塩化カリウムを用いて、それらを約4分の1まで満たします。キャピラリーを電流電極および電圧電極の電極ホルダーに挿入し、マイクロマニピュレーターを使用して、2 micromolar Amide溶液を含むND 96に配置します。Amide感受性全細胞電流を測定するには、まずVM offsetボタンを調整して電圧電極の電極電位をゼロにし、次にVE offsetボタンを調整して電流電極をゼロにします。

UO部位をバスチャンバー内に配置し、電圧センシング電極に近づけます。次に、2本のマイクロ電極を用いてUO部位を緩やかに貫通させ、アンプの保持電位を-60 mVに設定し、チャートレコーダーを起動します。その後、アミド含有溶液を導入します。

次に、記録を開始し、必要に応じてゲインを調整します。測定電流が安定したプラトーに達した後、アミド不含溶液に切り替えます。電流がプラトーに達したら、還流をアミド含有溶液に戻します。その後、UO部位の電流が初期ベースライン電流に達したら、ボルテージクランプをオフにし、電極をゆっくりと引き抜いて、刺入部位の細胞膜を再封止させます。

Uocサイトを、100 to 150 µLのプロテアーゼフリーND 96溶液を含む96ウェルプレートの1ウェルに5分間浸し、その後、UOCサイトをプロテアーゼ含有溶液またはプロテアーゼを含まないコントロール溶液に転移させます。インキュベーション後30分間、現在の測定を繰り返し、実体顕微鏡下で欠陥のある卵母細胞を廃棄し、適切なプロテアーゼを含むおよび含まないanti 96を調製します。パステールピペットにラベルを貼り、卵母細胞への損傷を避けるためにチップの先端を軽く火炎滅菌して準備します。

6ウェルプレートの各ウェルに、室温のND 96またはプロテアーゼを含むND 96を2.5 millilitersずつ満たします。次に、1ウェルあたり30個の卵母細胞を加え、室温で30分間インキュベートします。新しい6ウェルプレートのウェルに2.5 millilitersのND 96を加えた後、それぞれの卵母細胞群をND 96を満たしたウェルに移します。

卵母細胞をND 96を含むさらに2つのウェルに順次移して残存するプロテアーゼを洗浄し、最後のウェルで5分間インキュベートします。テキストプロトコルに従って、ビオチン溶出バッファーでビオチンを調製します。各卵母細胞群を2.5 millilitersのビオチン溶出バッファーを含むウェルに入れ、穏やかに撹拌しながら15分間インキュベートします。その後、ビオチン反応を停止させるため、各卵母細胞群を2.5 millilitersのクエンチバッファーを含むウェルに入れ、さらに別のクエンチバッファーのウェルに移して5分間インキュベートします。

緩やかに撹拌しながら、各群の卵母細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、プロテアーゼ阻害剤を添加したライシスバッファー1 mLを用いて、27ゲージの針に通すことで細胞を溶解させます。溶解物を1500 ×gで10分間遠心分離します。上清をTRITON X-100およびMP 40を含む新しい1.5 mLチューブに移し、氷上で20分間インキュベートします。チューブを繰り返しボルテックスしてタンパク質を溶解させた後、卵母細胞1群あたり100 µLに平衡化したvagaroビーズをタンパク質界面活性剤溶液に加え、サンプルを4 °Cで一晩オーバーヘッド回転させながらインキュベートします。

翌日、サンプルを1500 ×gで3分間遠心分離します。その後、上清を新しいチューブに移し、細胞表面におけるact切断断片を検出します。2×SDS-PAGEサンプルバッファーを加える前に、ライシスバッファーを用いてビーズを3回洗浄し、ゲルサンプルを回収します。サンプルを20,000 ×gで3分間遠心分離した後、上清を新しいマイクロ遠心チューブにピペッティングします。

セリンプロテアーゼであるプラスミンがENaC介在性電流を活性化できるか調べるため、テキストプロトコルに従ってサンプルをウェスタンブロットで分析します。ENaCを発現している個々の細胞のdelta IEを、プロテアーゼフリー溶液またはプラスミン含有溶液で30分間インキュベートする前と後で測定しました。ここで示す2電極電位固定法を用いたところ、プラスミンへの曝露により、測定したすべての細胞でdelta IEが増加しました。

対照的に、プロテアーゼフリー溶液でのインキュベーションによる影響は無視できる程度でした。この図は、野生型ENaCおよびプロスタシンとプラスミンの切断部位に変異を導入したENaCに対するキモトリプシンの影響を比較したものです。ここで示されているように、変異型チャネルでは、キモトリプシンによるENaC介在性電流の活性化が遅延し、かつ減少しています。

さらに、野生型ENaCと比較して、切断フラグメントの生成速度が低下しています。このビデオを視聴することで、述べてきた手法を組み合わせ、プロテアーゼが細胞内への移行に及ぼす刺激効果と、細胞表面における切断産物の出現との相関をどのように解析できるかについて、深く理解できるはずです。これは、他のイオンチャネル、輸送体、または膜貫通受容体の制御に関する同様の課題に取り組むなど、幅広いアプリケーションに活用できる可能性があります。