Name: 新規声帯バイオリアクターの構築とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学ぶ新規バイオリアクター構築法で、振動刺激が間葉系幹細胞に与える影響を解析します。ポリ(ε-カプロラクトン)スキャフォールドとシリコンメンブレンを用いて声帯発声を模倣し、レーザードップラ振動計で特性を評価します。

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我々は、共焦点イメージングの彼のトレーニングやアドバイス博士ジェフリーカプランに感謝します。また、SEMケアにケック電子顕微鏡研究室博士Chaoyingニッケルに感謝します。この作品は、健康（NIDCD、R01DC008965とR01DC011377）の国立研究所によって資金を供給される。 ABZは資金調達のためのNSFの統合大学院教育研究見習（IGERT）プログラムを認めるものです。

1。バイオリアクターアセンブリ（ビデオ1） <ol><li>予め決定された内側および外側の寸法（ 図1）アルミニウム型（環状ダイス+スペーサピン）を作る。 </li><li>ステップ1.1から金型を用いて、シリコーン膜（直径1.5ミリメートル、 図1：42ミリメートル、厚さ）を作製強固なスリーブ（直径： 図1のスペーサピンによって形作ら12ミリメートル、厚さ〜0.25ミリメートル）での市販のシリコーンエラストマーキットを用いてミドル。 </li><li>円形の開口部（直径24ミリメートル）でアクリルブロックのペア（ 図2（4、5））を作る途中で、マッチング畝と溝を持つトップ（1.8センチメートル厚）とボトム（0.9センチメートル厚）ブロックを刻む。10 </li><li>ペアアクリルブロック間のシリコーン膜を挟む。一定の力（35 cNで·メートル）に設定されたマイクロトルクドライバーを使用して4隅のネジでアセンブリを固定します。結果として、水密、24メートルM、幅18ミリメートル、深振動室は、（ 図2C）が作成されます。 </li><li>底のアクリルブロックの角ネジの別のセットを介して振動室の下に3「拡張された範囲のミニウーファー（ 図2D、8Ω/20W）をマウントします。この時点で、個々の振動モジュールが組み立てられる。 </li><li> 7追加の振動モジュールを複製。等間隔の円形の穴にスピーカーの拠点を置くことによって、2つの固定アルミニウムバー（40センチメートル×10センチメートル×2.5cm）のの1にそれらの4を固定（直径：10センチ、厚さ​​2センチ）のバーにカット。各円形の穴にアルミ棒の側面からネジを挿入することにより、各スピーカーを安定させる。 </li><li>個別にスピーカーセレクターでスピーカーを制御します。セレクタの対応する出力にスピーカ本体に正と負の入力にワイヤを取り付けることにより、セレクタに、個々のスピーカーを接続します。スピーカセレクタtはからの信号を可能にする（ 図2E）を一度に8つのすべてのスピーカーに到達するために、電力増幅器を通過した後、彼関数発生器。 </li><li>防湿筐体に2室列、スピーカーセレクターや関連する電子部品を配置します。市販の細胞培養インキュベーター内で、アセンブリ全体を収容する。 </li><li>インキュベーターの背面にあるフィルタアセンブリを介してパワーアンプやスピーカーセレクターを接続する（医療グレードのPVCチューブを通して）メインケーブルを通します。 </li></ol> 2。足場の作製と特性評価<ol><li> 15重量％の濃度でクロロホルム中のPCLペレットを溶解する。 21のG平滑末端針でキャップ10ミリリットル注射器に溶液をロードします。 </li><li>プログラム可能なシリンジポンプにシリンジをロックし、1ミリリットル/時の流量を設定してください。 </li><li> 〜18センチメートルの針先·コレクタの距離で、水平に針から渡ってアルミ箔で覆われたコレクタを配置します。 </li><li>正Alliはをクランプ針の真ん中、アルミコレクタにグラウンド·ワニ口クリップにワニクリップは、それから15 kVの高電圧電源の電圧を設定してください。注意：高電圧、針からの距離を保つ。 </li><li>順次シリンジポンプと、電源をオン;すぐにきれい/安定した繊維ジェット乾いたペーパータオルを使用して針の先端を取り囲む残留ポリマー溶液を除去し、テイラーコーン19が形成されている。 </li><li>繊維は〜250〜300ミクロン（現在の紡糸条件の下で〜7時間）の厚さにアルミニウム集電体上に蓄積することができます。残留溶媒を除去するために1〜2日間真空乾燥器内の結果として足場を保管してください。 </li><li>画像足場は、一貫性の繊維形態を示すために走査型電子顕微鏡を用いて、金でスパッタコーティング。10 </li></ol> 3。バイオリアクターアセンブリおよび特性評価<ol><li> 2：4本のアーム（長さ：円筒状のディスク（直径8mm）をパンチ最初のディスクの外径をカットする12ミリメートル、直径生検パンチを使用して、紡糸したままのPCLマット（ 図2A）のうちミリメートル）。そして、均等に腕を切断する場所を獲得するために、円形の刃の周りに等間隔4 2ミリメートル、長ノッチを作るために第二に、8ミリメートル生検パンチを使用しています。 8ミリメートルパンチで得点した後、外側の腕の端をカットするメスの刃を使用しています。延長アームを介してシリコーン膜の溝に足場を挿入します（ビデオ1）。優しくマイナスピンセットを用いて表面を押して、挿入された足場を平らに。 </li><li>レーザー反射を支援するために、PCL足場に薄いAl箔（8ミリメートルX 2ミリメートル、直交形状、 図2B）の小片を取り付けます。 </li><li>振動チャンバー内に（ステップ1.4で詳述したように）組み立てシリコーン膜/ PCL足場を固定します。振動の前に、PCL足場を水和するために、チャンバー内に1.5ミリリットル水を加える。 </li><li>関数発生器を用いて、振動記号を紹介挟まれたアクリルチャンバーにALS（0.1 Vのピーク·ツー·ピーク電圧、VPPが例えば、200 Hzの正弦波、）。正確に各スピーカー入力の電圧を測定するために電圧計を使用しています。注：ファンクション·ジェネレータからのVppの読み出しは、スピーカーに送ら最終的な電圧とは異なります。 </li><li>シングルポイントLDVを組み立て、パン·チルトヘッド、三脚への光ファイバレーザセンサヘッドを固定します。角度センサヘッドは、テーブルトップに対して垂直に向くように。同軸ケーブルを介してデータ取得モジュールにLDVセンサヘッドを接続してUSB経由でノートPCへのモジュール。 </li><li>シリコーン膜上の種々の所定の点（ 図2B及び図3）に垂直にレーザ光 ​​を当てる。 </li><li>データ収集ソフトウェアを使用して、中膜の変位を記録する。 「オプション」メニューから「取り込み設定」をクリックします。次いで、FFT」に測定モードを変更する221;。次に、メインツールバーの「連続測定」をクリックして変位を記録するために選択された周波数（ 図6D）にフォームのピークをクリックします。 </li><li>基板を横切る相対位置の関数として通常の中間膜変位（0 w）をプロットする。制作8.5データ解析ソフトウェアを用いた表面の振動プロファイルの3Dマップを構築する。 </li></ol> 4。振動細胞培養<ol><li> MSC維持培地中/ cm 2で4,000〜5,000細胞の初期播種密度でのT150組織培養フラスコ中で継代培養ヒト骨髄由来MSC。 </li><li>細胞培養の7-8日後（〜85％コンフルエントになるまで）、例えばをAccutaseなどの細胞解離試薬で細胞をトリプシン処理し、血球計、遠心分離（5分間、440×gで）を用いてカウントし、再懸濁細胞ペレット中4.5×10 6細胞/ mlの濃度で新鮮MSCの維持培地。 </li><li> PCL scaffoを浸す70％エタノールのO / Nでのld溶媒を蒸発させた後、5〜8分間殺菌UV光（254nm）への足場の両面を露出させる。 </li><li> 1時間、37℃で20μg/ mlのフィブロネクチン溶液中でのPCL足場を浸します。シリコーン膜にフィブロネクチン被覆の足場を挿入します。ステップ1で詳述したようバイオリアクターを組み立てる。 </li><li>均等に保護されたPCL足場上の細胞懸濁液40μLを配布します。細胞は振動室に追加の1.5ミリリットル新鮮な培地を添加する前に、1〜1.5時間、添付することができます。 </li><li>文化3日間、静的に、MSCを含んだPCL足場と静置培養の完了時にメディアを更新します。 </li><li>携帯構築物、選択した振動体制を課す。注：例として、細胞は最大7日間、1日12時間〜40μmのAW 0と200 Hzの振動（OF）1-HR対1-HRオフに供される。振動刺激を受けるの構築物は、バイブサンプルと、それらのcultuとして指定されている同一の振動チャンバー内の静的に赤がスタティックコントロール（STAT）として機能します。 </li></ol> 5。生物評価<ol><li>一日おきに各チャンバから200μlの細胞培養培地を収集し（1日目、3、5、7）（800μlの各々）は一緒になって同じサンプルからのアリコートをプールする。 </li><li>メーカーの手順に従って、それぞれ、MMP1 ELISA開発キットおよびヒアルロン酸競合ELISAキットを使用してマトリックスメタロ-1（MMP1）とHAの細胞産生を定量化する。一方、以前に報告されたELISAの手順に従って、可溶性エラスチン前駆体の産生をアッセイする。8 </li><li> 7日目の最後​​の振動周期が完了すると、すぐに鋭利なピンセットを用いて振動チャンバからの細胞構築物を除去し、短時間冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、4℃）でそれらをすすぐ。 </li><li>生/死染色のために、ヨウ化プロピジウム（PBS中1:2,000）を有する構築物をインキュベートし、SYTO-13 RTで5分間、同時に（PBS中1:1000）。画像多光子共焦点顕微鏡を用いて染色し構築します。 </li><li>これとは別に、ドライアイス上で、PBS-すすい携帯構文スナップ凍結し、遺伝子解析のための以前に報告されたプロトコールに従って、全細胞RNAを抽出します。9 </li><li>紫外可視分光光度計を用いて抽出したRNAの量と質を確認してください。 1.8〜2.2のA260/A280およびA260/A230比を有するRNA試料をその後のqPCR分析のために使用される。 </li><li>リバース市販の逆転写キットを用いてcDNAにRNA（500 ngの/試料）を転写する。 </li><li>先に詳述した手順に従って、市販のPCRマスターミックスを用いたリアルタイム配列検出システム上でPCR反応を行う。8 </li><li>商用のqPCRデータ解析ソフトウェアを用いて定量PCR結果を分析する。データ分析の信頼性を確保するために、複数の参照遺伝子（YWHAZ、TBP、PPIA）はintとして使用されるernalコントロール、および特異的プライマー効率の分散が考慮される。8 </li></ol>

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競合する経済的利益は存在しません。

in vitroでの機能的な声帯組織の成功エンジニアリングは、多能性細胞の挙動を媒介するために声帯のような微小環境の再作成を必要とします。これは、一般的に組織または器官の構造は、それらが実行するために必要な機能を反映していると認められている。声帯組織の場合22は 、発声中に発生する高周波振動は、組織の成熟に重要であることが提案されている。声帯バイオリアクター培養したMSCに生理学的に関連する機械的な信号を導入するように設計されている我々の研究では、PCL足場は、靭帯様構造的支持を提供するために使用される。ここで説明するバイオリアクター（J2）は、個々のスピーカーから電磁振動を作成し、培養細胞にエネルギー空気力学的に転送します。我々の以前の設計に比べて、18の現在のシステムは、foができるように、直接、各サンプルウェルの下に振動刺激の源を移動RAより効率的なエネルギー変換。その結果、有意に大きい垂直変位と高い加速は、現在のシステムを使用して達成される。モジュラー設計は、異なる振動室全体のシステムの変動や機械的摂動を最小限に抑えることができます。 <p...

上皮層、固有層（LP）と声帯の筋肉から構成される人間の声帯は、健全な生産のための音波への肺からの空気の流れを変換する専門的なソフトな組織である。1声帯が通常の発声時に定期的に振動し、 100〜300 Hzの範囲の基本周波数で最大30％の株を示す。2アダルト声帯のLPは、表面的な（SLP）で構成される傾斜構造、中間（ILP）と深い（DLP）の層である。さらに分類群上皮と粘膜層として、SLP、およびボーカル靭帯へのILPとDLPを兼ね備えています。3靭帯が成熟したコラーゲンとエラスチン繊維で強化されている間、SLP層は、まばらに分散された膠原繊維と主にアモルファスマトリックスが含まれています十分な強度を提供する。4新生児声帯の構造や力学は、その成熟した対応とは大きく異なります。もののメカニズム声帯の開発と成熟を調節するのは、まだ完全には理解されていない、実験的証拠は、発声由来の機械的ストレスの決定的な役割を指摘しています。 音声乱用、感染症、化学的刺激物および外科的手技を含むいくつかの医学的条件は、声帯を損傷する可能性があります。声帯障害は米国の人口の推定3から9パーセントに影響を与える。声帯障害のための現在の治療法は、5を限定され、幹細胞を用いた組織工学アプローチは、声帯機能を回復するための有望な戦略として浮上している。間葉系幹細胞（MSC）は、声帯組織工学のための主要な声帯の線維芽細胞に適切な代替物である。6-9幹細胞の運命の仕様およびその後の組織の発達、機械的条件があるから彼らが存在する特定のニッチによって媒介される重要な要因。10機械的な力は、組織形態形成Aの本質的な調節因子であるndは、特に日常的に負荷にさらされる組織に対するホメオスタシス、 図11の組織工学の観点から、それが生理学的に関連する機械的刺激への曝露は、細胞分化および組織特異的基質リモデリングを促進する幹ことが実証された。12-15 組織培養バイオリアクターは、インビトロ細胞又は組織成長のための所望の生理学的環境をシミュレートするように設計されている。声帯組織工学のためには、phonating声帯の機械的な環境を再現するために特に重要です。理想的な声帯バイオリアクターは、効果的に周波数、振幅、振動の持続時間にわたって容易な制御を可能にする、培養細胞への振動の手がかりを提供する必要があります。ティッツェらはマトリックスタンパク質の細胞産生を刺激するために、高周波（20〜200 Hz）の振動で静的ストレッチを組み合わせた声帯バイオリアクター（T1バイオリアクター ）16を考案した。資料を使gこのバイオリアクター、ウェッブや同僚17は、ヒアルロン酸（HA）ベースのハイドロゲル中で培養皮膚線維芽細胞上で10日、100 Hzの振動の影響を研究した。振動を受けるの構築物は、スタティックコントロールと比較して、HA合成酵素2（HAS2）、デコリン、フィブロモおよびマトリックスメタロ-1（MMP1）の発現の上昇を示した。刺激作用は時間依存であることが見出された。さらに最近では、我々のグループ18は、パワーアンプ、関数発生器、同封スピーカと付着した細胞に振動空気圧を転送円周方向に固定されたシリコーン膜を使用して声帯バイオリアクター（J1バイオリアクター ） を組み立てた。 J1バイオリアクターで培養新生児包皮線維芽細胞は、最大0.05％の面内歪みと、60、110又は300ヘルツの振動の1時間に供した。定量PCRの結果は、いくつかのECM遺伝子の発現が適度に変化させ、振動周波数に応答して変更されたことを示唆しと振幅。 これらのバイオリアクターの設計は、興味をそそるが、いくつかの制限を有する。たとえば、T1はシステムが達成可能な最大周波数を制限すること、機械的な連結用のコネクタやバーが多数を必要とします。さらに、細胞は、データ解釈を複雑に望ましくない機械的攪拌および流体の摂動を受けてもよい。 J1バイオリアクターは、一方では、比較的低いエネルギー変換効率を示し、かつユーザーフレンドリーではない。また、振動が頻繁に基本的なシリコーン膜から細胞を含んだ構造体を取り外す。 J1のバージョンと同じ原理に基づいて設計された、ここで報告されたJ2声帯バイオリアクターは、一貫性と再現性のために最適化されています。発声模倣振動が、MSC-人口繊維状のポリ（ε-カプロラクトン）（PCL）足場がeffectivあり、個々に取り付けた振動室内に空気力学的に生成されますイーリー確保。レーザドップラ振動計（LDV）は、ユーザーが膜/足場アセンブリの振動プロファイルを確認することができます。私たちのデモでは、MSCは7日間、12時間の毎日の合計1-HR対1-HRオフ（OF）のパターンで200 Hzの正弦波振動にさらされている。課された振動の合図に対する細胞応答を系統的に調べている。全体的に、J2声帯は、動的な細胞培養研究は、高いスループットと再現可能な方法で実施することができるように、ほとんどのユーザーフレンドリーな機能を提供します。

<table><tbody><tr><td>シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウ コーニング</td><td>シルガード 184</td><td>100 &#176 で膜を硬化させます。C 2時間</td></tr><tr><td>PCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~80 kDa, 溶解 O/N</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>ヒト骨髄由来MSC</td><td>ロンザ</td><td>PT-2501</td><td>継代 2</td></tr><tr><td>MSC メンテナンス培地</td><td>ロンザ</td><td>PT-3001</td><td>L-グルタミン、ゲンタマイシン、アンホテリシンを添加 </td></tr><tr><td>の基礎培地に 10% FBSアキュターゼ細胞解離試薬</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 DuoSet ELISAキット</td><td>R&Dシステム</td><td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>HA ELISAキット</td><td>エシュロンバイオサイエンス</td><td>&nbsp;K-1200&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ14190-136</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズP1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ S7575</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect 逆転写キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR グリーン PCR マスターミックス</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>交換用スピーカー</td><td>DAYTON audio (Parts Express経由)</td><td>DS90-8</td><td>ペーパーコーン、フルレンジ (80-13,000 Hz)、85 dB</td></tr><tr><td>エルゴ マイクロトルクドライバー</td><td>Mountz</td><td># 020377</td><td>トルク範囲: 20-120 cN&#183;m</td></tr><tr><td>ステレオスピーカーセレクター</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td><td>最大電力処理 50 W</td></tr><tr><td>ファンクションジェネレーター&nbsp;</td><td>アジレント&nbsp;</td><td>33220A</td><td>周波数範囲1&マイクロ;Hz-20MHz</td></tr><tr><td>パワーアンプ&nbsp;</td><td>PYLEオーディオ</td><td>PyleProPT2400</td><td>周波数応答:10 Hz-50 kHz、2つのスピーカー チャンネル</td></tr>細胞<tr><td>培養インキュベーター&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ&nbsp;</td><td>ニューエラポンプシステム</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>高圧電源</td><td>スペルマン</td><td>CZE 1000R</td><td>出力電圧:0-30 kV</td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡&nbsp;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>卓上型金スパッタコーター</td><td>デントン真空</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>ドップラーレーザー振動計&nbsp;</td><td>ポリテック</td><td>PDV-100</td><td>非接触速度測定 (0-22 kHz)</td></tr><tr><td>PCR 配列検出システム&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI7300</td><td></td></tr><tr><td>多光子共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS 分光光度計&nbsp;</td><td>NanoDrop Products via Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>VibSoft データ収集ソフトウェア</td><td>Polytec</td><td></td><td>最大40 MHzのデータ収集帯域幅</td></tr><tr><td>Origin 8.5 データ解析ソフトウェア&nbsp;</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qbasePlus qPCRデータ解析ソフトウェア&nbsp;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウム合金&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>合金 6061</td><td></td></tr><tr><td>アクリル ブロック</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート製耐湿チャンバー</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>耐衝撃性&nbsp;ポリカーボネート</td></tr><tr><td>製ネジ&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電子ケーブル/ワイヤー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>医療グレードのPVCチューブUS</td><td>Plastic Corp.</td><td>タイゴンS-50-HL</td><td>透明、生体適合性</td></tr><tr><td>10mlシリンジ&nbsp;</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 G鈍い端針</td>小<td>部品</td><td>NE-213PL-25</td><td>1-1 / 2 "長さ</td></tr><tr><td>ワニ口クリップアダプター&nbsp;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td>完全断熱</td></tr><tr><td>8 mm 生検パンチ</td><td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx?部門ID=10&CategoryID=96">Sklar&nbsp;手術器具</a></td><td>96-1152</td><td>滅菌済み、使い捨て</td></tr><tr><td>12mm生検パンチ</td><td>Acuderm(フィッシャーサイエンティフィック経由)</td><td>NC9998681</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>コーニング</td><td></td><td>細胞培養 治療</td></tr></tbody></table>

新規声帯バイオリアクターの構築とキャラクタリゼーション

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

機械的に活性な組織のインビトロエンジニアリングでは、培養細胞に生理学的に関連する機械的条件を提示する必要があります。声帯の動的環境をエミュレートするために、基本的な発声周波数で振動刺激を生成することができる新しい声帯バイオリアクターが構築され、特徴付けられます。このデバイスは、ファンクションジェネレータ、パワーアンプ、スピーカーセレクタ、および並列振動チャンバで構成されています。個々の振動チャンバーは、カスタムメイドのシリコン膜を一対のアクリルブロックの間に挟むことによって作成されます。シリコーンメンブレンは、チャンバーの底部として機能するだけでなく、細胞を含んだ足場を固定するためのメカニズムも提供します。底面のアクリルブロックの下に取り付けられたスピーカーから発生する振動信号は、振動する空気によって空気力学的に膜に伝達されます。2本の固定金属バーに固定された8つの同一の振動モジュールが、細胞培養インキュベーターでの長期運転のために抗湿度チャンバーに収納されています。声帯バイオリアクターの振動特性は、レーザードップラー振動計(LDV)を使用して非破壊で分析されます。動的培養デバイスの有用性は、膜中央変位が40μmの200Hz正弦波振動の存在下で細胞構築物を培養することによって実証されます。バイオリアクターで培養された間葉系幹細胞は、声帯に関連する細胞外マトリックス成分の合成と分解を変化させることにより、振動シグナルに応答します。ここで紹介する新しいバイオリアクターシステムは、振動誘発性メカノトランスダクションの研究や機能的な声帯組織のエンジニアリングのための優れたin vitroプラットフォームを提供します。

エレクトロスピニングにより作製したPCL足場は4.7ミクロン（ 図4A）の平均直径がミクロンサイズの間質性毛穴やランダムに絡み合った繊維を含む。高倍率では、ナノスケールの溝や孔は、個々の繊維（ 図4B）上に表示されます。フィブロネクチンと足場のコーティングが親水性を向上させ、PCL足場（未発表の観察）に広がる/初期細胞接着を容易にします。 所望の周波数（f、100〜300ヘルツ）と電圧を有する正弦波形（電圧Vpp：0から0.125 V）を各振動室の下スピーカ、シリコーン膜の底部とのコーン紙の間に閉じ込められた空気に導入されるミニウーファーは振動に追い込まれている。空気振動は、または細胞なしPCL足場に送達される。 LDVは、所与のfおよびVppに足場の振動特性を分析するために使用される口座への水の屈折率（1.33）を服用。20 図5は、Vppの関数としてのPCL足場の中央で（0ワット）通常の変位を示して...

培養細胞に生理学的に関連性のある振動刺激を与えることができる新しい声帯バイオリアクターが構築され、特徴付けられています。このダイナミックな培養装置は、繊維状のポリ(ε-カプロラクトン)足場と組み合わせることで、間葉系幹細胞の振る舞いを調節する声帯模倣環境を作り出します。

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

本実験の全体的な目的は、発声を模倣するように設計されたバイオリアクターを用いて、間葉系幹細胞に対する振動刺激の影響を調べることです。これは、声帯に類似した細胞培養用の三次元基質を提供するために、ポリε-カプロラクトン（poly epsilon Capralactone）スキャフォールドを作製することで達成されます。次に、これらのスキャフォールドをシリコン膜に組み込むことで、細胞構成体への振動の伝達を促進します。次に、レーザードップラー振動計を用いて、各メンブレンとスキャフォールドの組み合わせの振動特性を決定します。最終的に、EISAおよび定量R-T-P-C-R解析を行い、タンパク質レベルおよび翻訳レベルでの細胞応答を評価できます。この手法は、声帯がどのように成熟するかや、声帯の誤用による影響など、喉頭科学分野における重要な疑問に答えることができます。この手法では、足場を作製する際に高いレベルの細胞制御が可能であるため、声帯疾患の治療への応用が期待されます。まず、PCLペレットをクロロホルムに15重量%の濃度で溶解させます。次に、得られた溶液を、21ゲージの鈍端針を装着した10ミリリットルシリンジに充填します。シリンジをプログラマブルシリンジポンプに固定し、流速を1ミリリットル/時に設定します。次に、アルミホイルで覆ったコレクターをニードルの向かい側に水平に配置し、ニードル先端からコレクターまでの距離を約18センチメートルにします。続いて、正極のアリゲータークリップをニードルの中央に固定し、クリップをコレクターに接地させます。高電圧電源の電圧を15キロボルトに設定し、ニードルには近づかないように注意してください。次に、シリンジポンプと電源をオンにします。安定したファイバージェットとテイラーコーンが形成される前に、乾いたペーパータオルを使用して針先に付着している残留ポリマー溶液を素早く取り除きます。その後、アルミコレクター上にファイバーを約7時間蓄積させ、厚さを250から300 micrometersにします。得られたスキャフォールドを真空デシケーター内で1〜2日間保存し、残留溶媒を除去します。得られるPCLスキャフォールドは、ミクロンサイズの間隙孔と、平均直径約4.7 micrometersのランダムに絡み合ったファイバーで構成されます。より高い倍率では、バイオリアクターを組み立てるための個々のファイバー上のナノスケールの溝と孔が確認できます。まず、直径12 mmのバイオプシーパンチを使用して、最近紡糸したPCLマットから直径8 mmの円形ディスクの外周を切り出します。次に、2つ目の8 mmバイオプシーパンチを使用して、アームを切り出す位置に印を付けます。スコアリング後、メスでアームの端を外側に切り込みを入れ、拡張したアームを介してスキャフォールドをシリコンメンブレンの溝に挿入します。挿入したスキャフォールドの表面を平先ピンセットで軽く押さえて平坦にし、次に 8 mm × 2 mm の薄いアルミニウム箔を PCL スキャフォールドに取り付けます。レーザー反射を促進させるため、組み立てたシリコンメンブレン PCL スキャフォールドを振動チャンバーに固定します。次に、シリコン膜を対になるアクリルブロックで挟み込みます。マイクロトルクドライバーを用いて、35 cent a Newton metersの一定の力で4隅のネジを締め、アセンブリを固定することで、幅24 millimeter、深さ18 millimeterの水密振動チャンバーを作成します。次に、底面のアクリルブロックにある別のコーナーネジを介して、3 foot extended range mini wooerを振動チャンバーの下に装着し、個別の振動モジュールの組み立てを完了させます。さらに7つの振動モジュールを複製した後、スピーカーベースを等間隔に配置された円形の穴に当てはめ、2本の固定用アルミニウム棒のうち1本に4つのモジュールを固定します。アルミニウム棒の側面の穴にネジを挿入し、各スピーカーを固定します。次に、スピーカー本体の正極および負極入力端子と、セレクターの対応する出力端子を電線で接続し、個々のスピーカーをセレクターに接続します。スピーカーセレクターを使用することで、パワーアンプを通過したファンクションジェネレーターからの信号を、8台すべてのスピーカーに同時に到達させることができます。次に、2つのチャンバーアレイ、スピーカーセレクター、および関連電子機器を防湿エンクロージャーに入れ、アセンブリ全体を市販の細胞培養インキュベーター内に設置します。メインケーブルを医療用PVCチューブに通し、インキュベーター背面のフィルターアセンブリを介してパワーアンプとスピーカーセレクターを接続します。まずバイオリアクターの特性を評価するため、振動を加える前にPCLスキャフォールドを水和させる目的で、振動チャンバーに1.5 millilitersの水を加えます。次に、ファンクションジェネレーターを用いて、アクリルチャンバーに挟まれた部分に振動信号を導入します。電圧計を用いて正確に測定してください。各スピーカー入力の電圧を測定し、その後、シングルポイント・レーザードップラー振動計を組み立てます。光ファイバーレーザーセンサーを固定します。パン・チルトヘッド付き三脚に向かい、センサーヘッドがテーブルトップに対して垂直に向くように角度を調整します。次に、同軸ケーブルを用いてセンサーヘッドをデータ収集モジュールに接続し、USBポートを介してモジュールをノートパソコンに接続します。レーザービームをシリコンメンブレン上のあらかじめ定めた複数の点に垂直に集光させ、データ収集ソフトウェアのオプションメニューから「acquisition settings（収集設定）」をクリックします。続いて、測定モードをFFTに変更し、メインツールバーにある連続測定ツールをクリックしてください。選択した周波数で形成されるピークをクリックして変位を記録し、基板を横切る相対位置の関数として、膜中央の正規変位をプロットします。振動細胞培養の準備として、まずヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、T150組織培養フラスコに初期播種密度4〜5 × 10³ cells/cm²で播種し、維持培地で7〜8日間サブカルチャーします。実験の前日に、PCLスキャフォールドを70%エタノールに一晩浸漬させます。翌朝、Accutaneを用いて細胞を剥離させ、遠心分離後に細胞ペレットを新鮮な維持培地で4.5 × 10⁶ cells/mLの濃度に再懸濁します。エタノールが蒸発した後、スキャフォールドの両面を殺菌用UVライトに5～8分間曝露させます。その後、PCLスキャフォールドを20 µg/mLのフィブロネクチン溶液に浸し、37 °Cで1時間置きます。先ほど実演したバイオリアクターを使用し、細胞懸濁液 40 µLを固定したスキャフォールド上に均等に分注します。1〜1.5時間かけて細胞を接着させた後、振動チャンバーに新鮮な培地をさらに 1.5 mL加えます。間葉系幹細胞を担持させたPCLスキャフォールドを3日間静的に培養した後、培地を更新し、選択した振動条件下で細胞構築物を培養します。振動周波数は人間の発話における基本周波数を反映するように選択されており、すべてのテスト周波数において、垂直方向の変位とピーク・トゥ・ピーク電圧との間には0から0.125 Vの範囲で線形関係が認められた。また、特定のピーク・トゥ・ピーク電圧において、周波数が100 Hzから300 Hzに増加するにつれて垂直方向の変位は減少した。エラスチン、ヒアルロン酸合成酵素1、III型コラーゲンα1鎖、およびマトリックスメタロプロテアーゼ1などの主要な声帯細胞外マトリックスタンパク質の発現量に基づき、mRNAレベルで振動刺激に対する細胞応答を検討したところ、1時間オン・1時間オフの周期的な振動により、静的コントロールと比較してエラスチンの発現が2.3倍に増加することが示された。7日目において、振動刺激はコラーゲン発現も緩やかに増加させます。特筆すべきは、主要な細胞外マトリックス再構成酵素であるヒアルロン酸合成酵素1およびマトリックスメタロプロテアーゼ1の発現が、3日目から7日目にかけて振動信号により有意に増強されることです。振動刺激を7日間与えた後、ELISAで検出したところ、動的培養細胞は乾燥スキャフォールド重量1 mgあたり4.2 ± 0.1 µgの可溶性エラスチンを産生していました。対照的に、静止コントロールでは1 mgのエラスチンあたり2.7 ± 0.2 µgしか蓄積しません。平均して、7日間にわたり1時間オン・1時間オフの振動を繰り返した結果、ヒアルロン酸およびMMP-1の分泌量は、対応する静止コントロールと比較してそれぞれ2.2倍および4.7倍に増加しました。本システムはVOCO形態の生理学的研究を目的として設計されていますが、他の多くのシステムにも応用可能です。例えば、耳やヒト真皮組織などが挙げられます。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

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Bioengineering

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新規声帯バイオリアクターの構築とキャラクタリゼーション

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