ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

この手順の全体的な目的は、短期間で再現性があり、定義されたプロトコルを用いて、ヒト多能性幹細胞から神経堤前駆細胞を生成することです。これらの細胞は、in vitroでの神経堤関連疾患の研究や、これらの細胞をさらに分化させて子孫細胞を得るために利用できます。これはまず、マトリゲル上の単層に高密度のヒト多能性幹細胞を播種することによって達成されます。

第2段階では、主要なシグナル伝達経路に影響を与える低分子化合物の規定の配列と組み合わせを用いて、細胞を神経上皮細胞へと分化させます。次に、神経上皮細胞を再播種し、さらに神経堤前駆細胞へと分化させます。最終段階では、蛍光活性化細胞分取法を用いて神経堤細胞を単離します。

最終的に、免疫蛍光染色や、細胞の遊走能などの機能解析を用いて、適切な神経堤細胞が生成されたことを確認します。ヒト多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導するための既存のプロトコールに対する本手法の主な利点は、期間が短いことです。わずか18日間で完了します。

MS5フィーダー細胞を使用しないため、再現性が向上しています。スケールアップが容易であり、ヒト多能性幹細胞株間での再現性も非常に高いです。本手法の意義は、神経系 lineage に関連するヒト疾患のメカニズム研究にまで及び、これらの疾患におけるより詳細な in vitro モデリングおよび薬剤スクリーニングを改善する可能性を示しています。

本プロトコルを開始する前に、ヒト多能性幹細胞のコロニーが肉眼で確認できる大きさであり、かつ境界部に分化細胞が少なく、エッジが鮮明であることを確認してください。その後、hPSCを継代する準備ができたら、培地を吸引し、1×PBSで1回洗浄します。次に、0.05% Trypsin-EDTAを4 mL加え、ディッシュを水平方向に2分間激しく振ります。顕微鏡下でマウス胚性線維芽細胞が単一細胞としてプレートから剥離したことを確認してください。

HPSCコロニーはコロニーとしてディッシュに付着したままになります。その後、すぐにトリプシンを完全に吸引し、プレートを室温で2〜4分間放置します。プレートにHES培地を2 mL加え、P 1000ピペットを用いて細胞を剥離させます。細胞が容易に剥がれない場合は、プレートをさらに2〜3分間インキュベートしてください。

室温で、細胞懸濁液を10 µMのY 2 7 6 3 2 dihydrochlorideを添加した8 mLのHES培地を含む15 mLコニカルチューブに回収します。次に、あらかじめ処理しておいた10 cmディッシュからマトリゲルを吸引除去し、細胞を1:1または1:2の比率でマトリゲル処理済みのプレートに播種します。細胞を37 °C、5% CO2インキュベーター内で一晩培養します。

分化準備が整うまで、細胞にHES培地を毎日添加します。その後、細胞が90%から100%コンフルエントになった時点で神経分化を開始します。この日を0日目とします。

0日目から3日目まで、0.1 µM LDN-193189および10 µM SB 431542を含むKSR分化培地10 mLを毎日細胞に添加します。次に、4日目と5日目は、75% KSR分化培地、25% 培地2、0.1 µM LDN-193189、および10 µM SB 431542を含む培地10 mLを細胞に添加します。6日目と7日目は、50% KSR分化培地と50% 培地2に、0.1 µM LDN-193189および10 µM SB 431542を添加して調整した培地を細胞に添加します。

8日目から9日目にかけて、0.1 µM LDN 193189および10 µM SB 431542を含む25% KSR分化培地と75% N2分化培地で細胞を nuôi 養します。続いて9日目と10日目に、テキストプロトコルに記載されている通り、11日目の細胞再播種に使用するポリ-L-オルニチン、ラミニン1、およびフィブロネクチンでコートした培養皿を準備します。11日目に、0.1 µM LDN 193189および10 µM SB 431542を添加したN2分化培地で細胞を nuôi 養します。11日目に、あらかじめ準備した培養皿からラミニン1およびフィブロネクチン溶液を吸引し、組織培養フード内で20〜30分間、室温で乾燥させます。

次に、分化中の細胞から培地を除去し、1xPBSで細胞を1回洗浄します。その後、10 cmプレートにそれぞれ8 mLのAccutaseを加え、37 °Cで20分間インキュベートします。インキュベート後、セルリフターを用いて細胞を剥離させ、Accutase溶液中で細胞を再懸濁します。

5 mL ピペットを用いて、細胞懸濁液を 15 mL コニカルチューブに移します。次に、1x PBS を 5 mL チューブに加え、115 ×g で 5 分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを 10 mL の 1x PBS で再懸濁します。その後、細胞懸濁液を 40 µm のセルストレーナーでろ過し、単一細胞懸濁液であることを確認します。

ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。再び115 Gsで5分間遠心分離し、添加剤入りN2分化培地10 µLあたり100,000～150,000個の濃度に細胞を再懸濁します。リピーターピペットを使用し、ポリL-オルニチンで前処理した15 cm培養皿に、細胞懸濁液を10 µLずつ滴下して播種します。

ラミニン1およびフィブロネクチン。液滴を室温で15〜20分間静置します。その後、液滴を乱さないように、添加物入りのN2分化培地 30 milliliters をプレートに非常に慎重に加えます。

細胞を5%二酸化炭素インキュベーター内で37 °Cで一晩インキュベートします。12日目に、200 µMのアスコルビン酸、20 ng/mLの脳由来神経栄養因子（BDNF）、100 ng/mLの線維芽細胞増殖因子8（FGF8）、および20 ng/mLのソニックヘッジホッグ（Shh）を含むN2分化培地を、15 cmディッシュあたり20 mLずつ慎重に添加します。

その後、14日目から17日目まで、200 µM のレチノイン酸、20 ng/mL の脳由来神経栄養因子（BDNF）、および 100 ng/mL の線維芽細胞増殖因子8（FGF8）のみを含む N2 分化培地を用いて、2〜3日ごとに細胞に給餌します。16日目と17日目に、神経堤細胞の再播種に使用する poly-L-ornithine、laminin 1、および fibronectin でコーティングしたプレートを準備します。

18日目にFACS解析を行い、蛍光活性化細胞分取により細胞を分取した後、神経堤細胞を計数し、115 Gsで5分間遠心分離します。得られた細胞ペレットを、10 ng/mLを添加したN2分化培地で再懸濁してください。

FGF2 20 ng/mL、EGF、および10 µM Y 2 7 6 3 2 二塩酸塩を含む細胞懸濁液を、30,000 cells/10 µLの濃度で調製します。あらかじめpoly-L-lysine、laminin 1、およびfibronectinでコートし、十分に乾燥させた培養皿を用意します。次に、10 cmディッシュ1枚あたり、この細胞懸濁液を約50〜70滴分播種します。

ドロップレットを乱さないように、10 cmディッシュそれぞれに、10 ng/mL FGF2、20 ng/mL EGF、および10 µM Y 27632 dihydrochlorideを添加したN2分化培地20 mLを加え、室温で15～20分間インキュベートします。

その後、5%二酸化炭素インキュベーターを用いて、細胞を37 °Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、付属のテキストプロトコルに従って神経堤細胞を維持および継代します。この新しいフィーダーフリーin vitro分化プロトコルを用いることで、ヒト多能性幹細胞から18日間で神経堤細胞を誘導しました。

18日目の FACS 解析により、HNK-1 と p75 の両方に陽性である細胞が同定され、神経堤細胞の存在が確認されました。フィーダーフリー分化プロトコルとフィーダー細胞依存的プロトコルのいずれにおいても、神経堤細胞は神経ロゼット段階を経由しました。さらに、 FACS ソートされた細胞は同一の形態を示し、神経堤マーカーである HNK-1 と p75 を発現していました。これら 2 つの分化プロトコルから誘導された神経堤細胞の全遺伝子発現を比較したところ、両方の細胞群が互いに近接してクラスターを形成することが判明しました。

フィーダーフリープロトコルを用いて誘導した神経堤細胞の遊走能を解析した結果、48時間後に細胞がスクラッチ内へ正常に遊走することが示されました。また、さらに4日間の分化誘導を行った後、mash oneおよびtouch oneに対する陽性染色が確認されたことから、これらの細胞は自律神経系細胞へと分化する能力を持つことが明らかになりました。このビデオを視聴することで、ヒト多能性幹細胞を神経分化させ、in vitroで神経堤前駆細胞を誘導する方法について十分に理解できるはずです。