Name: ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶヒト多能性幹細胞から神経堤前駆細胞をフィーダーフリーで導出する方法。小分子を用いた18日間の再現性の高いプロトコルにより、神経堤関連疾患の研究や細胞置換療法への応用が可能となる。

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そしてトライ制度幹細胞イニシアチブ（スター財団）;この作品は、スイス国立科学財団からNYSTEM（C026447 C026446）からの補助金を通じて先進的な研究者のためのフェローシップでサポートされていました。

1。培養培地、コーティングされた料理とhPSCsのメンテナンスの調製 1.1メディアの準備注：最大2週間、暗所で4℃で殺菌し、ストアのすべてのメディアをフィルタリングします。試薬名、会社とカタログ番号は、 資料の表に記載されている。 <ol><li> DMEM/10％FBS：DMEM 885ミリリットル、100ミリリットルのFBS 10mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび5mlのL-グルタミンを組み合わせる。 </li><li> HES-培地：DMEM/F12 800ミリリットル、200ミリリットルKSR 5mlのL-グルタミン5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを10mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液1mlのβ-メルカプトエタノールを組み合わせる。メディアをフィルタリングした後に10 ng / mlのFGF-2を追加します。 注意：β-メルカプトエタノールは毒性が、吸入、経口摂取、皮膚接触を避ける。 </li><li> KSR-分化培地：820ミリリットルノックアウトDMEM 150mlのKSR 10mlのL-グルタミンを10mlのペニシリン/ストレプトマイシンを10mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液、1mlのβ-メルカプトエタノールを組み合わせる。 </li><li> N2-differentiati培地上：1.55グラムのグルコース、2グラム重炭酸ナトリウムおよび100mg APOヒトトランスフェリンを追加、980ミリリットルのdH 2 Oに12グラムのDMEM/F12粉末を溶かす。 25 mgのヒトインスリンおよび40μlの1N NaOHで2ミリリットルのdH 2 Oを混ぜて、媒体に溶解した溶液を加える。 100μlのプトレシン二塩酸塩を追加し、60μlの亜セレン、100μlのプロゲステロンとDH 2 Oで1リットルにボリュームを持ち出す</li></ol>培養皿の1.2コーティング<ol><li>マトリゲルコーティング：雪解け1ミリリットルは、それが溶解するまで一定分量以上の19ミリリットルのDMEM/F12をピペットでマトリゲルのアリコートを凍結した。 40μmのセルストレーナーとプレート8エルフテックスcmディッシュに通して塊を除去します。室温で1時間の料理をインキュベートする。細胞を播種する直前にマトリゲルを吸引する。 注：それは4℃以上の温度で凝集することができますので、マトリゲルで素早く作業</li><li> PO /ラム/ FNコーティング：10cmの皿に15μg/ mlのポリ-Lオルニチン臭化水素酸塩を含む1×PBSを10ミリリットルを追加します。。 37℃で一晩の料理をインキュベート一回1X PBSでプレートを洗浄し、2μg/ mlのマウスラミニン-I及び2μg/ mlのフィブロネクチンを含む1×PBSを10エルフテックスcmディッシュを追加します。 37℃で一晩の料理をインキュベート細胞を播種する前に、完全に溶液を除去し、プレートを蓋なしで組織培養フードの壁にそれらを放置して15〜20分間、室温で完全に乾燥させます。 注：1は、表面の結晶構造を見ることができる料理は（目で見える）完全に乾燥し、細胞播種の準備ができている。プレートを、この乾燥した状態で、数時間室温に保つことができる。 PO /ラム/ FN料理は2日間、事前に準備する必要があります。緊急の場合、ラム/ FNは2〜4時間インキュベートすることができます。しかし、これは次善の分化/生存結果を危険にさらすことができる。 </li></ol> hPSCsの1.3メンテナンス注意：hPSCsは0.1％ゼラチンと、有糸分裂不活性化されたマウス胚性線維芽細胞上で維持されている（MHES培地中でのEF）を補充した10 ng / mlのFGF-2先に記載したよう10,12。細胞は6-8日ごとに分割する必要があります。 <ol><li>室温で5分間（マグネシウム又はカルシウムのない1×PBS中）1 mlの0.1％ゼラチンで被覆10cmディッシュ。 </li><li> 37℃の水浴中で迅速に凍結したMEFを解凍する。 10ミリリットルのDMEM/10％FBSに百万のMEFを追加します。 </li><li>ゼラチンを吸引し、細胞をプレート。少なくとも6時間、37℃でインキュベートする。 </li><li>一回1X PBSでプレートを洗浄し、10μMのY-27632二塩酸塩を補充した10ミリリットルのHES-培地を追加し、準備されたMEFプレートからDMEM/10％のFBSを吸引除去する。培地は20分間37℃でウォームアップすることができます。 注意：hPSCsの手動分割のために埋め込まれた顕微鏡を用いて、層流フードが使用されている。しかし、細胞は、適切な代替方法を使用して継代することができる。 </li><li>埋め込まれた顕微鏡で、層流フードの下で、セルリフターを使用して別々のコロニーを切り離し、それらをフロートしてみましょう。 </li><li>使用浮遊コロニーを吸引し、新鮮な、暖かいMEFプレートにそれらをディスパッチする1ミリリットルの注射器。新しい皿に細胞の約四分の一を転送します。 37℃でインキュベート</li><li>新鮮なHES培地で毎日細胞を養う。 </li></ol>差別化hPSCsの2。メッキ注意：コロニーが大きいが、それでも（ 図1（b）参照 ）、その境界での差別できるだけ少ない細胞とシャープなエッジを持っているときhPSCsは、分化のために分割またはめっきされるべきである。細胞がコロニーを継代マニュアル使用して維持されると簡単に目で見ることができる大きさでなければなりません。この時点での権利感触を得るために1を継代することなく、2週間ごとに個別のHPSCディッシュを維持し、細胞が到達見て、継代/それらを区別するための理想的な時点を渡すことができます。 <ol><li>分化を開始する前に、マトリゲル1時間で10cmの皿を準備します。成功したマトリゲルコーティングは可能4倍の倍率で検証した。 </li><li> hPSCsを分割する準備ができたら、メディアを吸引し、細胞を0.05％トリプシン-EDTAの4ミリリットルを追加。 </li><li> 1は、単一の細胞が顕微鏡下でプレートをリフトオフなどのMEFを見ることができます積極的になるまで2分間水平に料理を振る。 HPSCコロニーはコロニーとして取り付けられたまま。 </li><li>すぐに、徹底的に、トリプシンを吸引し、プレートを2-4分間、室温で放置。 </li><li>板にHES-培地2mlを加え、P1000ピペットを用いて、細胞を剥離。 注：細胞は、容易に表面から持ち上げることができない場合は、プレートをさらに2〜3分間RTで空にインキュベートすることができる。 </li><li> 10μMのY-27632二塩酸塩を補充した8ミリリットルHES-培地に細胞を移す。 </li><li>先に調製した10cmの皿からマトリゲルを吸引。マトリゲルプレートに：（1つの10 cmディッシュから細胞を二つ10cmの皿に分割される例えば）1:1または1:2の割合で細胞をプレート。 37℃でインキュベートする一晩のC。 注：このメッキは約10万個/ cm 2になる必 ​​要があります。 </li></ol>神経分化の3。誘導注：細胞は、90〜100％コンフルエント（ 図1Cを参照）、通常翌日である場合は分化（0日目）に開始することができる。正確な集密度がまだ達していない場合、それらが分化のための準備が整うまで、細胞を、HES培地を毎日供給することができる。代替的に、播種した細胞の最初の数を増加させることができる。 <ol><li> 〜3 0日目に、0.1μMLDN193189および10μMSB431542を含む10エルフテックスCMディッシュKSR-分化培地を毎日細胞を養う。 </li><li> 4日目と5飼料75％KSR-分化培地および25％N2-分化培地で細胞がLDN193189とSB431542を含む両方。 </li><li> 6日目と7飼料に50％KSR-分化培地で細胞を、50％N2-分化培地は両方LDN193189とSB4を含む31542。 </li><li> 8日目と9飼料に25％KSR-分化培地および75％N-分化培地で細胞がLDN193189とSB431542を含む両方。 </li><li> 9日目と10日の11上の細胞の再プレーティングのために1.2.2に示すように、PO /ラム/ FNの料理を準備。 </li><li> LDN193189およびSB431542を含むN2-分化培地で一日に10フィード細胞。 </li></ol> NC仕様の液滴中に4。再プレー<ol><li> 11日目吸引·ラム/ FN上で予め用意され、プレートからと1.2.2で説明したように彼らは、20〜30分室温で完全に乾燥させます。 </li><li> 、分化する細胞から培地を除去1X PBSで細胞を1回洗浄し、cmディッシュaccutase/10 8ミリリットルを追加します。 37℃で20分間インキュベートする。 </li><li>セルリフターを使用して、細胞を剥離し、5ミリリットルピペットでをAccutaseで再懸濁します。 15mlチューブにサスペンションを転送します。 </li><li> 1X PBSを5ミリリットルを加え、114 X gで5分間細胞をスピン。 </li><li> 10ミリリットル1で細胞を再懸濁X PBS。単一細胞懸濁液を確保するために、40μmのセルストレーナーを介してそれらをフィルタリングし、血球計又は等価な技術を用いて細胞を数える。 </li><li>ダウン細胞をスピン100,000の濃度で200μMのアスコルビン酸（AA）、20 ng / mlのBDNF、100 ng / mlのFGF8、20 ng / mlのSHH、10μMのY-27632二塩酸塩を含むN2-分化培地で再懸濁します-150000 cells/10μL。 </li><li>彼らは乾燥したPO /ラム/ FN 15cmの皿に触れることなく、互いに近接リピートピペッター、プレート10μlの液滴を使用して。 注：分化した細胞の1つの10 cmディッシュは、通常約2〜3倍の15cmディッシュや、約100×10μLdroplets/15のcmディッシュになる。 </li><li> N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Yの30ミリリットルを加え、37℃でインキュベート（液滴を乱さない）を非常に慎重に、液滴は、20〜30分間、室温で放置</li><li> 12日目に、慎重に20 ml/15 cmディッシュのN2/AA/BDNF/FGF8/SHHで細胞を養う。 </li><li> DAからY 14-17 N2/AA/BDNF/FGF8で2日または3日ごとに細胞を養う。 </li><li> 16日目と17日にFACS選別した後、NC細胞をreplateするPO /ラム/ FNプレートを準備します。 </li></ol> NC細胞の5。蛍光活性化細胞選別（FACS） 注意：FACSのための細胞の調製は、約2時間を必要とします。 <ol><li> 18日目に、培地を除去皿に1×PBSで細胞を1回洗浄し、12ミリリットルをAccutaseを追加。 37℃で20分間、細胞をインキュベート</li><li>セルリフターを使用して、表面から細胞を剥離し、それらをフロートしてみましょう。 50mlチューブに転送し、1×PBS 30mlの投稿を5mlピペットを用いて懸濁液中に細胞をピペット。 114×gで5分間細胞をスピン。 </li><li> P1000ピペットを使用して、（HBSSを15mMのHEPESを含有する）を2％FBS / HBSS 1ml中に細胞を再懸濁。 2％FBS / HBSSの19ミリリットルを追加し、単一細胞懸濁液を確保するために40μmのセルストレーナーを通して細胞をフィルタリング。 15メートルのために氷上で細胞をインキュベート抗体ブロッキングのために、次に血球計数器を用いて、それらを数える。 </li><li>細胞をスピンダウンし、2％FBS / HBSS中千万細胞/ mlの濃度で再懸濁します。 </li><li>のみを制御（APCのみと488のみ）、FACS染色染色されていない、単一染色（HNK-1のみしかP75）および二次抗体のために100万個の細胞を取って、それぞれを設定します。 </li><li>適切なサンプルに1ミリリットル懸濁液中の1000万個の細胞あたりのP75次抗体のHNK-1および5μLの5μLを加え、氷上で20分間インキュベートする。 </li><li> 10ミリリットル1X PBS（114×gで遠心分離器5分）で細胞を洗浄し、1ミリリットルの2％FBS / HBSS中で細胞を再懸濁。適切なサンプルに、APCの2μLと1ミリリットル懸濁液中の1000万個の細胞あたり488の二次抗体の1μlを加え、暗所で氷上で20分間インキュベートする。 注：APCおよび488は、それぞれ、HNK-1およびp75染色のためにここで使用した二次抗体である。 </li><li> 10ミリリットル1X PBS中に細胞を洗浄二回、500μlの1000万個の細胞を再懸濁DAPI（0.5でのNG /μL）またはFACS分析から、死細胞を排除するために、代替の適切な生細胞染色を含む2％FBS / HBSS。 </li><li> FACSチューブを適切にサンプルを転送します。 </li><li>細胞採取のために0.5ミリリットルの2％FBS / HBSSでFACSチューブを準備します。 注意：細胞とコレクションチューブは、ソート時間の間に暗闇の中で氷の上に保持されます。 </li><li> DAPIは、APCと488並べDAPI-/HNK-1 + / P75 +二重陽性細胞を検出することができ、レーザを用いて、細胞選別機を使用した。 注：これらの細胞は、ソートされた母集団から除外するための準備時間、細胞の処理は、細胞死のわずかな割合をもたらす、DAPI染色剤死細胞は、従って、可能にする。任意の代替生/死染色は、この目的のためにも同様に動作します。 DAPI自体が生きた細胞集団における細胞毒性を引き起こすことはありません。 </li></ol> 6。選別された細胞の再プレート、ノースカロライナ維持·拡大注意：FACS選別した細胞は、手でなければなりません最適な生存を確保するために特別な注意を払って導いた。それらを再プレートまで氷上に保管してください。厳しく、それらをボルテックスまたはピペットないでください。細胞は、チューブをタッピングして再懸濁することができる。 <ol><li> FACSソーティングした後、それらをスピンダウンして、NC細胞をカウントし、N2-分化培地に再懸濁は、30,000細胞でそれらをreplateするために、適切な量の10 ng / mLのFGF2、20 ng / mlのEGFおよび10μMのY-27632二塩酸塩を補っ/ 10μlの滴。 </li><li>徹底的に10cmの皿当たり約50〜70滴のPO /ラム/ FNプレートとプレート予め用意して乾燥させます。料理は、20〜30分間、室温で放置。 </li><li>非常に慎重に滴を乱すことなくN2/FGF2/EGF/Y-27632の20エルフテックスcmディッシュを追加します。 37℃で細胞をインキュベート</li><li> N2/FGF2/EGFで2〜3日ごとに細胞を養う。 注：これらは液滴内積み上げ起動したときのNC細胞が膨張、継代し、約4〜5日毎に、またはされています。 </li><li>通路にNC細胞は、中、ワシントンを削除SH細胞を1回1X PBSでcmディッシュaccutase/10 8ミリリットルを追加します。 37℃で20分間インキュベートする。 </li><li> 5ミリリットルピペットを用いてプレートから細胞をピペット15mlチューブに転送。 6ミリリットル1X PBSを追加します。 </li><li> 114×gで5分間細胞をスピン。 </li><li>液滴μlの2万cells/10を有するために、10 ng / mlのFGF2、20 ng / mlのEGFおよび10μMY-27632二塩酸塩を補充したN2-分化培地で細胞を再懸濁する。 </li><li>乾燥したPO /ラム/ FNプレートに10μlの液滴中の細胞をReplate。料理は、20〜30分間、室温で放置。 </li><li>慎重にN2/FGF2/EGF/Y-27632の20エルフテックスcmディッシュを追加します。 37℃でインキュベート 注：NC細胞は、比較的均質な前駆細胞集団として維持又は2週間まで拡張することができる。長い文化は、様々な子孫細胞型に分化するためにそれらをもたらす可能性がある。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することなく、競合する利害関係はありません。

ヒトES細胞/ hiPSCsからのR-NC細胞の正常な分化のために、次の点に注意して行ってください。これは、常に無菌培養条件の下で動作することが重要である。特に、この汚染が成功分化の妨げになることから、定期的にマイコプラズマ汚染のためHPSC培養をテストすることが重要ですが、容易にHPSC培養で視覚的に検出することができません。 R-NC分化が90〜100％の細胞密度で開始されるべきである;低い細胞密度、細胞生存およびR-NC分化の効率に影響を与える。これは、経験的に、効率的なNC分化を支援するための特定のKSRに、最適濃度および試薬の一部のロット番号を検証することが重要です。細胞が液滴中11日目に再播種される場合、10μlの液滴内の細胞密度が高くあるべきであり、最高の経験的に決定される。適切なロゼットとNC-形成は、液滴中の適切な細胞密度に依存します。私たちは、obserを経験的に細胞をAccutaseを用いた治療後に少なくとも二回洗浄されたときVEDは、細胞生存を増加させた。 FACSによるR-NC細胞の正常な分離のためにこのような染色染色していない、単一の抗体および二次抗体のみ染色された細胞などの適切な実験のコントロールは、非常に...

ヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）は、良好な動物モデルでも、一次組織のいずれもが利用可能なヒト疾患の研究および将来の治療のための、特に、巨大な可能性を示している。ヒトES細胞/ hiPSC技術の応用例としては、以下の通りである：特定の目的の細胞は無制限数量1で、再生医療のためのhESC / hiPSCsから生成することができます。細胞は、特定の疾患を有する患者から製造し、インビトロ疾患モデル2,3 に確立するために使用することができる。このような疾患モデルは、新しい薬剤化合物の探求4並びに有効性および毒性5のための既存の薬物の試験に大規模な薬物スクリーニングに用いることができる。 インビトロ疾患モデルは、新規な病気のメカニズムの同定につながる可能性がある。ヒトES細胞/ IPSC技術のすべてのアプリケーションに対して、特定と連携することが重要で、よく定義関心対象の疾患において影響d個の細胞タイプ。このように、固体で再現性のin vitroでの分化プロトコルの利用可能性は、ヒトES細胞/ hiPSC技術のすべてのアプリケーションのために重要である。プロトコルは、ヒトES細胞/ hiPSCラインと異なる研究者間の最小の変動、時間費用、労力、難しさやコストだけでなく、最大の再現性を示すことが望ましい。 神経冠（NC）細胞は、表皮と神経上皮間脊椎動物神経胚形成の間に出現する。それらは増殖し、胚全体に広範囲に移動し、骨/軟骨、頭蓋顔面骨格、感覚神経細胞、シュワン細胞、メラニン細胞、平滑筋細胞、腸、ニューロン、自律ニューロン、クロム親和細胞を含む、子孫細胞型の印象的な多様性を生じさせる、心臓中隔細胞、歯および副腎/甲状腺腺細胞6。このため、NC細胞が魅力的な、細胞幹細胞のフィールドの型とするために重要であるこのようなヒルシュスプルング病7、家族性自律神経失調症8などの疾患、ならびに神経芽細胞腫9のような種々の癌のモデル化。さらに、それらは、 インビトロでヒト胚発生の局面を研究する可能性を提供する。 現在利用可能な、広くhESCの10,11からNC細胞の誘導のためにインビトロで分化プロトコルにおいて適用分化の35日まで必要とし、例えば、MS5細胞などの間質フィーダー細胞上で神経誘導を伴い、従って、あまり明確でない条件下で行われる。それはNC細胞を大量に生成するためにアップスケールすることができるが、ハイスループット薬剤スクリーニング4に必要な、例えば、これは、手間とコスト集約的である。さらに、再現が困難であることができる、神経ロゼットの手動継代を伴うので、それはのhESCまたはhiPSCの多種多様に適用する場合、特に、全体的な変動を受けるライン。ここでは、フィーダー細胞を含まない18日間プロトコルにおけるNC細胞の段階的な導出を示す。このメソッドは、現在使用されているプロトコルよりも短く、より定義されています。さらに、異なるhiPSC系統のうちNC細胞を生成する際に非常に堅牢である。重要なのは、それが両方のプロトコルによって得られたNC細胞は、神経ロゼット（以下と呼ばれるロゼット-NCまたはR-NC）の境界に出現することが示されている。 2つのプロトコルのうちいずれかを使用して得られた細胞は、同じNCマーカーを発現し、マイクロアレイ解析で一緒にクラスター化、形態学的に同じに見える。新しいプロトコル（R-NC）を用いてNC由来細胞は、それらが移動し、さらに神経細胞に分化することができるように古いプロトコル（MS5-R-NC）を用いてNC由来細胞と同様の機能である。したがって、細胞は、MS5-R-NC細胞と併用して用いることができる。ヒトES細胞/ IPSCからNC細胞の誘導のために、R-NCセルプロトコルは、NC系統が関与するヒトES細胞/ IPSC技術のすべてのアプリケーションに有用である。&lt;/ pの&gt;

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>牛胎児血清 (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>ロットは試験すべき</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>ペニシンリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>MEM 最小必須アミノ酸溶液&nbsp;</td><td>ギブコ・ライフ・テクノロジーズ</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>毒性</td></tr><tr><td>組換えヒト FGF 基本 (FGF2)</td><td>R&Dシステム</td>ズ<td>233-FB-001MG / CF</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12パウダー&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>APOヒトトランスフェリン</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>ヒトインスリン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>プトリシン二塩酸塩</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>亜セレナイト</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L オルニチン臭化水素酸塩</td><td>Σ</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>マウス ラミニン-I</td><td>R&アンプ;D Systems</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩</td><td>Tocris-R&Dシステム</td><td>ズ1254</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R&Dシステム</td><td>ズ1614</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R&Dシステムズ</td><td>248-BD</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>R&D Systems</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>マウス組換えソニックヘッジホッグ (SHH)</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ464SH</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ギブコライフテクノロジー</td><td>ズ14170-112</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ギブコライフテクノロジー</td><td>ズ1563-080</td><td></td></tr><tr><td>ヒト組換えEGF</td><td>のR&Dシステム</td><td>236EG</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン(Mg / CaなしのPBS)</td><td>社内</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗体:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗HNK-1 / N-Cam(CD57)mIgM</td><td>シグマ</td><td>C6680-100TST</td><td>ロットをテストする必要があります</td></tr><tr><td>抗p75 mIgG1(神経成長因子受容体)</td><td>高度なターゲティングシステム</td><td>AB-N07</td><td>ロットは、</td></tr><tr><td>APCラット抗mIgM</td><td>BDをテストする必要がありますパルミンゲン</td><td>550676</td><td>ロットは、</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488ヤギ抗マウスIgG1&nbspをテストする必要があります。</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>ロットは試験する必要があります</td></tr><tr><td>抗Oct4 mIgG2b(1:200希釈で使用)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>ロットを試験する必要があります</td></tr><tr><td>材料/機器:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞(700万細胞/バイアル)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6105M</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿:10 cmおよび15 cmプレート、遠心チューブ、FACSチューブ、&nbsp;ピペット、ピペットtips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス血球計算盤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター (CO2, 湿度・温度制御)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>顕微鏡内蔵</td><td></td><td></td><td></td>細胞培養層流フード</tr><tr><td>細胞培養バイオセーフティフード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞選別機 i.e. MoFlo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1ml TB シリンジ 27Gx1/2</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter ポリエチレン</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は皿にヒト疾患をモデル化するためと病気や事故後の再生アプリケーション用の移植可能な細胞の供給源として、人間の胚発生を研究するための大きな可能性を秘めている。神経冠（NC）細胞は、末梢神経系およびグリア、メラノサイトおよび間葉細胞からの細胞などの成体の体細胞の多種多様のための前駆体である。彼らは、細胞運命の仕様および移行を含むヒト胚発生の側面を研究する細胞の貴重な情報源である。最終分化した細胞型へNC前駆細胞のさらなる分化は、 インビトロでのヒト疾患をモデル化する病気のメカニズムを調査し、再生医療用の細胞を生成する可能性を提供する。この記事ではhPSCsからNC細胞の誘導のために現在利用可能なin vitroでの分化プロトコルの適応を提示します。この新しいプロトコルは、diffeの18日間を必要とするrentiationは、フィーダーを含まない、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）ラインだけでなく、人間の人工多能性幹細胞（hiPSC）ラインのうち、容易に拡張性の高い再現性がある。新旧両方のプロトコルが同じアイデンティティのNC細胞を得る。

MS5-R-NCプロトコル11上のR-NCプロトコルの二つの最も重要な改善は、フィーダーを含まない、定義された分化条 ​​件と時間の要件の全体的な短縮である。 MS5フィーダー細胞13は hESCの14から神経分化を支持することが示されているマウス骨髄由来間質細胞である。 hESCを従って、初期のヒト神経発生を模倣する、NC細胞を、10現れるそれらの周囲に、低密度フォーム上皮構造及び神経ロゼット15でMS5フィーダー細胞上で培養した。しかし、MS5フィーダー細胞から放出されるシグナル伝達分子とどのような成長因子は明らかではない。したがって、分化条件はあまりことが困難再発性実験及びHPSC線を横切って、それらを再生すること、定義されている。適切な神経誘導のために、ヒトES細胞は、MS5フィーダー細胞上に小さなコロニーに低密度で播種しなければ合併症を持っているティンスケールアップし、分化した細胞の高収量に達した。 2009年には、この方法は非常に効率的に12を hPSCsをneuralizingことを目的とし...

神経堤ヒト多能性幹細胞に由来する（NC）細胞（HPSC）は、ヒトの発生および疾患をモデル化し、細胞置換療法のための大きな可能性を有する。ここでは、現在広く使用されているのフィーダーフリー適応<em&gt; in vitroで</em&gt; hPSCsからNC細胞の誘導のための分化プロトコルが提示される。

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

この手順の全体的な目的は、短期間で再現性があり、定義されたプロトコルを用いて、ヒト多能性幹細胞から神経堤前駆細胞を生成することです。これらの細胞は、in vitroでの神経堤関連疾患の研究や、これらの細胞をさらに分化させて子孫細胞を得るために利用できます。これはまず、マトリゲル上の単層に高密度のヒト多能性幹細胞を播種することによって達成されます。第2段階では、主要なシグナル伝達経路に影響を与える低分子化合物の規定の配列と組み合わせを用いて、細胞を神経上皮細胞へと分化させます。次に、神経上皮細胞を再播種し、さらに神経堤前駆細胞へと分化させます。最終段階では、蛍光活性化細胞分取法を用いて神経堤細胞を単離します。最終的に、免疫蛍光染色や、細胞の遊走能などの機能解析を用いて、適切な神経堤細胞が生成されたことを確認します。ヒト多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導するための既存のプロトコールに対する本手法の主な利点は、期間が短いことです。わずか18日間で完了します。MS5フィーダー細胞を使用しないため、再現性が向上しています。スケールアップが容易であり、ヒト多能性幹細胞株間での再現性も非常に高いです。本手法の意義は、神経系 lineage に関連するヒト疾患のメカニズム研究にまで及び、これらの疾患におけるより詳細な in vitro モデリングおよび薬剤スクリーニングを改善する可能性を示しています。本プロトコルを開始する前に、ヒト多能性幹細胞のコロニーが肉眼で確認できる大きさであり、かつ境界部に分化細胞が少なく、エッジが鮮明であることを確認してください。その後、hPSCを継代する準備ができたら、培地を吸引し、1×PBSで1回洗浄します。次に、0.05% Trypsin-EDTAを4 mL加え、ディッシュを水平方向に2分間激しく振ります。顕微鏡下でマウス胚性線維芽細胞が単一細胞としてプレートから剥離したことを確認してください。HPSCコロニーはコロニーとしてディッシュに付着したままになります。その後、すぐにトリプシンを完全に吸引し、プレートを室温で2〜4分間放置します。プレートにHES培地を2 mL加え、P 1000ピペットを用いて細胞を剥離させます。細胞が容易に剥がれない場合は、プレートをさらに2〜3分間インキュベートしてください。室温で、細胞懸濁液を10 µMのY 2 7 6 3 2 dihydrochlorideを添加した8 mLのHES培地を含む15 mLコニカルチューブに回収します。次に、あらかじめ処理しておいた10 cmディッシュからマトリゲルを吸引除去し、細胞を1:1または1:2の比率でマトリゲル処理済みのプレートに播種します。細胞を37 °C、5% CO2インキュベーター内で一晩培養します。分化準備が整うまで、細胞にHES培地を毎日添加します。その後、細胞が90%から100%コンフルエントになった時点で神経分化を開始します。この日を0日目とします。0日目から3日目まで、0.1 µM LDN-193189および10 µM SB 431542を含むKSR分化培地10 mLを毎日細胞に添加します。次に、4日目と5日目は、75% KSR分化培地、25% 培地2、0.1 µM LDN-193189、および10 µM SB 431542を含む培地10 mLを細胞に添加します。6日目と7日目は、50% KSR分化培地と50% 培地2に、0.1 µM LDN-193189および10 µM SB 431542を添加して調整した培地を細胞に添加します。8日目から9日目にかけて、0.1 µM LDN 193189および10 µM SB 431542を含む25% KSR分化培地と75% N2分化培地で細胞を nuôi 養します。続いて9日目と10日目に、テキストプロトコルに記載されている通り、11日目の細胞再播種に使用するポリ-L-オルニチン、ラミニン1、およびフィブロネクチンでコートした培養皿を準備します。11日目に、0.1 µM LDN 193189および10 µM SB 431542を添加したN2分化培地で細胞を nuôi 養します。11日目に、あらかじめ準備した培養皿からラミニン1およびフィブロネクチン溶液を吸引し、組織培養フード内で20〜30分間、室温で乾燥させます。次に、分化中の細胞から培地を除去し、1xPBSで細胞を1回洗浄します。その後、10 cmプレートにそれぞれ8 mLのAccutaseを加え、37 °Cで20分間インキュベートします。インキュベート後、セルリフターを用いて細胞を剥離させ、Accutase溶液中で細胞を再懸濁します。5 mL ピペットを用いて、細胞懸濁液を 15 mL コニカルチューブに移します。次に、1x PBS を 5 mL チューブに加え、115 ×g で 5 分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを 10 mL の 1x PBS で再懸濁します。その後、細胞懸濁液を 40 µm のセルストレーナーでろ過し、単一細胞懸濁液であることを確認します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。再び115 Gsで5分間遠心分離し、添加剤入りN2分化培地10 µLあたり100,000～150,000個の濃度に細胞を再懸濁します。リピーターピペットを使用し、ポリL-オルニチンで前処理した15 cm培養皿に、細胞懸濁液を10 µLずつ滴下して播種します。ラミニン1およびフィブロネクチン。液滴を室温で15〜20分間静置します。その後、液滴を乱さないように、添加物入りのN2分化培地 30 milliliters をプレートに非常に慎重に加えます。細胞を5%二酸化炭素インキュベーター内で37 °Cで一晩インキュベートします。12日目に、200 µMのアスコルビン酸、20 ng/mLの脳由来神経栄養因子（BDNF）、100 ng/mLの線維芽細胞増殖因子8（FGF8）、および20 ng/mLのソニックヘッジホッグ（Shh）を含むN2分化培地を、15 cmディッシュあたり20 mLずつ慎重に添加します。その後、14日目から17日目まで、200 µM のレチノイン酸、20 ng/mL の脳由来神経栄養因子（BDNF）、および 100 ng/mL の線維芽細胞増殖因子8（FGF8）のみを含む N2 分化培地を用いて、2〜3日ごとに細胞に給餌します。16日目と17日目に、神経堤細胞の再播種に使用する poly-L-ornithine、laminin 1、および fibronectin でコーティングしたプレートを準備します。18日目にFACS解析を行い、蛍光活性化細胞分取により細胞を分取した後、神経堤細胞を計数し、115 Gsで5分間遠心分離します。得られた細胞ペレットを、10 ng/mLを添加したN2分化培地で再懸濁してください。FGF2 20 ng/mL、EGF、および10 µM Y 2 7 6 3 2 二塩酸塩を含む細胞懸濁液を、30,000 cells/10 µLの濃度で調製します。あらかじめpoly-L-lysine、laminin 1、およびfibronectinでコートし、十分に乾燥させた培養皿を用意します。次に、10 cmディッシュ1枚あたり、この細胞懸濁液を約50〜70滴分播種します。ドロップレットを乱さないように、10 cmディッシュそれぞれに、10 ng/mL FGF2、20 ng/mL EGF、および10 µM Y 27632 dihydrochlorideを添加したN2分化培地20 mLを加え、室温で15～20分間インキュベートします。その後、5%二酸化炭素インキュベーターを用いて、細胞を37 °Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、付属のテキストプロトコルに従って神経堤細胞を維持および継代します。この新しいフィーダーフリーin vitro分化プロトコルを用いることで、ヒト多能性幹細胞から18日間で神経堤細胞を誘導しました。18日目の FACS 解析により、HNK-1 と p75 の両方に陽性である細胞が同定され、神経堤細胞の存在が確認されました。フィーダーフリー分化プロトコルとフィーダー細胞依存的プロトコルのいずれにおいても、神経堤細胞は神経ロゼット段階を経由しました。さらに、 FACS ソートされた細胞は同一の形態を示し、神経堤マーカーである HNK-1 と p75 を発現していました。これら 2 つの分化プロトコルから誘導された神経堤細胞の全遺伝子発現を比較したところ、両方の細胞群が互いに近接してクラスターを形成することが判明しました。フィーダーフリープロトコルを用いて誘導した神経堤細胞の遊走能を解析した結果、48時間後に細胞がスクラッチ内へ正常に遊走することが示されました。また、さらに4日間の分化誘導を行った後、mash oneおよびtouch oneに対する陽性染色が確認されたことから、これらの細胞は自律神経系細胞へと分化する能力を持つことが明らかになりました。このビデオを視聴することで、ヒト多能性幹細胞を神経分化させ、in vitroで神経堤前駆細胞を誘導する方法について十分に理解できるはずです。

feeder-free-derivation-neural-crest-progenitor-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

in vitroで神経堤幹細胞（NCSC）を育成するために、特殊な培地（NCSCM）が必要です。...

マウス神経堤幹細胞の培養のためのニワトリ胚抽出物の製造

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

神経管から胚の神経堤の分離の使用を容易に...

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。...

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。...

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

この作品は、神経堤を介したヒト多能性幹細胞から色素沈着し、成熟したメラノサイトを生成し、無フィーダー、25日のプロトコルを使用して中間段階のメラノブラストするためのin vitroでの分化プロトコルを記述します。...

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。...

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

本プロトコルでは、ヒト多能性幹細胞からの神経節後交感神経ニューロンの生成に対する安定した、高効率な分化戦略を説明する。このモデルは、複数の自律神経障害の研究の使用のためにニューロンを利用可能にします.

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

マウス胚性幹細胞から脳神経堤細胞を作製するための再現性のあるサイズのニューロスフェアを生成するための三次元(3D) in vitro...

多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル

学ぶヒト多能性幹細胞から神経堤前駆細胞をフィーダーフリーで導出する方法。小分子を用いた18日間の再現性の高いプロトコルにより、神経堤関連疾患の研究や細胞置換療法への応用が可能となる。

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

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